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EVALUACIÓN DE FITOTOXICIDAD Y CITOTOXICIDAD DEL GLIFOSOL
MEDIANTE ALLIUM TEST
SERGIO CAMILO CERÓN RIASCOS
GERMÁN ALBERTO MORERA
CORPORACIÓN UNIVERSITARIA AUTÓNOMA DEL CAUCA
FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y DESARROLLO SOSTENIBLE
PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA
POPAYÁN
EVALUACIÓN DE FITOTOXICIDAD Y CITOTOXICIDAD DEL GLIFOSOL
MEDIANTE ALLIUM TEST
NOTA DE ACEPTACIÓN.
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Firma del director
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Firma del Jurado
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Firma del Jurado
REVISADO Y
APROBADO 2021
Este trabajo titulado “EVALUACIÓN DE
FITOTOXICIDAD Y CITOTOXICIDAD DEL
GLIFOSOL MEDIANTE ALLIUM TEST” realizado
por los estudiantes Sergio Camilo Cerón Riascos y
Germán Alberto Morera, es aprobado en
cumplimiento de los requisitos exigidos por la
Corporación Universitaria Autónoma del Cauca
para optar por el título profesional de Ingenieros
Ambientales y Sanitarios.
AGRADECIMIENTOS
Gracias a Dios por permitirnos llegar a esta etapa de la vida y por darnos la fuerza
necesaria para poder culminar este trabajo a pesar de todos y cada uno de los
inconvenientes presentados a lo largo del proceso.
A la corporación Universitaria Autónoma del Cauca por permitir que mediante el
conocimiento adquirido durante la carrera podamos ser profesionales en Ingeniería
Ambiental y Sanitaria con un desarrollo humanístico y emprendedor, siempre
buscando el bienestar del ambiente para los demás.
A nuestra directora y asesora Mg. Bióloga. Diana Milena Muñoz Solarte por su
apoyo, dedicación, comprensión, conocimiento, paciencia y experiencia ha logrado
en nosotros que podamos terminar nuestros estudios con éxito.
A todos nuestros familiares quienes han sido la mayor motivación y nos han
brindado sus apoyos incondicionales para el desarrollo de este proyecto.
A nuestros profesores solo nos queda agradecerles porque nos aportaron un granito
de arena en nuestra formación, gracias por sus consejos, sus enseñanzas y sobre
todo por su amistad.
TABLA DE CONTENIDO
Imagen 5 Fases mitóticas de células Meristemáticas de Allium cepa de la
- CAPITULO I: PROBLEMA
- 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.......................................................
- 1.2 JUSTIFICACIÓN...........................................................................................
- 1.3 OBJETIVOS..................................................................................................
- 1.3.1 OBJETIVO GENERAL............................................................................
- 1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................
- CAPITULO II: MARCO REFERENCIAL
- 2.1 ANTECEDENTES.........................................................................................
- 2.2 BASES TEORICAS.......................................................................................
- Glifosol (glifosato)............................................................................................
- Ensayos biológicos para determinar toxicidad de compuestos químicos........
- Beneficios del bioensayo Allium test................................................................
- 2.3 MARCO NORMATIVO..................................................................................
- NORMAS MAS IMPORTANTES.....................................................................
- CAPITULO III: METODOLOGIA
- 3.1 Diseño experimental.....................................................................................
- Criterios para Allium test..................................................................................
- media y baja del Glifosol en Allium cepa 3.1.1 Establecimiento de la concentración letal CL 50 y concentraciones Alta,
- 3.1.2 Análisis de datos.....................................................................................
- 3.2 Determinación del efecto fitotóxico de Glifosol en raíces de Allium cepa
- Criterio de selección de bulbos...........................................................................
- raíz de Allium cepa , mediante el índice mitótico IM............................................ 3.3 Determinación del efecto citotóxico del Glifosol en células meristemáticas de
- Imagen 2 Crecimiento de raíces durante 72 horas de exposición..........................
- Imagen 3 División celular en concentración control...............................................
- Imagen 4 División celular de la concentración 1,25 mg/l (Muy alta).......................
- concentración control.............................................................................................
- Imagen 6 Células en división.................................................................................
- Imagen 7 Células en división.................................................................................
- Imagen 8 Evidencia del conteo celular mediante la aplicación Leica air lab..........
- Imagen 9 Alteraciones celulares encontradas........................................................
- Ecuación 1 Índice Mitótico (IM).............................................................................. LISTA DE ECUACIONES
RESUMEN
En Colombia, el uso de herbicidas es empleado en los sistemas agrícolas gracias a
la extensa variedad de usos los cuales se hallan registrados para controlar malezas
en variedad de cultivos, el problema de estas sustancias son que se acumulan y
permanecen en el medio ambiente, generando peligro para los ecosistemas y la salud de
la población humana. El presente trabajo aborda esta problemática con la ayuda de
una de las especies vegetales más usadas para la detección de diferentes tipos de
cambios celulares causados por sustancias químicas que es Allium cepa. El objetivo
de este estudio es evaluar la fitotoxicidad y la citotoxicidad in vitro del Glifosol en
células meristemáticas de Allium cepa , nuestra metodología se basa en la
preparación de cuatro soluciones de Glifosol a diferentes concentraciones más una
solución control con tres réplicas para cada tratamiento dando un total de 15
muestras; Se establecieron las concentraciones a partir de una solución madre
diluida ya que al tomar directamente de la concentración se inhibía total mente el
crecimiento de las raíces, se diluyeron en un recipiente de 200ml de agua destilada
1,25 micras de glifosol y de esta solución salieron las siguientes concentraciones
utilizadas, muy alta (1,25mL), alta (1,0mL), media (0,5mL) y baja (0,25mL), al tener
las concentraciones a utilizar se colocan a exposición la Allium cepa con su
respectiva solución, se midió el crecimiento de las raíces durante 24,48 y 72 horas,
se cortaron los ápices de la raíz, posteriormente fueron teñidos con Orceina-acetica
y se observaron al microscopio a 40 y 100x; se calculó el índice mitótico (IM) y se
observaron las anomalías celulares (cromosómicas). La letal CL 50 se calculó por
medio de un método estadístico llamado Probit, un método gráfico que permite
observar los porcentajes de mortalidad en función del logaritmo de las dosis
aplicadas. Se concluye que El Glifosol en todas sus concentraciones muestra un
evidente efecto inhibitorio sobre el crecimiento radicular y el índice mitótico en el
modelo de Allium cepa.
PALABRAS CLAVES : Herbicidas, Glifosol, Allium test, Concentración letal, Índice
mitótico, anomalías celulares, fitotoxicidad, citotoxicidad, Células meristemáticas.
ABSTRACT
investigaciones en cuanto al uso de sustancias químicas en cultivos agrícolas y que
sea tenido en cuenta para generar estrategias encaminadas a la prevención y
manejo seguro de los agroquímicos en zonas rurales.
CAPÍTULO I: PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los herbicidas constituyen un amplio grupo de productos químicos, los cuales a
nivel mundial han estado presente de manera industrial desde la segunda guerra
mundial, provocando un mejor desempeño en la producción y una rentabilidad
considerable al no utilizar mano de trabajo para la limpieza de los cultivos de las
malas hierbas, al pasar los años estos productos químicos han cambiado de tal
forma que solo atacan las malas hierbas y no al cultivo de producción, sin embargo
se desconocen efectos adversos sobre la población humana y el ecosistema [1].
Colombia al ser un gran productor agrícola no se ve exento del uso de herbicidas en
múltiples áreas de las actividades agrícolas, además un factor clave para el uso de
herbicidas en el país son los cultivos ilícitos los cuales presentan una mayor
demanda a su uso [2]. Estos herbicidas se acumulan y permanecen en el medio
ambiente, generando peligro para los ecosistemas y la salud de la población
humana. Los efectos de los herbicidas dependen del tipo, pero los estudios más
actuales aseguran que a pesar de que provocan un desequilibrio inicial en la
actividad biológica del suelo, éste se recupera con el tiempo, así como las dosis
utilizadas son el verdadero problema del uso de estos compuestos [3].
El Glifosol es un herbicida no selectivo de acción sistémica con amplio espectro de
acción, el cual es muy utilizado en los cultivos de papa y otros sectores agrícolas, si
se tiene en cuenta que la mano de obra utilizada para la eliminación de malezas es
mayor con respecto a la utilización del herbicida resultando eficiente y económico
para el control de malezas [4].
Con este panorama, es necesario y pertinente la realización de bioensayos con los
que se pueda evaluar el efecto de sustancias químicas que por su toxicidad pueden
llegar a afectar a especies animales como vegetales, por este motivo es viable la
aplicación de la prueba de Allium test el cual es un método rápido, sensible y
eficiente para determinar el efecto de una sustancia química presente en el
ambiente, además los factores a analizar son empleados como modelos de ensayo
in vivo utilizados para determinar el daño producido por sustancias[5].
Teniendo en cuenta la problemática que se presenta por el uso indiscriminado de
glifosato como erradicador de malezas, se pretende que con la realización de este
estudio se obtengan resultados que sean la base para aportar a los estudios
científicos sobre el efecto del glifosato en sistemas biológicos, de ésta manera al ser
publicados en revista científica puedan ser tenidos en cuenta por las entidades que
vigilan la salud y el ambiente, para la creación de programas orientados a la
prevención y manejo seguro de sustancias químicas en la labor agrícola, así se
lograría mejorar la calidad de vida de las comunidades rurales.
1.2 JUSTIFICACIÓN
En la actualidad la contaminación de los ecosistemas se ha incrementado de
manera alarmante debido al uso de herbicidas de forma indiscriminada. Asociados a
estos se encuentran contaminantes cuya presencia en el medio receptor puede
ocasionar problemas de toxicidad tanto a plantas como animales y por eso es
necesario el estudio del efecto de estas sustancias en organismos vegetales [6].
En Colombia, el glifosato es empleado en los sistemas agrícolas debido a la gran
variedad de usos los cuales se encuentran registrados para el control de malezas en
diversidad de cultivos. De igual manera en el año 2000 fue autorizada la fumigación
aérea con glifosato por medio del programa de erradicación como medida de
mitigación para el incremento en el número de cultivos ilícitos, ya con la resolución
1214 de 2015 se suspendieron las aspersiones acatando las alertas de la OMS
sobre los efectos nocivos de este producto [2]. Es importante resaltar que en la
búsqueda bibliográfica son pocas las investigaciones que justifiquen la prohibición
para el uso agrícola de este herbicida a nivel nacional, ya que sigue siendo un
producto de venta libre en el mercado y que representa el 40% de la industria
agroquímica a nivel mundial, a pesar de que la OMS lo ha catalogado como
potencialmente cancerígeno [7].
Teniendo en cuenta lo anterior es pertinente, la realización de una evaluación en
cuanto a la citotoxicidad y fitotoxicidad del glifosato (en este caso Glifosol), mediante
la prueba de Allium Test ya que la mayoría de las investigaciones realizadas por
muchos autores concuerdan en que los bioensayos son factibles y confiables para
pruebas de detección rápida y efectos sobre las células de productos químicos
relacionados con mutagenicidad, efectos citotóxicos y aberración cromosómica,
además la especie Allium cepa L. ha demostrado ser eficaz, altamente sensible y
menos costosa, utilizado para las potenciales pruebas, tanto en los procesos
celulares mitóticos como meióticos [8].
Con este estudio se pretende realizar un aporte científico en toxicología ambiental
sobre los efectos del Glifosol en células de un organismo vegetal, con el fin de
determinar si existe daño celular o inhibición de las fases mitóticas al interior de
células de Allium cepa, de igual manera describir el grado del efecto tóxico que este
compuesto químico tiene sobre el crecimiento radicular de las mismas. Se espera
con concentraciones controladas del contaminante, se tiene conocimiento del
empleo de Allium test para evaluación de aguas contaminadas a nivel nacional e
internacional con otro tipo de sustancias. Algunos de estos estudios se evidencian
en la tabla 1.
Tabla 1: Antecedentes
Tema o Titulo Objetivos Métodos Resultados Conclusiones y Recomendaciones
R
ef e r e n ci a Evaluación de la calidad ambiental del arroyo Caañabe mediante pruebas microbiológicas y ecotoxicológicas. Realizar diagnóstico de condiciones ambientales, mediante parámetros ecotoxicológicos. Se realizaron ensayos de toxicidad crónicos en Tetradesmuswisconsinenesis, D. rerio y Allium cepa. El índice de calidad de agua (ICA) arrojó valores comprendidos entre 52 y 62 lo que otorga la clasificación de “regular”; Los ensayos crónicos en A. cepa y el test de micronúcleos en D. rerioindican potenciales efectos citotóxicos y genotóxicos de las aguas del Arroyo Caañabe.
[10]
Citotoxicidad y genotoxicidad en células humanas expuestas in vitro a glifosato. Evaluar la citotoxicidad y la genotoxicidad del glifosato en células humanas normales y en células fibrosarcoma. La citotoxicidad aguda y crónica se determinó al exponiendo células en cultivo a diferentes concentraciones de glifosato, y se analizó la viabilidad celular con cristal violeta y colorante de exclusión azul de tripano. En la citotoxicidad crónica y aguda presentó un efecto dependiente de la dosis y una viabilidad mayor al 80%. Se evidenció daño en el ADN después del tratamiento con glifosato. Se sugiere que el mecanismo de acción del glifosato no se limita únicamente a las plantas, sino que puede alterar la estructura del ADN en otros tipos de células como son las de los mamíferos.
[11]
Utilización de bioensayos para la determinación de contaminantes en agua de riego en la cuenca del río Granobles Determinar el nivel de toxicidad mediante bioensayos. Se utilizan soluciones de sulfato de cobre para el caso de la cebolla. Se realizaron seis repeticiones para cada bioensayo y controles positivos. Después, se procede a medir la longitud de las raíces de los bulbos en cada disolución y de los controles. Se utilizaron de 15 a 20ml de solución de Cu+ para el caso de la cebolla, en las diferentes concentraciones, más los controles. En Allium cepa, las raicillas deben mantenerse siempre húmedas, este control se realiza con un intervalo mínimo de 2 horas.
[12]
Aplicación de bioensayos con bulbos de cebolla (Allium Cepa) en la determinación del grado de toxicidad del agua y su aplicación en comunidades. Determinar el nivel de toxicidad del agua, y su aplicación en 2 comunidades de la Cuenca del Río Granobles. La primera fase del estudio se optimiza la producción de bulbos de cebolla. La segunda fase identificar y cuantificar la sensibilidad mediante la inhibición del crecimiento radicular de los bulbos de cebolla tratados con agroquímicos. Implementación, se realizaron talleres teórico - prácticos sobre el manejo de bioensayos y su aplicación con la participación de la comunidad. El uso de técnicas simplificadas de detección de la contaminación del agua puede considerarse una herramienta muy útil, en sistemas más complejos de monitoreo de contaminación de pesticidas.
[13]
Efecto protector del aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown sobre la toxicidad del mercurocromo en raíces de Allium cepa L_._ Evaluar el efecto protector del aceite esencial obtenido de tallos y hojas frescas de L. alba sobre la toxicidad del mercurocromo en raíces de A. cepa. Los parámetros evaluados fueron alteración del índice mitótico, inhibición del crecimiento radicular e inducción de aberraciones cromosómicas en ausencia y presencia del aceite esencial. El mercurocromo mostró efecto tóxico sobre las células meristemáticas de A. cepa. El aceite produjo un efecto protector en la disminución de aberraciones cromosómica. Los datos presentados en esta investigación mostraron que disminuyó la aparición de aberraciones cromosómicas y cambios morfológicos.
[14]
Genotoxicidad de las nanopartículas de dióxido de titanio y activación de mecanismos de defensa en Allium cepa Evaluar el potencial tóxico de los NP de TiO 2 en plantas superiores de prueba de A. cepa. Se sometieron a germinación cien semillas de A. cepa con las suspensiones de TiO 2 , agua ultra pura como control negativo pruebas de cito y genotoxicidad. Mostraron una reducción significativa tanto en la tasa de germinación como en el desarrollo de la raíz y en las células meristemáticas. Se demostró que A. cepa es sensible a los efectos genotóxicos y citotóxicos de los NP de TiO 2, lo que es indicativo de su internalización.
[15]
Prueba de Allium cepa: una evaluación de genotoxicidad Describir aberraciones cromosómicas en las células de la raíz de la cebolla (Allium cepa L.). Recolección del material vegetal ( Allium cepa) y se les realizo una adecuada limpieza; cuarto método es la maceración de las puntas de las raíces y la preparación para microscopia donde se cortaron las puntas de las raíces y se pusieron a un flameo en vidrio reloj con ácido acético. Se observó un crecimiento máximo de la raíz y no se encontraron deformidades morfológicas. La indicación de aberración cromosómica y mitótica en las células de la punta de la raíz sugiere genotoxicidad. [16] Evaluación de genotoxicidad por ensayo de micronúcleos in vitro y por prueba de Allium cepa in vivo. Evaluar el potencial toxico in vitro e in vivo de pequeñas moléculas bioactivas. Seleccionar las cebollas, después se debe hacer una limpieza y quitar el material seco, colocar en tubos de ensayo la solución de metalodrug a diferentes concentraciones, escoger las raíces y obtener la punta se le realiza una fijación con ácido acético para ser llevado al microscopio. Se observan aberraciones cromosómicas (CA) en las diferentes fases de la división célula. Allium cepa en las que se muestran profase, anafase, metafase, telofase, aberraciones cromosómicas, anormalidades nucleares y micronúcleos normales.
[17]
sustancia o solución de interés sobre el crecimiento de las raíces y sobre el ADN
vegetal. Es ventajoso el uso del Allium cepa test por emplearse como indicador una
planta vascular, que permite configurar un modelo excelente para realizar ensayos
sobre sustancias contaminantes, mutagénicas y cancerígenas cuyos datos pueden
ser extrapolados a toda la biodiversidad de plantas y animales.
2.2 BASES TEÓRICAS
Glifosol (glifosato)
A continuación, en la tabla 2 se presenta información general respecto a
información, composición y propiedades físicas del glifosol
Tabla 2: Generalidades del Glifosol
COMPOSICIÓN / INFORMACIÓN
PROPIEDADES FÍSICAS Y
QUÍMICAS
Ingrediente Activo: Glifosato ASPECTO:
Líquido
amarillo
Concentración: 480 g/L OLOR: inodoro
Nombre químico:
N-
(phosphonometh
yl) glycine, en
forma de sal
isopropilamina
PUNTO DE
EBULLICIÓN: No aplica
Tipo de Formulación:
Concentrado
Soluble- SL
PRESIÓN DE
VAPOR: No aplica
Grupo químico:
Soluble- SL
Grupo químico:
G
SOLUBILIDAD EN
AGUA:
Totalment
e soluble
Categoría Toxicológica:
II –
Moderadamente
Peligroso pH: 4,4-4,
El Glifosato compuesto base del Glifosol, es una sal isopropilamina de N-
(fosfonemetil) glicina, con un peso molecular de 228,18 g/mol, el cual es un
herbicida no selectivo, sistémico de acción foliar, es decir, que ingresa a la planta a
través de las hojas para después migrar a otras partes del tejido vegetal donde será
mínimamente metabolizado [5]. El mecanismo de acción del glifosato es por medio
de la inhibición de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en las plantas
(triptófano, fenilalanina y tirosina) mediante la inhibición de la enzima 5-
enolpiruvilshikimato-3-fosfato-sintetasa (EPSPS), con lo que se reduce la
producción de proteína y el desarrollo de la misma [5].
El uso de herbicidas basados en glifosato como por ejemplo Roundup, o Glifosol,
entre otros, afecta la calidad del agua y a organismos no considerados, modificando
con esto la estructura y funcionalidad de ecosistemas acuáticos [5].
Estas afecciones incluyen retardo en el crecimiento de organismos como algas y
peces, inhibición de la eclosión en erizos, cambios histopatológicos en branquias de
tilapia como proliferación de células filamentosas e hiperplasia celular,
vacuolización de hepatocitos y picnosis nuclear en hígado y en riñón, dilatación del
espacio de Bowman y acumulación de gotas de hialina en las células del epitelio
tubular de tilapia, alteraciones de parámetros enzimáticos como acetilcolinesterasa,
butirilcolinesterasa, carboxilesterasa y glutatión S-transferasa (GST) en R.
arenarum , alteración de la actividad sexual y de transaminasas en peces (TGO,
TGP), así como distorsiones metabólicas, hematológicas y bioquímicas de algunos
órganos y constituyentes de tejidos como lípidos totales, glucosa, entre otros.
Dichas alteraciones dependen de la especie u organismo, tipo de compuesto, la
concentración de glifosato en agua y el tiempo de exposición [5].
2.3 Ensayos biológicos para determinar toxicidad de compuestos químicos
La importancia de los bioensayos radica en la relevancia que son técnicas de rápida
evaluación a efectos tóxicos agudos o crónicos tanto de sustancias químicas
conocidas como de muestras ambientales de composición incierta. Estas pruebas
de toxicidad tienen como objetivo medir el efecto de uno o más contaminantes sobre
las especies y consiste en la exposición de los organismos de ensayo a
concentraciones crecientes de un agente tóxico con el objetivo de determinar algún
cambio en éstos en un cierto período de tiempo [23].
2.4 Beneficios del bioensayo Allium test
El método Allium incluye parámetros sugeridos para el uso estándar de análisis
resultados de varias áreas de aplicación y comparaciones con una serie de otros
sistemas de prueba como la obtención de valores de Efecto-Concentración para la
creación de curvas de tiempo. La prueba de Allium es una prueba a corto plazo con
muchas ventajas: bajo costo, fácil manejo, buenas condiciones cromosómicas para
el estudio del daño cromosómico o la alteración de la división, por lo tanto, los
resultados en la prueba de Allium deben considerarse como una advertencia y
también como una indicación de que algún producto químico probado puede ser un
riesgo para la salud humana y para nuestro medio ambiente [24]. Este bioensayo
permite establecer Índices de diferentes fases de la mitosis e índice de división
