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Preparación de soluciones y medios de cultivo para el diagnóstico de bacterias fitopatógenas
Fecha de emisión: 2013-11-
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1. Propósito y Alcance
1.1 Propósito
La elaboración de medios de cultivo se realiza para otorgar el crecimiento y características bacterianas que nos ayudan a determinarlas. Las soluciones son para las reacciones bioquímicas, que nos indican una susceptibilidad a algún componente específico de la solución en la bacteria sospechosa.
1.2 Alcance
Inicia si la muestra es considerada para pruebas bioquímicas a través de la definición de que medio(s) y/o solución(es) se prepararan, de acuerdo al hospedante sospechoso y sintomatología de la muestra, hasta su uso y almacenamiento.
2. Responsables
Personal responsable del cumplimiento de este documento
Puesto Departamento
Jefe de laboratorio Laboratorio
Coordinador de laboratorio Laboratorio
Signatario aprobado Laboratorio
Técnico laboratorista Laboratorio
Ingeniero de gestión de la calidad Gestión de la calidad
3. Procedimiento
3.1 Descripción:
Las bacterias como todo organismo requieren de nutrientes. Es por ello que los medios in Vitro proporcionan los requerimientos nutricionales que permiten la reproducción de las bacterias los cuales se conocen como medios de cultivo, estos contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y nitrógeno, minerales y vitaminas. Los medio de cultivo, se clasifican en cuanto a su consistencia, pueden ser líquidos, sólidos y semisólidos. Cada medio de cultivo tiene una función respecto a sus nutrientes, por ejemplo: aislamiento, diferenciales, selectivos e inhibitorios, caracterización. Los medios se deben de realizar en ambientes totalmente estériles. Es importante mencionar que siempre se debe de contar con medios selectivos. Generalmente los medios de cultivos tienen el mismo método de preparación como se describe en los puntos siguientes. En cuanto a las soluciones son mezclas homogéneas de dos o más sustancias. La sustancia disuelta se denomina soluto y está presente generalmente en pequeña cantidad en comparación con la sustancia donde se disuelve denominada solvente.
3.2 Instructivo de trabajo:
Paso No.
Qué/Cómo Recurso/ Equipo
Evidencia de rastreabilidad
Especificación Responsable
3.2.1 Elaboración de medios de cultivo (^) Hay diferencias entre la elaboración de un medio y otro. Estas se especifican en el punto 3. Ejemplo: la medición del pH.
NA
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Paso No.
Qué/Cómo Recurso/ Equipo
Evidencia de rastreabilidad
Especificación Responsable
3.2.1.1 Se pesan los reactivos en balanza analítica o semianalítica y se mide el agua de acuerdo al volumen a preparar.
IN-LB-
IN-LB-
IN-LB-
BI-LB-12 Considerar que se debe prepara el volumen que se vaya a utilizar.
Técnico Laboratorista y Signatario Aprobado 3.2.1.2 Adicionar los reactivos al matraz y posteriormente el agua destilada junto con un magneto de agitación para preparar la mezcla, posteriormente se tapa con algodón y papel aluminio.
NA NA Las dimensiones del matraz deben de ser el doble de la cantidad a preparar.
Técnico Laboratorista y Signatario Aprobado
3.2.1.3 Se coloca el medio preparado en la placa de agitación para disolverse.
NA NA Mezclar hasta disolver.
Técnico Laboratorista y Signatario Aprobado 3.2.1.4 Se esteriliza en autoclave (125 ºC, 20 Lb por 15 minutos), se deja enfriar durante aproximadamente 20 minutos para vaciar en las cajas de Petri bajo condiciones estériles, utilizando la campana de flujo laminar.
IN-LB-
IN-LB-
BI-LB-12 Se adiciona aproximadamente 15 ml en cada caja.
Técnico Laboratorista y Signatario Aprobado
3.2.1.5 Se deja reposar hasta que el medio solidifique por aproximadamente 2 horas y se colocan en forma invertida dentro del empaque original de las cajas de Petri.
NA NA NA Técnico Laboratorista y Signatario Aprobado 3.2.1.6 Etiquetar el lote con el código e información necesaria. Colocando la etiqueta por fuera de la bolsa que contiene dicho lote, se almacenan en el refrigerador de reactivos.
NA NA Código: con la(s) inicial(es) del medio, numero consecutivo, diagonal e inicial del área ejemplo: BK001/B Información: Fechas de elaboración y caducidad (1 mes). Nombre de responsable
Técnico Laboratorista y Signatario Aprobado
3.2.1.7 Inmediatamente se realiza un control de calidad de cada lote tomando una caja de éste y colocándolo en la incubadora VWR o FELISA. Programando la temperatura a 28°C durante 24 horas, posteriormente se hace una inspección visual de la placa para detectar posibles contaminaciones. En caso de que exista una contaminación se debe levantar una No Conformidad de acuerdo a los procedimientos de Control de Trabajo No Conforme y el procedimiento de Acciones Preventivas y Correctivas. Cuando el lote se considera libre de contaminación se debe anotar una leyenda de “MEDIO ACEPTABLE” en la bitácora de Preparación de soluciones y medios de cultivo en donde está el registro de la preparación del medio.
IN-LB-
IN-LB-
PO-GC- 03
y 04
BI-LB-12 Tener el cuidado de reportar a coordinación cuando el resultado no sea favorable.
Técnico Laboratorista y Signatario Aprobado
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Medio LB sólido
Tryptona o Peptona de caseína 10 g Extracto de levadura 5 g Cloruro de sodio 10 g Agar 15 g Agua destilada 1000 ml Ajustar el pH a 7 + 0.2, esterilizar
Preparar una solución de ampicilina en condiciones asépticas
Reactivo Cantidad Ampicilina 0.10 g Agua destilada estéril 1 ml Agregar 1 μl por cada ml (500 ml de medio, agregar 500 μl de solución). Agitar y vaciar en placas.
Agar nutritivo (AN)
Reactivo Cantidad Extracto de carne 3 g Peptona 5 g Agar 15 g Agua destilada estéril 1000 ml
3.3.2. Para aislamiento
Medio LB liquido.
Tryptona o Peptona de caseína 10 g Extracto de levadura 5 g Cloruro de sodio 10 g Agua destilada 1000 ml Ajustar el pH a 7 + 0.2, esterilizar
Preparar una solución de ampicilina en condiciones asépticas.
Reactivo Cantidad Ampicilina 0.1 g Agua destilada esteril 1 ml Agregar 1 μl por cada ml (500 ml de medio, agregar 500 μl de solución). Agitar y vaciar en placas.
Medio Extracto de Levadura – Dextrosa CaCO 3 (YDC).
Extracto de levadura 10 g *Dextrosa o glucosa 20 g Carbonato de calcio (CaCO 3 ) 20 g Agar 15 g Agua destilada 1000 ml
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Esterilizar, colocarlo en agitación por unos 10 min (revisar constantemente) y colocar la *dextrosa o glucosa, agitar por de 10 a 15 minutos sin que se solidifique y vaciar en cajas previamente congeladas.
Caldo Nutritivo-Extracto de Levadura-Agar (NBY).
Caldo nutritivo 8 g Extracto de levadura 2 g Fosfato Monoácido de Potasio. (K 2 HPO 4 ) 2 g Fosfato Monobásico de Potasio (KH 2 PO 4 ) 0.5 g Agar 15 g Agua destilada 1000 ml
Esterilizar por separado 50 ml de solución de glucosa al 10% y 1.0 ml de solución de MgSO 4 7H 2 O. 1M. Cuando el medio tenga una temperatura aproximada entre 40-45 ºC adicionar las soluciones anteriores, mezclar y vaciar a cajas.
PDA - Carbonato de Calcio (PDA +CaCO 3 )
PDA 39 g CaCO 3 5 g Agua destilada 1000 ml
3.3.3 Diferenciales
Medio B de King.
Proteosa peptona No. 3^1 20 g K 2 HPO 4 Trihidratado (3H 2 O) 1.5 g Sulfato de Magnesio Hepta Hidratado (MgSO 4 7H 2 O) 1.5 g Glicerol 15 ml Agar 15 g Agua destilada 1000 ml
YDC
Extracto de levadura 10 g D-glucosa 20 g CaCO 3 20 g Oxoid agar No 3 12 g Agua destilada 1000 ml
Agar extracto de malta y levadura (YME)
Extracto de levadura 4 g Extracto de malta 10 g Dextrosa 4 g Agar 20 g Agua destilada 1000 ml
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Agua destilada 1000 ml Distribuir en tubos de ensaye y esterilizar.
Medio de Urea (Christensen, 1946).
Medio base: Peptona 1 g Cloruro de sodio 5 g KH 2 PO 4 2 g Agar 20 g Agua destilada 1000 ml Disolver los ingredientes mediante calentamiento, ajustar el pH a 6.8. +, filtrar con filtro watman No. 1 y esterilizar a 115 ºC durante 20 min. Posteriormente cuando el medio base baje a la temperatura de 45-50 ºC adicionar
Glucosa 1 g Rojo de fenol, sol al 2% 6 ml Urea, sol acuosa al 20% 100 ml Tratados previamente con vapor durante una hora y enfriados a 50 – 55 ºC, mezclar perfectamente y distribuir en tubos previamente esterilizados y dejar enfriar con superficie inclinada.
Medio de Arginina.
Peptona 1 g Cloruro de sodio 5 g KH 2 PO 4 0.3 g Agar 3 g Rojo de fenol 3 g L (+) Hidrocloruro de Arginina 10 g Agua destilada 1000 ml Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7.2, distribuir en tubos y esterilizar.
Hidrólisis de almidón
Almidón soluble al 1% 1 g Agar 16 g Agua destilada 1000 ml
3.4. Preparación de soluciones
Solución de Hipoclorito de sodio al 1% (No tóxico)
Hipoclorito de sodio (Cloralex) 166.6 ml Aforar con agua destilada hasta llegar a 1000 ml Guardar la solución en piceta debidamente etiquetada y a temperatura ambiente 1 mes.
Solución de Tetrametil 1% (Prueba de oxidasa) (Tóxico)
N,N,N,N-Tetramethy-phenylenediamine dihydrocloride, 0.05 g Agua destilada 5 ml Almacenar a temperatura ambiente no usar si sobrepasa de las 24 horas de elaboración.
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Solución KOH 3% (No tóxico)
KOH 0.
Agua destila estéril 10 ml Almacenar en frasco ámbar a temperatura ambiente, vigencia de 6 meses
NOTA: Los medios de cultivo y soluciones que no se encuentren en este procedimiento se pueden observar en el manual para la identificación de bacterias fitopatógenas de M.C. Ma. de Lourdes Rodríguez Mejía. Universidad Autónoma Chapingo. 2009. Y siguiendo lo estipulado en Schaad, N. W., Jones, J. B., and Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of plant pathogenic bacteria. APS PRESS. St.Paul, Minnesota. U.S.A.
3.5 Material
- Espátulas
- Agua destilada estéril.
- Matraz de diferentes medidas (50, 100, 500, 1000, 2000 ml.)
- Probetas de diferentes medidas (25, 100, 500, 1000 ml.)
- Pipeta de vidrio de 5 y 10 ml
- Picetas
- Cajas de petri.
- Parafim
- Magneto de agitación
- Papel aluminio y/o algodón
3.6 Equipo:
- Autoclave
- Balanza analítica
- Placa de agitación
- Campana de flujo laminar
- Potenciómetro
- Incubadora
3.7 Reactivos
- Reactivos antes mencionados en el punto 3.3 y 3.4.
4. Definiciones y terminología
4.1 Definición normativa
Todas las definiciones que se emplean en nuestro sistema de la calidad se basan en las normas:
a) NMX-EC-17025-IMNC-Vigente, Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración. b) NOM-007-FITO-Vigente, Importación de material vegetal propagativo. c) NOM-009-FITO-Vigente, Importación de flor cortada y follaje fresco. d) NOM-011-FITO-Vigente, Prevenir la introducción de plagas de los cítricos. e) NOM-012-FITO-Vigente, Prevenir la introducción de plagas de la papa. f) NOM-013-FITO-Vigente, Prevenir la introducción de plagas del arroz. g) NOM-015-FITO-Vigente, Prevenir la introducción de plagas del cocotero.
