Download Microbiology for exams and more Lecture notes Microbiology in PDF only on Docsity!
Коллоквиум по микробиологии № 1
Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция.
1. История становления и развития микробиологии как науки. Этапы. Основоположники микробиологии и её основных направлений. Микробиология — наука о морфологии, физиологии, генетике, экологии и эволюции микроорганизмов. Историю развития микробиологии можно разделить на 5 этапов: 1) Эмпирический (описательный) период — до XVI в. н. э. О микроорганизмах не знали, но при этом использовали их деятельность (виноделие, хлебопечение, сыроделие, выделка кож). Считалось, что болезни посылаются злыми духами. Гиппократ полагал, что болезни возникаю по разным естественным причинам: общим и личным. Он придавал серьезное значение периодам болезней и предполагал, что многие болезни вызываются какими-то невидимыми причинами, имеющими живую природу («миазмы»). Дж. Фракасторо также считал, что каждая болезнь вызывается своим «контагием», для предохранения от болезней рекомендовал изоляцию больного, карантин, ношение масок, обработку предметов уксусом. 2) Морфологический период — конец XVII – середина XIX в.: открытие мира микроорганизмов, описание их внешнего вида, опыты по самозаражению с целью доказать инфекционную природу многих заболеваний. Левенгук — один из основоположников микроскопии. При помощи микроскопа Левенгук впервые наблюдал и зарисовал бактерии, простейших, отдельные растительные и животные клетки. 3) Физиологический (пастеровский) период — конец XVIII – начало ХХ вв. Начало научной микробиологии: открыто большинство возбудителей инфекционных заболеваний, вирусы, разработана микробная концепция болезней, изучена жизнедеятельность микробной клетки. Эдвард Дженнер предложил метод вакцинации. Луи Пастер — основоположник современной микробиологии и иммунологии, биотехнологии. Доказал, что брожение вызывают микроорганизмы. Изобрел метод пастеризации. Доказал формирование искусственного иммунитета, открыл некоторые патогенные микроорганизмы. Разработал принцип аттенуации, создал живые вакцины против куриной холеры, сибирской язвы, бешенства. Открыл явление анаэробиоза. Ввел методы антисептики, стерилизации сухим жаром. Роберт Кох — один из основоположников современной бактериологии и эпидемиологии. Сформулировал критерии этиологической связи инфекционного заболевания с микроорганизмом. Впервые выделил чистую культуру возбудителя сибирской язвы, открыл холерный вибрион (запятая Коха) и туберкулезную палочку (палочка Коха). Предложил способы дезинфекции и стерилизации текучим паром. Ввел в практику метод выделения чистых культур на твердых питательных средах, способы окраски бактерий анилиновыми красителями, иммерсионный объектив, способ микрофотографии. Дмитрий Иосифович Ивановский - основоположник вирусологии. 4) Иммунологический — начало – середина ХХ в. Илья Ильич Мечников — открыл явление фагоцитоза. Создал теорию происхождения многоклеточных организмов. Разработал учение о микробном антагонизме.
Пауль Эрлих — автор гуморальной теории иммунитета. Открыл антитоксические антитела, разработал метод определения активности антитоксических сывороток. Открыл тучные клетки, разработал способ окрашивания туберкулезных бацилл. Является основоположником химиотерапии инфекционных заболеваний. А. Флеминг открыл пенициллин, и началась эра антибиотикотерапии, приведшая к революционному прогрессу медицины. Г. Домагк обосновал антибактериальное действие сульфаниламидных препаратов и ввел их в лечебную практику. 5) Молекулярно-генетический (современный) — с середины ХХ в.: широкое использование молекулярных методов исследования. Этому способствовали важнейшие открытия в области молекулярной биологии и генетики. В опытах на бактериях была доказана роль ДНК в передаче наследственных признаков. Выяснение принципов кодирования генетической информации в ДНК бактерий и установление универсальности генетического кода позволило лучше понимать молекулярно-генетические закономерности, свойственные высокоорганизованным организмам. Расшифровка генома кишечной палочки сделала возможным конструирование и пересадку генов. Генная инженерия создала новое направление — биотехнологию, с помощью которой получены рекомбинантные микроорганизмы, новые вакцины. Разработаны новые способы диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний (ИФА, РИА, иммуноблоттинг, гибридизация нуклеиновых кислот, ПЦР).
2. Характеристика бактериоскопического метода исследования. Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования - совокупность способов изучения морфологических и тинкториальных свойств микробов в исследуемом материале (лабораторная культура, патологический материал, пробы из внешней среды) с помощью микроскопии. Основная цель - установление этиологии болезни, морфологическая идентификация, а также определение чистоты выделенной чистой культуры. В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов: а) бактериологический мазок (препарат-мазок); б) "висячая капля"; в) "придавленная капля"; г) тонкий мазок; д)"толстая капля"; ж) препарат-отпечаток, з) тушевой препарат. Этапы метода:
- Забор материала (гной, мокрота, кровь, моча, испражнения, промывные воды бронхов и желудка, ликвор, содержимое полостей носа, вагины, трупный материал и др.).
- Транспортировка материала, хранение, подготовка к исследованию.
- Приготовление микропрепарата.
- Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов и т.д.
- Заключение. Приготовление фиксированного мазка:
- Собственно приготовление мазка
- Высушивание
- Фиксирование
- Окрашивание Оценка метода : Метод прост, широко доступен, быстр, экономичен, но мало чувствителен (около 104 -10^5 бактерий в мл) и неспецифичен (из-за схожести морфологии микроорганизмов разных видов), небезопасен.
Принцип ФКМ. Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения света через объект. Эти изменения называются фазовыми. Фазовые колебания света глаз не воспринимает, а наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Пучок света, проходя через кольцевую щель диафрагмы и объект, попадает в кольцо фазовой пластинки объектива. Лучи света отклоняются от фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Получаемое изображение называется фазово-контрастным. 2 типа фазового контраста: а) Позитивный фазовый контраст — фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит «опережение» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне. б) Негативный (аноптральный) фазовый контраст — фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки из копоти или меди. Это вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона. ФКМ позволяет получить изображения малых прозрачных и бесцветных живых объектов (микроорганизмов, клеток). Люминесцентная микроскопия****. Ее принцип основан на использовании явления люминесценции. Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями — флюорохромами Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета, и систему фильтров.
4. Типы микроскопических препаратов. Этапы приготовления фиксированного мазка. Простые методы окраски. В лабораториях используют следующие типы микроскопических микропрепаратов: I. Препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в убитом состоянии. Наиболее часто используется бактериологический мазок. Порядок приготовления:
- В пламени горелки прокаливают бактериальную петлю и верхнюю часть петледержателя (петлю держат в правой руке как писчее перо).
- Пробирку с культурой берут большим и указательным пальцами левой руки. Пробку зажимают мизинцем правой руки и извлекают её из пробирки.
- Края горлышка пробирки прокаливают в пламени горелки и почти одновременно ещё раз обжигают петлю.
- Петлю быстро вводят внутрь пробирки, охлаждают и погружают в бульонную культуру или прикасаются к налёту на скошенной среде.
- Петлю извлекают, быстро фламбируют край пробирки, пробирку закрывают и ставят в штатив.
- Материал из жидкой питательной среды распределяют по площади диаметром примерно 1 см; материал из плотной питательной среды эмульгируют в капле физиологического раствора. Мазок можно подсушить над пламенем спиртовки, контролируя температуру рукой. Петлю прокаливают.
- Высушенный мазок фиксируют 3 раза, медленно проводя его в верхней части пламени спиртовки, мазком вверх (физический способ фиксации). Мазки из жидкого материала (ликвор, моча) готовят аналогично мазку из жидкой питательной среды. Мазки из вязкого материала (мокрота, гной) готовят, помещая каплю материала между двумя стёклами и разводя их в противоположных направлениях, получают два мазка. Тонкий мазок крови: на предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Шлифованное стекло (уже предметного) ставят на первое под углом 45º подводят к капле крови (3–4 мкл) до соприкосновения с ней. После того, как кровь растечётся по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по поверхности стекла. После приготовления мазки сушат на воздухе и фиксируют химическим способом: погружением в метанол ( мин) или этанол (10–15 мин) или смесь Никифорова (10–15 мин). Толстая капля крови: на середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают предметное стекло непосредственно ко второй капле крови, выступающей из пальца (первую удаляют ватой). Нанесённую на стекло кровь бактериальной петлёй распределяют по площади диаметром примерно 1 см; стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания; Препарат-отпечаток: вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу последовательно несколько раз. Препарат-соскоб: поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накалёнными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стёклами. Препарат для электронной микроскопии: исследуемый материал тончайшим слоем наносят на тонкую плёнку-подложку; плёнка крепится на опорную сетку; препарат контрастируют с помощью электронно-плотных (задерживающих электроны) веществ. II. Препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в живом состоянии:
- Висячая капля: на середину не обезжиренного покровного стекла помещают каплю бульонной микробной культуры. Каплю покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным переворачивают;
- Придавленная капля — препарат для микроскопии живых объектов (клеток культуры тканей, бактерий). Ее готовят путём помещения между предметным и покровным стёклами капли взвеси исследуемого материала, избегая образования пузырьков воздуха. На предметное стекло наносят каплю материала, покровное стекло ставят на ребро у края капли и опускают, постепенно вытесняя воздух. Простые методы окраски мазков — используется один краситель, чаще водный фуксин (время экспозиции 1–2 мин) или 1%-ный спиртово-водный раствор метиленовой синьки (время экспозиции 3–5 мин). По истечении времени краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют.
нерастворим в воде, плохо растворим в спирте, поэтому после обработки спиртом Грам+ бактерии остаются темно-фиолетовыми. У Грам– бактерий рибонуклеата магния мало, после взаимодействия с йодом комплекс не образуется и генцианвиолет вымывается спиртом из микробной клетки. Последняя затем окрашивается дополнительным красителем фуксином в розово-красный цвет.
6. Морфология бактерий. Отличия прокариотов от эукариотов. Основные формы бактерий. Морфология бактерий — один из таксономических признаков бактерий. При установлении видовой принадлежности оценивают форму и взаимное расположение клеток, размер, особенности строения клеточной стенки и поверхностных структур (наличие жгутиков, капсулы), способность к спорообразованию, окраску. Основные формы бактерий :
- Кокки — шаровидные бактерии, диаметром примерно 1 мкм: а) микрококки — делятся в одной плоскости, располагаются поодиночке. б) диплококки — делятся в одной плоскости, располагаются парами: в) тетракокки — делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, образуя группы по четыре особи; г) сарцины — делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях, и клетки после деления остаются соединенными друг с другом, возникают пакеты правильной кубической формы из 8, 16 и большего количества кокков. д) стрептококки — овальные, делятся в одной плоскости, но при этом не отделяются друг от друга и образуют цепочки. е) стафилококки — имеют форму идеального шара, делятся беспорядочно в различных плоскостях, образуя скопления, напоминающие грозди винограда.
- Палочки. Различаются по следующим признакам: а) размеру : длиной до 1,5 мкм, толщиной 0,2 мкм — коккобактерии длиной 2–5 мкм, толщиной 0,4–0,8 мкм — мелкие и средние (энтеробактерии); длиной до 10 мкм, толщиной 0,5–2 мкм — длинные палочки (бациллы); б) форме клеток и их концов : имеют строго цилиндрическую или овоидную форму, концы палочек могут быть ровными, закругленными, заостренными, обрубленными; в) взаимному расположению: энтеробактерии — прямые, располагаются беспорядочно; коринебактерии — располагаются попарно, в виде римской цифры V; клостридии — располагаются беспорядочно, имеют веретенообразную форму благодаря терминально или субтерминально расположенной споре; бациллы (имеют эндоспоры) — располагаются цепочками. г) способности к спорообразованию : бактерии — не образуют спор; бациллы — спорообразующие аэробы, диаметр эндоспоры обычно не превышает ширины клетки; клостридии — спорообразующие анаэробы, диаметр споры больше поперечника вегетативной клетки, в связи с этим клетка напоминает веретено или теннисную ракетку.
- Извитые бактерии : вибрионы — короткие клетки, образуют один изгиб, изогнутость их тел не превышает одной четверти оборота спирали, т. е. выглядят наподобие изогнутых палочек или скобочек;
спирохеты — тонкие и длинные, имеют различное число завитков, специфический для различных представителей характер движения и особенности строения; кампилобактерии и спириллы — длинные извитые клетки, образуют 2–3 изгиба из одного или нескольких оборотов; актиномицеты — ветвящиеся клетки.
- Полиморфные бактерии — обладают морфологической изменчивостью, в зависимости от условий имеют вид палочек, кокков или слабоветвящихся форм. Размеры бактерий измеряются в мкм, их органелл — в нм. Прокариоты Эукариоты Ядро Генетический аппарат представлен нуклеоидом. Не содержит гистонов, не имеет ядерной мембраны и ядрышек. Гаплоидны Истинное, ДНК линейной формы, содержит гистоны; имеется ядерная мембрана, нуклеоплазма, хроматин, ядрышки. Диплоидны Внехромосом ные генетически е элементы Плазмиды , транспозоны ДНК митохондрий и хлоропластов, плазмиды есть только у дрожжей Деление клеток Амитоз (бинарное деление). Актиномицеты могут размножаться почкованием Митоз и мейоз Мембранная система Единая и общая ЦПМ, имеются мезосомы. Отсутствуют митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи, хлоропласты, ЭПС, вакуоли, центриоли, пластиды. Внутренние структуры не имеют мембран, отграничивающих их от ЦП. Сложная и многообразная, содержит стеролы. В цитоплазме имеются гиалоплазма и органеллы: ограниченные мембранами (митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи, хлоропласты) и внемембранные (рибосомы, вакуоли, центриоли, микротрубочки). Рибосомы Цитоплазматические 70S, не имеют связи с ЦПМ Митохондриальные 70S, цитоплазматические 80S Включения Запасные вещества в виде гранул полифосфатов, гранул углеводов, жировых капель. Внутри клетки могут находиться газовые пузырьки Жировые капли, пигментные гранулы Состав КС Содержит пептидогликан. Содержит целлюлозу, хитин, хитинозан Строение жгутиков Простое: состоят из одной или нескольких белковых фибрилл (сократительный белок флагеллин), образующих спираль, субмикроскопические размеры Сложное: каждый жгутик состоит из 20 фибрилл-микротрубочек, собранных в группы, микроскопические размеры Эндоцитоз Неспособны к эндоцитозу. Голофитный способ питания В форме фагоцитоза и пиноцитоза — голозойный способ питания Экзоцитоз При участии транспортных систем и путем неконтролируемой В форме диацитоза
- В серологических реакциях с противокапсульными сыворотками.
- При помощи реакции набухания капсулы Нейфельда: при добавлении гомологичных антисывороток капсулы становятся видимыми в световом микроскопе вследствие отложения белка антител.
- Электронная микроскопия: капсула визуализируется в виде микрофибрилл из мукополисахаридов, которые тесно прилегают к КС. ЖГУТИКИ Строение. Жгутики состоят из белка флагеллина. В составе жгутика имеется либо одна гомогенная белковая нить, либо 2–3 нити, плотно свернутые в косу. Нить жгутика — жесткая спираль, закрученная против часовой стрелки; шаг спирали специфичен для каждого вида бактерий. Число, размеры и расположение жгутиков являются признаками, постоянными для определенного вида. Однако у некоторых бактерий могут образовываться жгутики разных типов. Кроме того, наличие жгутиков зависит от условий внешней среды: на твердых средах при длительном культивировании бактерии могут утратить жгутики, а на жидких — вновь приобрести. Количество и расположение жгутиков у одного и того же вида может определяться стадией жизненного цикла.
Классификация бактерий по числу и расположению жгутиков:
- Атрихи — жгутики отсутствуют.
- Монотрихи — один жгутик, расположенный на одном из полюсов клетки.
- Политрихи — много жгутиков: лофотрихи — пучок жгутиков на одном полюсе клетки; амфитрихи — на каждом полюсе клетки расположено по пучку жгутиков; перитрихи — жгутики расположены без определенного порядка по всей поверхности клетки При электронной микроскопии обнаружено, что жгутик состоит из трех частей : спиральной нити, крюка и базального тела. Основную часть жгутика составляет длинная спиральная нить — жесткий полый цилиндр диаметром около 120 нм, состоящий из белка флагеллина. В процессе роста нити белковые молекулы, синтезированные внутри клетки, проходят через полость цилиндра и пристраиваются в спираль на ее конце. На конце жгутика имеется белковая шапочка (крышечка), закрывающая отверстие цилиндра и препятствующая выходу молекул белка в окружающую среду. Крюк (толщиной 20–45 нм) вблизи поверхности клетки — относительно короткий цилиндр, состоит из белка, отличающегося от флагеллина, и обеспечивает гибкое соединение нити с базальным телом. Базальное тело находится в основании жгутика и обеспечивает его вращение. Базальное тело состоит из двух или четырех дисков (колец), нанизанных на стержень, являющийся продолжением крюка. Эти кольца вмонтированы в ЦПМ и КС. Два внутренних кольца (M и S) — обязательные составные части базального тела. M-кольцо локализовано в ЦПМ, S-кольцо располагается в периплазматическом пространстве грамотрицательных или в пептидогликановом слое грамположительных бактерий. Два наружных кольца (D и L) имеются только у грамотрицательных бактерий, локализованы) имеются только у грамотрицательных бактерий, локализованы соответственно в пептидогликановом слое и в наружной мембране КС. Кольца S, D и L) имеются только у грамотрицательных бактерий, локализованы неподвижны и обепечивают фиксацию жгутика в КС. Вращение жгутика определяется вращением M-кольца, встроенного в ЦПМ клетки. Таким образом, особенности строения базального тела жгутика определяются строением КС.
Тип движения жгутиков — вращательный. Существуют два вида движения: прямолинейное и кувыркание (периодические случайные изменения направления движения). Функции жгутиков:
- Обеспечивают адгезию — начальную стадию инфекционного процесса.
- Обеспечивают подвижность бактерий.
- Определяют антигенную специфичность, это Н-антиген. Выявление жгутиков:
- ФКМ нативных препаратов.
- ТПМ нативных препаратов.
- Световая микроскопия окрашенных красителями или металлами препаратов.
- Чаще используют метод серебрения по Морозову
- Электронная микроскопия препаратов, напыленных тяжелыми металлами.
- Косвенно по характеру роста бактерий при посеве в полужидкий 0,3%-ный агар. у неподвижных бактерий наблюдается рост по ходу укола — «гвоздь», а среда прозрачна; у подвижных бактерий наблюдается рост в стороны от укола, по всему столбику агара — «елочка», и диффузное помутнение среды. ФИМБРИИ (ПИЛИ) Строение. жесткие прямые нити из белка пилина, локализованные на КС. По своему функциональному назначению фимбрии подразделяются на 2 типа. Фимбрии 1-го (общего) типа покрывают всю поверхность клетки, располагаются перитрихиально или полярно. Количество фимбрий велико — от нескольких сотен до нескольких тысяч на одну бактериальную клетку. Синтез фимбрий контролируется бактериальной хромосомой, утрата фимбрий приводит к их новому синтезу. Пили 2-го типа образуются только мужскими клетками-донорами, содержащими трансмиссивные плазмиды, в ограниченном количестве (1–4 на клетку), имеют терминальные вздутия. Функции фимбрий:
1. Фимбрии обоих типов : обладают антигенной активностью; на них адсорбируются бактериофаги. 2. Фимбрии 1-го типа : выполняют адгезивную функцию осуществляют механическую защиту бактериальной клетки. Придают бактериям свойство гидрофобности и способствуют объединению клеток в группы; увеличивают всасывательную поверхность клетки бактерий, участвуют в процессах питания, водно-солевого обмена и в транспорте метаболитов. 3. Половые пили : обеспечивают конъюгацию — передачу части генетического материала от донорской клетки к реципиентной. Выявление фимбрий: электронная микроскопия. 8. Структура и функции клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Формы бактерий с дефектами клеточной стенки.
- ПГ неплотно прилегает к ЦПМ. Только у Грам– бактерий между ЦПМ и ПГ КС есть периплазматическое пространство. Тонкий ПГ соединен белками с наружной мембраной.
- КС многослойная, сверху ПГ только у Грам– бактерий находится наружная мембрана (НМ) толщиной 8–10 нм. Она оставляет до 80 % сухой массы КС. НМ по строению сходна с внутренней ЦПМ и состоит из липопротеина (ЛП), ЛПС, фосфолипидов и белков.
- Основной компонент НМ — билипидный слой: внутренний слой образован ЛП, а наружный — ЛПС. ЛПС занимает 30–40 % поверхности НМ и состоит из трех компонентов: липида А, который «заякоривает» ЛПС в НМ. кор-слоя, одинакового для всех Грам– бактерий, наиболее постоянной частью которого является кетодезоксиоктоновая кислота; О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями. Она определяет антигенную специфичность, является О-антигеном. Много различных белков локализовано в НМ Грам– бактерий. Белки НМ делят на основные и минорные.
- Грам– бактерии менее чувствительны к пенициллину и лизоциму, чем Грам+. Функции клеточной стенки:
- Обеспечивает механическую защиту от воздействий окружающей среды.
- Формообразующая
- Транспортная.
- Содержит родо- и видоспецифические антигены.
- У патогенных бактерий оказывает повреждающее действие на организм и индуцирует иммунный ответ.
- Несет на поверхности разнообразные рецепторы, в т. ч. к фагам и бактериоцинам.
- Участвует в процессе деления.
- Обеспечивает межклеточные взаимодействия между бактериями при конъюгации, а также между патогенными бактериями и тканями высших организмов. Выявление клеточной стенки:
- Окраска по Граму
- Электронная микроскопия.
Формы бактерий с дефектом КС
Протопласты Сферопласты L-формы Происхождение Из Грам+ бактерий Из Грам– бактерий Из Грам+ и Грам– бактерий Степень утраты КС Полная Частичная Полная или частичная Форма Сферическая Сферическая или полусферическая Полиморфны Факторы, индуцирующие Обработка ферментами, Обработка лизоцимом Спонтанно, в результате действия
образование разрушающими ПГ неблагоприятных факторов или мутаций. Реверсия в исходную форму Возможна Возможна Нестабильные способны. У стабильных неспособность закреплена генетически Отношение к действию фагов Резистентны Чувствительны Резистентны или чувствительны Жизнеспособность В изотонической среде погибают в результате осмотического лизиса. В гипертонической среде сохраняются некоторое время, утрачивая способность к размножению Способны длительно находиться в организме и на питательных средах. Выявление Фазово-контрастная микроскопия Мало разработано Значение Приспособление к неблагоприятным условиям среды Приспособление к неблагоприятным условиям среды
9. Цитоплазматические структуры бактерий, функции, методы выявления. Кислотоустойчивые бактерии. Метод окраски. ЦИТОПЛАЗМА Строение. ЦП — содержимое клетки, окруженное ЦПМ и занимающее основной объем бактериальной клетки. ЦП является внутренней средой клетки и представляет собой сложную коллоидную систему, состоящую из воды (около 75 %) и различных органических соединений. Располагающийся под ЦПМ слой протоплазмы более плотный, чем остальная масса в центре клетки. Фракция ЦП, имеющая гомогенную консистенцию и содержащая набор растворимых РНК, ферментных белков, продуктов и субстратов метаболических реакций, получила название цитозоля. Другая часть ЦП представлена разнообразными структурными элементами: нуклеоидом, плазмидами, рибосомами и включениями. Функции цитоплазмы: содержит клеточные органеллы. Выявление цитоплазмы: электронная микроскопия. НУКЛЕОИД Строение. Нуклеоид не отделен от ЦП ядерной мембраной, не имеет ядрышек и гистонов, содержит одну хромосому, имеет гаплоидный набор генов, не способен к митотическому делению. Нуклеоид расположен в центре бактериальной клетки, содержит двунитевую молекулу ДНК, небольшое количество РНК и белков. Молекула ДНК несет множество отрицательных зарядов, т. к. каждый фосфатный остаток содержит ионизированную гидроксильную группу. Нейтрализация зарядов осуществляется взаимодействием ДНК с полиаминами и ионами Mg2+.
Включения — продукты клеточного метаболизма, имеющие приспособительное значение. Когда в этих веществах возникают потребности, они снова включаются в метаболизм. Функции включений:
- Трофическая
- Энергетическая
- Дифференциально-диагностическое Выявление включений (зерен волютина):
- окраска по Леффлеру
- окраска по Нейссеру
- Окраска волютина флюорохромом корифосфином: в люминесцентном микроскопе бактерии желто-зеленые, зерна волютина — оранжево-красные.
Кислотоустойчивые бактерии
Кислотоустойчивость некоторых бактерий обусловлена особенностями химического состава их КС: наличием в ней повышенного количества липидов, оксикислот (миколовой и миколеновой), восков. Кислотоустойчивые бактерии плохо воспринимают анилиновые красители, их окрашивают концентрированными растворами красителей с подогреванием и дифференцируют от кислоточувствительных растворами сильных неорганических кислот. Для окраски кислотоустойчивых бактерий используют метод Циля–Нильсена. Техника окраски по Цилю–Нильсену: на фиксированный препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги, наливают кислый карболовый фуксин Циля и, держа стекло над пламенем спиртовки, подогревают препарат 3–5 мин до появления паров, но не доводят до кипения; препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают водой; препарат обесцвечивают 5%-ным раствором H 2 SO 4 (стекло 2–3 раза погружают в стакан с кислотой, не задерживая его в ней) или 95%-ным C 2 H 5 OH, содержащим 3%-ный НСl; промывают водой; докрашивают метиленовым синим 3–5 мин; промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с иммерсионной системой. Кислотоустойчивые бактерии сохраняют рубиново-красный цвет. Кислоточувствительные бактерии обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот, а при дальнейшем окрашивании метиленовым синим принимают цвет дополнительного красителя — синий.
10. Покоящиеся формы микробов. Спорообразование у бактерий, стадии, методы выявления спор. В процессе жизни микробов наблюдаются 2 стадии:
а) вегетативная - размножающаяся и жизнедеятельная. б) покоящаяся - жизнеспособная, но не жизнедеятельная. Особенности покоящейся стадии:
- Более толстая оболочка, меньшее содержание воды.
- Слабая проницаемость для различных химических веществ (устойчивость к красителям)
- Более высокая устойчивость к повреждающим факторам среды(к антибиотикам и др.)
- Пониженный уровень метаболизма(анабиоз).
- Пониженная способность к выделению БАВ ЭНДОСПОРЫ Эндоспоры образуются при попадании вегетативной клетки в неблагоприятную внешнюю среду. Споры очень резистентны к физическим и химическим факторам. Это позволяет им выжить в условиях, губительно действующих на вегетативные клетки. Эндоспоры образуются внутри бактериальной клетки. Объём споры в 10 раз меньше, чем вегетативной клетки. Структурно спора представляет ДНК, окруженную многослойной оболочкой. Объем оболочки споры достигает 50 % от всего объема споры. Строение оболочек спор у разных видов сильно различается. Споруляция — процесс интенсивного распада белков материнской клетки с одновременным образованием новых белковых компонентов. Поэтому по антигенной структуре споры и вегетативные клетки одного и того же вида различны. Процесс спорообразования генетически обусловлен. Он длится 18–20 ч, внешние источники питания и энергии не требуются. Стадии спорообразования (споруляции):
- Подготовительная. Перед спорообразованием резко снижается синтез ДНК и деление клеток прекращается. Происходит накопление большого количества гранулезы. ЦП становится зернистой. Клетки резко увеличиваются в размерах. У спорообразующей бактерии образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки. Вокруг дополнительного нуклеоида в ЦП спорообразующей клетки образуется спорогенная зона — уплотненный участок ЦП, не имеющий свободной воды.
- Стадия предспоры (проспоры). В ЦПМ, ближе к одному из полюсов клетки, возникает инвагинация. В этом процессе участвуют мезосомы, которые спаивают сближающиеся участки инвагинированных мембран и образуют споровую перегородку (септу), разделяющую клетку на два протопласта, каждый из которых содержит одну хромосому. Затем материнская клетка поглощает отсеченный участок ЦП с ядром. Эта стадия спорообразования обратима. В конце этой стадии сближающиеся участки мембраны сливаются и меньший из протопластов (проспора) покрывается второй оболочкой, синтезируемой мембраной материнской клетки. Таким образом внутри клетки возникает новая клетка-проспора, окруженная, в отличие от материнской, двумя трехслойными мембранами — внутренней и внешней.
- Образование кортекса — оболочки между внутренней и внешней мембранами проспоры, состоящей из особых молекул пептидогликана.
- Стадия созревания. С внешней стороны наружной мембраны споры образуется внешняя плотная споровая оболочка , в состав которой входят белки, липиды и
Хемотаксис — движение в определенном направлении относительно источника химического вещества. Химические вещества делят на две группы: инертные и вызывающие таксисы — хемоэффекторы. Среди хемоэффекторов есть вещества, привлекающие бактерий, — аттрактанты, и вещества, их отпугивающие, — репелленты. Аэротаксис — нуждающиеся в молекулярном кислороде бактерии скапливаются вокруг пузырьков воздуха, попавших под покровное стекло. Фототаксис — движение к свету или от него, свойственно фототрофным бактериям, использующим свет в качестве источника энергии. Магнитотаксис — способность водных бактерий, содержащих кристаллики железосодержащих минералов, плыть вдоль линий магнитного поля Земли. Термотаксис — движение в сторону изменения температуры, что имеет большое значение для некоторых патогенных бактерий. Вискозитаксис — способность реагировать на изменение вязкости раствора. Обычно бактерии стремятся в среду с большей вязкостью, что имеет большое значение для патогенных видов. Скольжение бактерий. Способность к скольжению с небольшой скоростью (2–11 мкм/ с) по твердому или вязкому субстрату обнаружена у некоторых прокариот, например, микоплазм. Существуют несколько гипотез, объясняющих скользящее движение. Согласно гипотезе реактивного движения , оно обусловлено выделением слизи через многочисленные слизевые поры в КС, в результате чего клетка отталкивается от субстрата в направлении, противоположном направлению выделения слизи. Согласно гипотезе «бегущей волны» , скользящее движение у подвижных безжгутиковых форм связано с наличием между пептидогликановым слоем и наружной мембраной КС тонкого белкового слоя из упорядоченно расположенных фибрилл, аналогичных нитям жгутиков. Вращательное движение фибрилл, «запускаемое» этими структурами, приводит к появлению на поверхности клетки «бегущей волны» (движущихся микроскопических выпуклостей КС), в результате чего клетка отталкивается от субстрата. Наконец, у некоторых скользящих бактерий описаны структуры, напоминающие базальные тела жгутиковых форм. Оценка подвижности может быть оценена косвенно, ЭМ, ФКМ, ТПМ, в нативных препаратах и по Морозову.
12. Принципы систематики микробов. Систематическое положение микробов. Таксономические категории. Понятие и критерии вида. Систематика бактерий — наука о положении бактерий в органическом мире в соответствии с их происхождением и биологическим сходством. Принципы систематики бактерий: 1. Феносистематика (нумерическая таксономия) основана на анализе максимального количества сопоставляемых признаков (морфологических, физиологических, биохимических, серологических, экологических). Признаки подбирают так, чтобы они были альтернативными. Считается, что сходство между двумя исследуемыми штаммами тем больше, чем больше отношение числа совпадающих признаков к числу всех учитываемых. Однако нумерическая таксономия не имеет прямого отношения к филогении. Большое число сравниваемых фенотипических признаков и принцип их равной значимости затрудняет классификацию.
2. Хемосистематика основана на анализе структуры химических соединений поверхностных образований бактериальной клетки, состав которых имеет видовые отличия. 3. Геносистематика предполагает объединение бактерий на основе степени сходства геномов. Специфичность нуклеиновых кислот для различных бактерий обусловливается их химическим строением и отражается на количественном соотношении пуриновых и пиримидиновых оснований, а также на последовательности чередования нуклеотидов в цепи молекулы. Молекулярно-генетические критерии систематики: процентное соотношение Г/Ц; коэффициент подобия (колеблется от 25 до 75 %), который определяют по формуле. Чем выше коэффициент подобия, тем больше вероятность принадлежности выделенного микроорганизма к определенному виду. При этом исходят из условного допущения, что степень гомологии более 60 % свидетельствует о принадлежности микроорганизмов к одному виду, выше 40 % — к одному роду; плазмидный профиль — совокупность типов плазмид; секвенирование — определение последовательности нуклеотидов в рибосомной РНК (рРНК) — «золотой стандарт» систематики. 4. Смешанный подход. Искусственная классификация бактерий базировалась на их объединении в отдельные группы на основе только фенотипического сходства. Основой для искусственной классификации служило адекватное описание штаммов. Последние объединялись в виды, виды в роды, а роды в семейства. Построение естественной классификации бактерий — конечная цель их таксономии. Она состоит в том, чтобы объединить родственные формы, связанные общностью происхождения, и на этой основе создать филогенетическое древо бактерий. Бактерии делятся на два царства: Эубактерии и Архебактерии. Установлением соподчинения отдельных групп организмов занимается таксономия — раздел систематики, разрабатывающий принципы классификации. Таксон — классификационная единица, группа организмов, объединенных по определенным однородным свойствам в рамках той или иной таксономической категории. Таксоны, применяемые в бактериологии: 1. Домен — группа рангом выше царства, объединяющая разные организмы, обладающие определенным набором общих черт. 2. Царство — совокупность типов бактерий. 3. Тип — совокупность классов бактерий. 4. Класс — совокупность порядков бактерий. 5. Порядок — совокупность семейств бактерий. 6. Семейство — совокупность взаимосвязанных родов бактерий, базируется на основе типового рода. 7. Род - совокупность близкородственных видов, базируется на основе типового вида. 8. Вид — основной таксон в классификации бактерий — эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих экологическое единство и близкий генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими признаками и антигенной структурой. Подвиды (внутривидовые категории) — совокупность популяций определенного вида, отличающихся рядом признаков, не препятствующих объединению в вид. Подвидовые таксоны:
