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2024 - 06 - 05
MICROBIOLOGIA GENERAL
1 - DEFINICIONES
Microbiología: Ciencia encargada del estudio de los organismos microscópicos
(celulares y subcelulares), principalmente de aquellos que se encuentran por debajo
del poder de resolución del ojo humano.
Microorganismo: Organismo vivo que requiere de montajes especiales para su
observación bajo microscopio.
Metabolismo microbiano: Conjunto de reacciones bioquímicas que se suceden en
los microorganismos y por medio de las cuales, obtienen la energía y los nutrientes
necesarios para llevar a cabo su crecimiento, mantenimiento de estructura celular y
reproducción.
Diagnóstico Microbiológico: Identificación y diferenciación intra e interespecífica de
un microorganismo, procedente de muestras de diversos orígenes (agentes causantes
o no de enfermedad).
2 - PROCEDIMIENTO
Preparación de medios de cultivo, medios selectivos y diferenciales
Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos nutrientes
básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades
varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivarlos
en el laboratorio.
Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio,
mediante el uso de medios de cultivo artificiales, los cuales se encuentran
disponibles en una gran variedad y los cuales en general aportan a los
microorganismos:
- Una fuente de carbono. El carbono es un componente esencial y central para
conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus
funciones. Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en
dos grupos: Autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden
cultivarse en medios que contengan únicamente compuestos inorgánicos
(utilizan principalmente dióxido de carbono como carbono inorgánico). Los
organismos heterótrofos en su lugar necesitan un suministro de carbono
orgánico (por ejemplo, glucosa u otro carbohidrato).
- Una fuente de Nitrógeno. Elemento esencial para que la célula construya
macromoléculas como: proteínas y ácidos nucleicos. Algunos microorganismos
usan nitrógeno atmosférico, otros emplean sales de nitrato o de amonio como
compuestos inorgánicos, así como, otros requieren compuestos orgánicos que
contengan nitrógeno como los aminoácidos.
- Elementos no metálicos. Iones no metálicos como el azufre y el fósforo. El
azufre puede encontrarse en proteínas, sulfatos o como azufre elemental;
mientras el que el fósforo puede encontrarse formando sales.
- Elementos metálicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe
y Fe
). Llamados
también micronutrientes, oligoelementos o elementos traza. Encontrados en
sales inorgánicas adicionadas a los medios y los cuales son tomados en bajas
concentraciones por los microorganismos.
- Vitaminas. Los microorganismos puede tomarlas del medio ya elaboradas o
iniciar procesos de síntesis de las mismas. Algunos microorganismos poseen
una variedad de vías para sintetizar vitaminas; mientras otros, sintetizan un
número muy limitado de ellas a partir de componentes del medio. Otros las
requieren como suministro.
- Agua.
- Energía. Existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, los fotótrofos y los
quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar), como única
fuente de energía; y los quimiótrofos que, obtienen la energía por oxidación de
- pH. Se refiere a los pH óptimos para el desarrollo bacteriano, indispensable
para su aislamiento; variaciones ácidas o alcalinas, pueden inhibir su
crecimiento.
- Transparencia. Permite la observación bacteriológica,
evidenciar morfológica y físicamente su crecimiento en medios
de cultivo adecuado.
La presentación comercial de los medios sintéticos y deshidratados puede ser en
polvo o granulados. En el mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o
medios servidos en placas Petri o tubos.
Los medios de cultivo granulados, son medios de cultivo elaborados a partir de
materias primas sometidas a molienda, mezclado, pulverización y granulación
(aglutinación de la mezcla pulverulenta). Este tipo de medios tienen algunas ventajas
frente a los medios tradicionales en polvo, como lo son:
- Reduce alergización o respiración de sustancias tóxicas por producción de polvo.
- Menor adherencia a las paredes de los recipientes.
- Mayor facilidad en el pesaje.
- Mejor humectabilidad (grumos fácilmente solubles).
- No se produce separación de fases de los componentes del medio de cultivo
en almacenamiento prolongado.
Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado físico, composición y
su propósito.
SEGÚN SU ESTADO FÍSICO
- Sólidos: 1.5 a 2.0 % de agar – agar.
- Semisólidos: 0.5 % de agar – agar.
- Líquidos: No contienen agar – agar.
- Bifásico: Contiene fase sólida y fase líquida (listos para utilizar). Utilizados para cultivar
microorganismos tal y como se encuentran.
SEGÚN SU NATURALEZA O COMPOSICIÓN
- Naturales: en la naturaleza. Se usan con base a la experiencia y no a su composición.
Ej.: Sangre diluida leche, jugos vegetales, etc.
- Sintéticos: De composición exactamente conocida. Los más utilizados son los medios
comerciales deshidratados.
- Vivos: Contienen células u organismos vivos, como las células de riñón de mono o
huevos embrionados.
SEGÚN SU PROPOSITO
Aislamiento de microorganismos
Medios enriquecidos: Con adición de sangre, suero o extractos de tejidos de
animales o plantas al caldo.
O agar, proporcionando sustancias nutritivas complementarias para el
crecimiento de microorganismos exigentes.
Medios selectivos:* Con adición de algunas sustancias que no permiten el
desarrollo de un grupo de microorganismos y sin afectar el desarrollo de los
grupos de interés. En principio se pueden seleccionar los microorganismos que
se desarrollan en medios orgánicos poco comunes, caso en el cual se omiten
otros compuestos de carbono.
Medios diferenciales:* Contienen reactivos químicos que traen como
resultado, determinado tipo de crecimiento bacteriano después de la incubación
(observación de hemólisis, coloraciones de las colonias y otras reacciones
indicadoras).
Medios para identificación: Para determinar el tipo de crecimiento producido
por los microorganismos, así como, la capacidad para producir cambios
químicos.
Determinación de nitrógeno total. Calculada por la técnica micro-Kjeldahl.
Determinación de componentes característicos de las células. Como
peptidoglicano, ácidos nucleicos, proteínas, ATP, etc. Esta metodología es
aplicada comúnmente en bacterias, cuando otros métodos evidencian ser poco
exactos, debido a la formación de grumos no dispersables por el crecimiento típico
del microorganismo y para mediciones de crecimiento en muestras de ambientes
naturales.
Recuento en cámara de Petroff-Hauser. Cámara de Neubauer o
Hemacitómetro. La metodología se desarrolla sobre un portaobjetos en el cual se
deposita la muestra; este portaobjetos tiene impresa una cuadrícula graduada y
con medidas exactas.
Contadores electrónicos de partículas Coulter. El fundamento del método, es
la interrupción de corriente por el paso de una célula. Con esta metodología se
requieren muestras totalmente puras, pues cada partícula presente que no sea una
célula, es registrada por el equipo o puede ser la causante de un daño del mismo.
El registro de los individuos se realiza, haciendo pasar la suspensión microbiana a
través de un tubo capilar entre dos polos de una corriente eléctrica; cada vez que
por un orificio pasa una partícula (célula), se interrumpe la corriente y esta
información es colectada por un dispositivo electrónico que detecta el número y el
tamaño de las partículas que van pasando y de esta manera se determina la
población de células.
MÉTODOS INDIRECTOS.
Consumo de nutrientes o producción de metabolitos / tiempo. Como por
ejemplo la medición del consumo de oxígeno, consumo de gas carbónico,
producción de ácidos y otros metabolitos, etc.
Métodos ópticos de turbidimetría. Es la medición de la cantidad de luz
dispersada o transmitida a través de un cultivo microbiano (efecto Tyndall). La
dispersión e s p r o p o r c i o n a l a l a m a s a d e l c u l t i v o y s o l o e s v á l i d o
para concentraciones mayores a 10
7 células/ml; donde, la proporcionalidad de la
absorbancia y la masa bacteriana se conservan. Con este fin, puede ser utilizado
el espectrofotómetro, que mide la densidad óptica (D.O.), es decir, la absorbancia.
El nefelómetro, es un equipo similar al espectrofotómetro, pero la lectura
registrada es de la luz dispersada por la muestra.
Escalas o patrones de McFarland. Técnica basada en turbidimetría; La escala se
basa en la capacidad de precipitación del Cloruro de Bario en presencia de Ácido
Sulfúrico y su utilidad, es la poder elaborar suspensiones bacterianas ajustadas a
un patrón y valorando su concentración; para esto, se toma una alícuota de la
muestra de bacterias y se inocula en un tubo conteniendo solución salina
fisiológica (0,85%). El objetivo es lograr ajustar una concentración de bacterias a
uno de los patrones señalados en la Tabla 1 ó determinar la concentración de una
muestra.
Tabla 1. Escala de McFarland, forma de preparación de cada patrón y su
correspondencia en turbidez a una población de bacterias expresada en UFC/mL.
Tubo Escala de McFarland BaCl 2 1% (mL) H 2 SO 4 1% (mL) UFC/mL
1 4,0 0,1 9,9 3,0x
8
2 3,7 0,2 9,8 6,0x
8
3 3,5 0,3 9,7 9,0x
8
4 3,4 0,4 9,6 1,2x
9
5 3,3 0,5 9,5 1,5x
9
6 3,2 0,6 9,4 1,8x
9
7 3,15 0,7 9,3 2,1x
9
8 3,10 0,8 9,2 2,4x
9
9 3,04 0,9 9,1 2.7x
9
10 3,00 1,0 9,0 3,0x
9
Los patrones de McFarland, permiten establecer una relación entre una precipitación química y una
suspensión de bacterias (Figura 2). Se elaboran 10 estándares (Tabla 1), y por espectrofotometría
Fig. 2. Esquematización de los patrones de McFarland,
donde se observa la turbidez ocasionada por la
precipitación del Cloruro de Bario en presencia de Ácido
Sulfúrico en diferentes proporciones, así como, su
correspondencia a una población bacteriana expresada en
UFC/ml
Recuento en placa estándar o recuento de microorganismos viables. Con
este método se puede distinguir entre células viables y no viables; esto se logra
sembrando diluciones de las muestras que contienen los microorganismos en
medios de cultivos sólidos dispensados en cajas Petri, incubando y posteriormente
realizando el conteo de las colonias visibles (la metodología puede ser aplicada en
la superficie del agar o dentro del agar). Estas colonias a su vez, son multiplicadas
por el factor inverso de la dilución (o diluciones), utilizada (Figura 3).
Con esta metodología y con el objetivo de reducir el error estadístico, se
recomienda realizar suficientes réplicas de las mismas diluciones, así como, de las
diferentes diluciones a utilizar. Adicionalmente, el conteo y cálculo de la población
de viables, se debe realizar en cajas que contengan entre 30 y 300 colonias
(algunos autores reportan el rango de 50 a 300).
En este tipo de conteo de viables, las colonias no siempre han de proceder de una
sola célula, dado que algunas bacterias pueden formar agrupaciones y estas
serán las que darán origen a la colonia; por lo anterior, los reportes de esta
metodología se refieren a “unidades formadoras de colonia” o UFC; unidad que,
corresponde como mínimo a una bacteria formando una colonia, así como,
también a un grupo de estas que han sido las formadoras de la misma.
Fig. 3. Cajas Petri sembradas con diluciones sucesivas, donde, la imagen de la izquierda
representa la dilución menor (o más concentrada), en progresión hacia la dilución mayor o más
diluida (imagen de la derecha)
Con esta metodología se pueden aplicar algunas modificaciones, como es el uso
y conteo de viables sobre filtros de membrana de nitrocelulosa o nylon (para
muestras con bajas poblaciones de microorganismos), en los cuales quedan
atrapados los microorganismos, pues el tamaño del poro no permite su paso.
Para este caso, las muestras se hacen pasar a través del filtro y posteriormente,
el filtro es depositado sobre un medio de cultivo sólido, incubado y realizado el
conteo de colonias formadas sobre él.
Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de
evaluar sus características en estos medios.
Se entiende por cultivo puro, una población de células las cuales todas proceden
de una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las
diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro.
TÉCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI.
Siembra en cajas de Petri por la Técnica de agotamiento, aislamiento o de
estría cruzada.
Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias
aisladas); mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de
un inóculo. Para su realización: ( i ) se toma la caja de Petri en la palma de la mano
y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla
previamente esterilizada y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo
en un área periférica de la caja haciendo movimientos circulares para
homogeneizar el inóculo. ( ii ) El asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en
un lateral del agar (procurando no dañarlo); a continuación, se realiza una estría
partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia
el extremo contrario de la superficie del agar. Se debe procurar que, en cada
sección de la caja, las estrías queden trazadas con mayor separación. ( iii ) Repita
el paso ii , por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear
y enfriar el asa cada vez que culmine una estría y solo tocar con el asa la estría
inmediatamente anterior, con el objetivo de ir reduciendo la carga microbiana
arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla
(Figura 1).
Fig. 1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento (y otros
microorganismos emulsionables como las
levaduras)
Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra en cuadrantes.
El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inóculo a medida que se realizan estrías en la
superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes
(imaginariamente o con un marcador vidriográficopor la base de la caja); se procede a esterilizar
el asa en el mechero, se toma el inóculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en
cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente
inóculo). Las cajas así sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la
bacteria.
Con esta técnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (última
estría realizada), se encuentren colonias de la bacteria aisladas (Figura 2).
Siembras en cajas de Petri por la Técnica de punción.
Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de microorganismos y así
más adelante establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo
de cepas previamente almacenadas y/o conservadas. Consiste en tomar parte de
micelio con un asa micológica (o asa recta), y por una punción suave en el centro
de la caja inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetivo,
pueden hacerse múltiples picaduras en el agar (varios puntos de siembra) (Figura 4).
Fig. 4. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica
de punción, utilizando asa micológica y sobre la superficie de un agar
en caja Petri.
- TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS.
La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un
solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al
microorganismo de interés, por lo tanto, se deben tenerlas siguientes precauciones:
- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo
que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca
de este.
- Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que contiene el
tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón. Nunca
deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar.
- Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación.
- Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el medio
de cultivo).
- Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
- Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.
- Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del
tubo.
- Siempre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su defecto con
mecheros Bunsen.
- En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de
cultivo, así como, utilice asas totalmente rectas.
Siembra en tubos por estría simple.
Se realiza en un tubo con medio sólido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el
asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estrías
(Figura 5A).
Siembra en tubos por picadura
Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con medios
sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con
el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el
extremo del asa al fondo del tubo (Figura 5C y 5D).
Siembra mixta en tubos.
Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el
fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría sobre la
superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bise
marcando las estrías; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los
dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo (Figura 5B).
Del mismo modo, los rasgos de las colonias y la disposición o agrupación bacteriana,
son criterios taxonómicos que deben ser descritos correctamente para aislamientos
no identificados, como parte de la identificación primaria.
OBSERVACIÓN DE LA MORFOLOGÍA BACTERIANA EN MUESTRAS TEÑIDAS.
La morfología de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados
frescos o fijos y, teñidos por algunos de los métodos de tinción conocidas; ya que,
por su misma estructura son difíciles de visualizar en su estado natural. Las tinciones
biológicas y los procedimientos de tinción en unión con la microscopía de luz son una
herramienta básica importante en microbiología, permitiendo estudiar las propiedades
de los microorganismos y su división en grupos específicos para propósitos
diagnósticos.
Consideraciones generales en la morfología de las bacterias.
Tamaño. Son invisibles al ojo humano, por lo tanto, estas se miden en micrómetros
(μm), unidad que equivale a 10
- 3 mm. El tamaño de las bacterias varía dependiendo
de las especies entre menos de 1μm y 250μm; siendo lo más habitual entre 1 y
10μm.
Forma. La forma de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared
celular. Las bacterias poseen una de las tres formas fundamentales: esférica,
cilíndrica y espiral. Las células esféricas, se denominan cocos y suelen ser
redondeadas, aunque pueden presentar formas ovoides o elípticas. A las de forma
cilíndrica se les denomina bacilos; los extremos de estas células suelen ser
redondeados, rectos, en forma de huso o cuerno. A las de forma espiral o helicoidal,
se las denomina espirilos y se caracterizan por su forma de sacacorchos. Existe una
morfología intermedia entre los cocos y los bacilos, denominada cocobacilos;
muchos de ellos parásitos del hombre y de los animales, como Brucella spp.,
Bordetella spp., Francisella spp., y Pasteurella spp., las cuales aparecen en el Manual
de Bacteriología Sistemática de Bergey, en la sección de bacilos y cocos Gram-
negativos aerobios.
Disposición : Muchas veces al mirar al microscopio se observan células unidas
unas a otras. Mientras que, las bacterias en forma de espiral (espirilos), suelen
ser células separadas, otras especies suelen crecer en una disposición
característica; disposición que, va a depender del plano en el que se realice la
división celular y si la célula hija permanece junto a la madre una vez realizada la
división celular. Cada una de estas disposiciones es típica de una especie
particular y puede usarse en la identificación. Hay que tener en cuenta que,
raramente todas las células de una especie se disponen exactamente de la misma
manera.
Cuando un coco se divide en un plano, forma un diplococo o dos células juntas
( Neisseria spp.). Cuando un coco se divide en un plano y permanece unido
después de varias divisiones, forma una cadena que se denomina estreptococo
( Streptococcus spp.). Si las células se dividen en más de un plano o dimensión, la
disposición es más complicada. Cuando un coco se divide en ángulo recto al
primer plano de división forma tétradas ( Pediococcus spp.). Una posterior división
en el tercer plano puede resultar de un paquete cúbico de ocho células conocido
como sarcinas ( Sarcina spp.). Si la división en los dos planos es de forma irregular
se forman similar a un racimo de uva conocido como estafilococo (S taphylococcus
spp.).
Los bacilos generalmente no se agrupan en disposiciones características, aunque
hay excepciones. Por ejemplo, el bacilo de la difteria, tiende a agruparse en
empalizada. Dentro del género Bacillus spp., algunas especies forman cadenas
llamadas estreptobacilos.
De acuerdo a la disposición, forma y tamaño, las bacterias se clasifican en (Figura 1):
