Download PRÁCTICA DE LABORATORIO and more Exercises Biomaterials in PDF only on Docsity!
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y MEJORAMIENTO VEGETAL
PRÁCTICA # 1
CULTIVO DE TEJIDOS
1. TEMA DE LA PRÁCTICA: CULTIVO IN VITRO DE ESPECIES
VEGETALES A PARTIR DE YEMAS AXILARES
2. INTRODUCCIÓN
Se conoce como yema a cualquier parte de la planta capaz de brotar y crecer, son tejidos meristemáticos presentes en todas las plantas los cuales dan origen al crecimiento de la misma, de sus ramas, raíces, flores, etc.; están presentes en todo tipo de plantas, en algunas especies se pueden observar a simple vista, sin embargo, en otras son tan pequeñas que se necesita un microscopio para identificarlas. La yema situada en el extremo terminal del eje de una planta, se conoce como yema apical, mientras que las yemas que se encuentran en la unión de las hojas con el tallo se conocen como yemas axilares.
Las plantas que de forma natural presentan pocas ramas o brotes se debe a que tienen una marcada dominancia apical, la cual es controlada por hormonas vegetales, principalmente ácido indolacético, hormona de tipo auxina que evita el crecimiento y la proliferación de las nuevas yemas; por el contrario, si una planta presenta una gran cantidad de ramas o brotes, significa que su dominancia apical es débil.
La dominancia apical se puede romper fácilmente al cortar la parte superior de la planta, lo que estimula el desarrollo de brotes o ramas a partir de las yemas existentes; esto es precisamente lo que ocurre cuando se “poda” una planta. En el laboratorio, a fin de estimular la proliferación de yemas, se utilizan reguladores de crecimiento específicos, los cuales actúan como “tijeras bioquímicas” (George, et al,. 2008; Pierick, 1990). A diferencia de la organogénesis o la embriogénesis somática, la técnica de proliferación de yemas axilares es la que produce la menor variación genética dentro de todas las técnicas de micro propagación de plantas, por lo que es la única que se puede considerar una “clonación”.
Consiste en estimular el crecimiento de las yemas existentes en las plantas rompiendo la dominancia apical de la misma, lo cual se efectúa utilizando reguladores de crecimiento del tipo citocinina, los cuales presentan efectos contrarios a las auxinas, permitiendo que las yemas crezcan y se produzcan nuevas plantas, las que a su vez desarrollarán más plantas a partir de sus yemas y así sucesivamente (Dhir, et al., 1984).
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y MEJORAMIENTO VEGETAL
3. OBJETIVOS:
a. General Conocer la respuesta in vitro que se obtiene mediante la utilización de reguladores de crecimiento para la proliferación de yemas axilares b. Específicos Comprender los conceptos teóricos básicos del cultivo de tejidos vegetal. Desarrollar competencias en el manejo de laboratorio para la aplicación de protocolos de desinfección, preparación de medios de cultivo y siembra de diferentes tipos de explantes. Establecer y aplicar protocolos de propagación in vitro en especies vegetales de interés agrícola y ambiental.
4. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS Muestra: Explantes vegetales del tallo y hojas de las plantas a replicar
Materiales: 4 Vaso de precipitado de 500 ml 2 Probeta de 500 ml 2 Probeta de 250 ml 2 Probeta de 100 ml 2 Probeta de 50 ml 2 Matraces de 500 ml 10 Frascos de cultivo de 500 ml con tapa 4 Barra magnética 2 Recuperador de barras magnéticas 1 Guantes de asbesto 2 Pipetas de 50 ml. Papel de film Papel Aluminio Ligas 1 Pinza de disección 1 Bisturí con manga 1 Marcador indeleble Pequeñas ramas jóvenes del material vegetal Reactivos:
Medio de cultivo MS (10X) (a) Agua destilada HCl 1M NaOH 1M Sacarosa Agua corriente (de la llave) Cloro comercial (6%)
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y MEJORAMIENTO VEGETAL
Desinfección y siembra de explantes i) Preparar una solución al 3% v/v de detergente líquido y agua corriente en un vaso de 250 ml no estéril. j) De las ramas de sauce, seleccionar segmentos que contengan nudos con yemas, cortarlas con las tijeras o cutter quitándoles las hojas y colocarlas dentro del vaso de precipitados con agua y jabón, lavarlos agitando constantemente durante 5 min y enjuagarlos con agua corriente. k) En campana de flujo laminar horizontal, colocar los explantes en la solución de alcohol al 70% durante un minuto, agitando constantemente. l) Con las pinzas previamente flameadas, transferir las hojas a la solución de cloro comercial al 3% durante 10 min, agitando constantemente. m) Con las pinzas flameadas y enfriadas, transferir los explantes a un contenedor con agua destilada estéril (hacer en total tres enjuagues de aproximadamente 5 minutos en c/u) a fin de quitar el exceso de cloro. Agitar constantemente. n) Con pinzas previamente flameadas y enfriadas, colocar los explantes sobre el vidrio de corte y con el bisturí, cortar los extremos quemados y fraccionar segmentos con al menos un nudo, procurando que el extremo inferior quede un poco más largo que los demás, pues es el que quedará inmerso en el medio de cultivo (procurar eliminar la yema apical en los segmentos donde exista, ya que esta acción promueve una mejor proliferación de las yemas axilares) o) Sembrar los explantes sobre el medio de cultivo de manera vertical procurando que el extremo inferior quede un poco inmerso en el medio de cultivo y respetando la orientación original que tenían en la planta (coloca 5 explantes por frasco). p) Tapar los frascos, sellarlos con plástico autoadherible y sobre la tapa rotular con un marcador indeleble escribiendo nombre, fecha, especie sembrada y número de práctica. q) Colocarlos en el área de incubación.
Figura 2. Desinfección y siembra de explantes. (Esquema: Fabricio Ociel del Toro).
6. RESULTADOS a) Porcentaje de explantes a partir de los cuales crecieron y se desarrollaron las yemas axilares. b) Promedio de yemas originadas por explantes sembrado in vitro. c) Identificar los microorganismos que crecieron como contaminantes (si los hubo), reportar el porcentaje de contaminación y proponer la causa de dicha contaminación.
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y MEJORAMIENTO VEGETAL
7. DISCUSIÓN
a) Si se utilizan como explantes segmentos de tallo que no contengan nudos, ¿se obtendrá crecimiento de yemas axilares? ¿Por qué? b) En las plantas dicotiledóneas las yemas axilares se localizan en la axila, que es la región donde se une la hoja con el tallo, ¿dónde se localizarán las yemas axilares en las plantas monocotiledóneas? c) La técnica conocida como “cultivo de meristemos” es una forma de proliferación de yemas, ¿en qué casos se recomienda hacer la técnica de cultivo de meristemos? d) ¿Podrá establecerse la proliferación de yemas axilares utilizando callo como explante inicial? e) ¿Por qué se requieren mayores cantidades de citocininas que de auxinas en la proliferación de yemas axilares?
