Capacitación HPLC chemstation, Apuntes de Química Analítica

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Introducción al uso de

HPLC Agilent con

Chemstation B.04.

Contenido del curso

1. PARTE 1

• Introducción a la cromatografía líquida. Principios

generales. Áreas de aplicación principales.

Componentes principales de un HPLC y su modo de

operación.

• Separación de picos. Mantenimiento del equipo y uso

adecuado.

2. PARTE 2

• Introducción al uso del software Agilent Chemstation

B.04.03.

3. PARTE 3 - PRÁCTICA

• Puesta en marcha del equipo con técnica del cliente.

Realización de calibración y corrida de muestras.

Qué es HPLC

• Es un tipo de cromatografía en la cual la FM está a alta presión generando así un análisis más eficiente.
• HPLC son las siglas en inglés de High Performance Liquid Chromatography (también High Pressure LC), es decir Cromatografía Líquida de alta performance.
• La columna es resistente a altas presiones y está empacada uniformemente con partículas de pocos um (FE).
• La FM pasa a través de la columna a alta presión gracias a la presencia de una bomba que lo permite.
• A la salida de la columna hay un detector. La señal que emite a lo largo del tiempo se denomina cromatograma.

Partes del equipo

1. Bomba: fuerza a la FM a pasar a través del equipo con un determinado flujo expresado en ml/min (normalmente entre 1 y 2). La presión alcanzada suele expresarse en bares (típicamente hasta 400bar).
2. Inyector: Su función es introducir la muestra (volúmentes en el orden de los pocos ul) en el sistema alterando lo menos posible la presión alcanzada por la bomba. La inyección puede ser manual o automática.
3. Horno de columna (opcional): aloja a la columna y mantiene constante una determinada temperatura.
4. Detector: Como su nombre lo dice, detecta las particulas que eluyen de la columna en función del tiempo. La detección es cuantitativa.
5. PC + software: Controla el HPLC, recibe la información del detector y permite procesarla para obtener tiempos de retención, componentes de la muestra (análisis cualitativo), cantidad de cada componente (análisis cuantitativo).

Análisis cualitativo

Análisis cuantitativo

La identificación de los componentes individuales de la muestra (ID) se realiza por lo general sabiendo su TIEMPO DE RETENCIÓN. Es el tiempo que toma a un componente específico eluir de la columna luego de la inyección de la muestra. Otros medios para determinar el ID dependiendo del detector usado es la estructura química, el peso molecular o algún otro parámetro molecular.

La medición de la cantidad de un componente de la muestra (concentración) se puede determinar a través del área debajo del pico correspondiente al componente en cuestión. Para conocer la relación entre la concentración y el área del pico, es necesario inyectar al menos una muestra con concentración conocida del componente deseado (estándar). Lo ideal es realizar una curva de calibración.

HPLC AGILENT 1200

CUATERNARIA

• Isocrática
• Binaria

AUTOMÁTICO

• Manual

VWD – LONGITUD DE ONDA VARIABLE

• MWD – longitud de onda múltiple
• DAD – arreglo de diodos
• RID – Índice de refracción
• FLD - Fluorescencia

Columnas

La elección de la columna adecuada es crítica para un correcto análisis cromatográfico. Tipos de columna:

• Analítica: Diámetro interno (i.d.) 1.0-4.6-mm; longitud 15 –250 mm
• Preparativa: i.d. > 4.6 mm; longitud 50 –250 mm
• Capilar: i.d. 0.1-1.0 mm; varias longitudes
• Nano: i.d. < 0.1 mm, a veces < 100 μm)

Empacado

• Las columnas están empacadas con partículas porosas de diámetro pequeño. Los tamaños más populares son 5um, 3.5um y 1.8um.
• Usualmente estas partículas tienen enlaces químicos es su superficie que interactúan con los componentes de la muestra para separarlos eficientemente. Ejemplo: C-
• El tiempo de retención de los componentes de la muestra dependen fuertemente del empacado (FE) y de la FM que intervienen directamente en las interacciones.

Tipos de separación

Control de la temperatura

en la columna y en los viales

• Fase reversa: La muestra y la FM

(agua, buffer, ACN, MeOH, etc.) son

polares.

• Fase normal: La muestra y la FM

(hexano, etc.) son no polar

• Intercambio de iones
• Exclusión por tamaño
• Reproducibilidad: El tiempo de retención depende de la temperatura.
• Solubilidad: Algunos compuestos químicos pueden tener baja solubilidad en la FM. Es fundamental mantener la solubilidad y que no cristalice dentro de la columna.
• Estabilidad: Algunos compuestos químicos, especialmente compuestos biológicos como encimas o proteinas pueden no ser estables a partir de ciertas temperaturas cercanas a la ambiente. Es necesario refrigerar el sistema.

Resolución (R)

La resolución (R) es la separación entre dos picos adyacentes. R=1.5 es el límite de resolución. Óptimamente R≥2. La resolución mejora cuando los picos son angostos (W están en el denominador). R depende de los tiempos de retención y el ancho del pico. Ambos parámetros dependen de N (eficiencia de columna).

Rs = 0.8 Rs = 1.0 Rs = 1.

Rs = 0.4 Rs = 0.5 Rs = 0.6 Rs = 0.

Simetría

Eficiencia

El ancho del pico decrece con el aumento de N, es decir, con partículas de menor tamaño, una columna más compacta.

Tamaño de partícula menor mejora resolución pero aumenta la presión. 400bar puede no ser suficiente. UPLC.

Evitar bloqueos

• FILTRAR!!!
• Las partículas que provocan los bloqueos provienen de:
  • Solvente, buffer
    • Filtrar FM con filtros de 0.45um.
    • Usar filtros de botellon y limpiarlos una vez al mes dejándolos 1 hora en HNO 3 35%.
    • Asegurarse que el buffer no precipite en las condiciones cromatográficas que se emplearán.
    • Purgar el sistema completo al finalizar el análisis luego de usar buffer o agua.
  • Crecimiento de microbios en capilares internos, filtros y botellones - Nunca dejar por mucho tiempo agua en botellones, degasificador, etc. Al menos durante el fin de semana dejar todos los canales en MeOH. - Cambiar solvente cada 2 días (no rellenar). - Muestra - Filtrar - Sellos del equipo - Anualmente se recomienda hacer un mantenimiento preventivo en el cual se cambiar los sellos.

Degasser

Hay dos modelos:

• G1279A: 1ml de volumen interno cada canal
• G1322A: 10ml de volumen interno cada canal.
  • Se puede purgar a 10ml/min.
  • Como tiene 10ml de volumen interno y los tubbings otros 2ml aproximadamente, a un flujo de 10ml/min es conveniente purgar al menos 2 minutos cada canal.
  • En el uso de gradiente de solventes es indispensable un degasificador en línea. Si se enciende la luz roja, el degasificador no está ejerciendo su función por lo que habrán problemas en el análisis como irreproducibilidad de tiempos de retención. Llamar a AGS para su reparación!
  • No dejar con agua por más de 5 días seguidos (evita crecimiento de microorganismos). No dejar con buffer por más tiempo de lo que dura el análisis (evita la precipitación de sales en el interior de las cámaras de vacío).

Reemplazos por el usuario

• Filtro de botellón
• Frita (ubicada en la válvula de purga de la bomba.
• Filtros en línea / precolumna
• Columna

Mantenimiento Preventivo anual: qué se

cambia en el inyector?

Otras consideraciones

• Es conveniente tener en stock para reemplazos rápidos

lámpara UV, cartucho AIV, frit, in-line filter, filtro de

solvente, loop de 100ul, capilares de 0,17mm i.d.

(identificados con color verde), peaks de plástico,

herramientas.

• El HPLC Agilent 1200 resiste pH de 1 a 12,5.
  • Para pH menor a 2,5 los solventes no deben tener

ácidos que ataquen el acero inoxidable (HCl)

• Para pH mayor a 9,5 dar aviso a AGS porque los

sellos de mantenimiento debes ser de otro material

(Tefzel o PEEK). Los filtros de solvente no deberán

ser de vidrio, sino de acero inoxidable. El cuarzo de

la celda se daña lentamente a pH alto, asegurarse

de purgar la celda al finalizar el análisis.