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Tesis de Posgrado
Caracterización de la hormona Caracterización de la hormona folículo-estimulante humana :folículo-estimulante humana : Relación estructura-función Relación estructura-función
Creus, Silvina Florencia
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Químicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.
Cita tipo APA: Creus, Silvina Florencia. (1999). Caracterización de la hormona folículo-estimulante humana : Relación estructura-función. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3209_Creus.pdf Cita tipo Chicago: Creus, Silvina Florencia. "Caracterización de la hormona folículo-estimulante humana : Relación estructura-función". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1999. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3209_Creus.pdf
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A mi familia,
a mis padres y mis hermanos
a Fernando,
y a nuestros hijos Florencia y Manuel
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Stella Campo por haberme guiado en mis primeros pasos en la investigación científica y por haberme brindado Ia oportunidad de realizar el presente trabajo de Tesis bajo su dirección. A la Dra. Selva B. Cigonaga por su valioso asesoramiento y colaboración durante Ia realización de este trabajo. A la Dra. Barontini y el Dr. Bergadá por su apoyo constante, y por brindanne el marco institucionaladecuado para desarrollar el presente trabajo de tesis. AIDr. Héctor Chemes por sus aportes en la discusión de los resultados y la revisión de este trabajo de Tesis. A la Dra. Silvia Gottlieb, por su permanente disposición en la evaluación clínica de los niños y su colaboración en la obtención de las muestras. AI Dr. Alfredo Ulloa-Aguirre, del Instituto Nacional de la Nutrición de Méjico, por la donación del material hipoflsario humano. Agradezco asimismo, el haberme brindado la posibilidad de conocer y trabajar en su laboratorio.
A la Dra. Eliana Pe/Iizzari,por su cooperación constante en la realización de los bioensayos de FSH.
A todos los integrantes del Centro de Investigaciones Endocrino/ógicas, por su colaboración en el trabajo diario. Finalmente, quiero agradecer a todas mis compañeras y amigas del Centro de Investigaciones Endocrinológicas, con quienes he compartido tantos seminarios y charias, los cuales han contribuido a mi formación científica y a la realización de este trabajo de tesis. Agradezco, además y sobre todo, el haber trabajado diariamente a su lado.
distintas condiciones fisiológicas demuestran que el entorno hormonal modifica las características estructurales de la molécula, regulando así su biopotencia y su tiempo de permanencia en circulación.Se postula que cada una de las variantes moleculares de esta hormona sería responsable de la inducción diferencial de una determinada respuesta biológica.
ABSTRACT
FSH is produced and secreted by the anterior pituitary gland. lt is closely involved in the regulation and maintenance of essential reproductive processes, as folliculardevelopment and testicular gametogenesis. This hormone is a heterodimen’c protein composed of two different subunits; each subunit bears two oligosaccharide chains attached to its polypeptide backbone. Although the oligosaccharide moieties share the same pentasaccharide core, they differ in their extemal carbohydrate structure, which includes completion, degree of branching and sialic acid content. Variations in the structure of the oligosaccharide chains result in the existence of a family of isoforms with different physicochemical and biological properties. FSH isofonns differ in their isoelectn'c point, receptor binding activity and plasma half-life. Sex and physiological condition of the donor will determine me relative abundance of the different isoforrns. Differences in sialic acid content of FSH isofon'ns have been considered the main deten'ninant of hormone
polymorphism since FSH heterogeneity was described. The aim of this Thesis was to analyse the polymorphism of FSH in human pituitaries as well as that of circulating FSH in different physiological conditions: the follicular phase of normal menstrual cycles, postmenopause and male puberty. This study was particulariy designed to determine the possible effects that changes in hormonal status may have upon the molecular and biological characteristics of this gonadotropin. Chromatofocusing was used to isolate pituitary FSH isoforrns according to their silaic acid content. Serial lectin chromatography was used to determine the distribution of different FSH isoforrns according to the inner structure of their carbohydrate chains. The relationship between the structure of the carbohydrate moiety of FSH isofon'ns and their capacity to produce a specific biologicalresponse on the target cell, was established. The biologicalresponse was determined using an ¡n vitrobioassay. The results obtained in this study demonstrate that the biopotency of the hormone is not only regulated by sialic acid content of FSH isoforrns but also by the inner structure of the carbohydrate chain. The characteristics of circulating FSH polymorphism determined in different physiological situations showed that changes in the hormonal status affect the proportion of circulating FSH isofonns bean‘ng different structures in their carbohydrate chains, thus modulating the hormone biopotency and plasma half-life.
ABP ACTH AMP AMPc
B/I B-FSH Con-A DAG DE DNA Dol DR E: EC FR FSH Fuc Gal GH Glc (2h¡rócidn
GnRH hCG l-FSH IP; LcH LH Man Manósido NAcGaI NAcGlc
ABREVIATURAS
proteína ligadora de andrógenos hormona adenocorticotrófica adenosina monofosfato adenosina monofosfato cíclico
asparagina
bioactividad / inmunoactividad FSH biológica Concanavalina A diacilglicerol
desvío estándar
ácido desoxirribonucleico dolicol isoforrnas débilmente retenidas estradiol edad cronológica isofonnas fuertemente retenidas hormona folículo estimulante fucosa
galactosa
hormona de crecimiento glucosa metiI-a-D-glucopiranósido hormona liberadora de gonadotrofinas gonadotrofina coriónica humana FSH inmunológica inositol tn'fosfato Iectina de Ienteja hormona luteinizante
manosa
metiI-a-D-manopiranósido N-acetilgalactosamina N-acetilglucosamina
NR
PA PBS pl PKC PM PRL PT
RER RNA S.A.
Ser
SFF
SHBG SPM
Thr TRH TSH UI VP
VTo VTu WGA
isoformas no retenidas progesterona pubertad avanzada buffer fosfato salino punto isoeléctrico proteina quinasa C pubertad media prolactina pubertad temprana isoformas retenidas reticqu endoplásmico rugoso ácido n'bonucleico ácido siálico
senna
suero de mujeres en fase folicular hormona ligadora de esteroides sexuales suero de mujeres postmenopáusicas
testosterona
treonina factor liberador de tirotrofina tirotrofina unidades internacionales vello pubiano volumen testicular volumen testículo derecho volumen testículo izquierdo aglutinina de germen de tn'go
- INTRODUCCION - 1.Eje“r “' “r” i, 4 ' - 1.1 Descn‘pción anatómica y funcional - 1.2 Regulación de la función del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal - 1.2.1 Control hipotalámico de la secreción de gonadotrofinas - 1.2.2 Control gonadal de la secreción de gonadotrofinas
- Gonadotrofinas y ciclo menstrual - 2.1 Fase folicular - 2.2 Fase owlatnn'a - 2.3 Fase Iútea - 2.4 Fase menstrual
- Gonadotrofinas y pubertad
- Gonadotrofinas y r ‘ r
- Estructura molecular y biosíntesis de gonadotrofinas - 5.1 Procesamiento de los oligosacáridos de la glicoproteinas - 5.1.1 Etapas iniciales - 5.1.2 Incorporación de fucosa - 5.1.3 Etapas finales - 5.2 Estructura de los oligosacáridos presentes en las glicoproteinas............................. - 5.3 Estructura de los oligosacáridos presentes en la molécula de FSH humana ..
- Función de los oligosacáridos en las glicup. ‘
- 6.1 Función de los oligosacáridos en las hormonas glicopr ‘ '
- 6.2 Significado fisiológico de la heterogeneidad de FSH
- 6.3 Regulación hormonal de la heterogeneidad de FSH
- Mecanismo de acción de FSH
- OBJETIVOS
- MATERIALES Y METODOS
- Materiales Bi "__,' índice
- 1.1 Extractos hipofisanos humanos
- 1.2 Sueros de mujeres postmermpáusir‘ns
- 1.3 Sueros de mujeres en fase folicular
- 1.4 Sueros de niños en distintos estadios del desarrollo puberal
- Drogas y reactiv
- Métodos
- 3.1 Caracterización de isoformas de FSH hipofisaria humana - 3.1.1 Cromatoenfoque - 3.1.2 Tratamiento de los análogos de carga I a V obtenidos por cromatoenfoque..... - 3.1.3 Determinación de l-FSH por radioinmunoensayo - 3.1.4 Determinación de bioactividad de FSH ¡n vitro - 3.1.5 Determinación de la relación bioactividad l inmunoactividad........................... - 3.1.6 Cromatografía en Concanavalina A - 3.1.7 Tratamiento del material obtenido por cromatografía en Con-A...................... - 3.1.8 Cromatografía en Aglutinina de Germen de Trigo - 3.1.9 Tratamiento del maten‘alobtenido por cromatografía en WGA........................ - 3.1.10 Cromatografía en Lectina de Lenteja - 3.1.11 Tratamiento del maten‘alobtenido por cromatografía en LcH........................ - y en la fase folicularde ciclos menstruales normales 3.2 Caracterización de isofonnas de FSH circulantes en la postmenopausia - 3.2.1 Tratamiento de los sueros - 3.2.2 Cromatografía en Concanavalina A - 3.2.3 Determinación de proteínas - 3.2.4 Determinación de inmunoactividad de FSH - 3.2.5 Determinación de bioactividad de FSH in vitro - 3.2.6 Determinación de la relación bioactividad / inmunoactividad........................... - 3.2.7 Determinación de esteroides en suero - desarrollo puberal en el varón 3.3 Caracterización de isofom'las de FSH circulantes en distintos estadios del - 3.3.1 Tratamiento de los sueros - 3.3.2 Isoelectroenfoque preparativo - 3.3.3 Tratamiento de las fracciones obtenidas por isoelectroenfoque - 3.3.4 Determinación de proteínas índice - 3.3.5 Determinación de I-FSH por radioinmunoensayo - 3.3.6 Determinación de bioactividad de FSH in vitm - 3.3.7 Determinación de Ia relación bioactividad / inmunoactividad........................... - 3.3.8 Cromatografía en Concanavalina A - 3.3.9 Tratamiento del material obtenido por cromatografía en Concanavalina A........ - en sueros de niños 3.3.10 Determinación de los niveles de gonadotrofinas séricas FSH y LH, - 3.3.11 Determinación de esteroides en suero
- Análisis ‘ 4' "
- Diseño Experimental (qul namas) - Caracterización de FSH hipofisaria (I) - Caracterización de FSH hipofisan‘a (II) - Caracterización de FSH en sueros de fase foliculary postmenopausia - Caracterización de FSH durante la pubertad masculina
- RESULTADOS
- Caracterización de isoformas de FSH hipofisaria L - humanos de acuerdo a sus puntos isoeléctn'cos 1.1 Distribución de FSH inmuno y bioactiva proveniente de extractos hipofisan’os - cadenas carboi-i-J ‘ 1.2 Distribuciónde los análogos de carga de acuerdo a la estructura interna de sus - 1.2.1 Cromatografía en Concanavalina A - 1.2.2 Cromatografía en Aglutinina de Gerrnen de Trigo - 1.2.3 Cromatografía en Lectina de Lenteja
- la fase folicular de ciclos menstruales normales 2. Caracterización de isoformas de FSHcirculantes en la postmenopausia y en
- 2.1 Perfil hormonal de las mujeres estudiadas
- 2.2 Cromatografía de afinidad en Concanavalina A - de acuerdo a la estructura interna de sus cadenas calmo?” ‘ 2.2.1 Separación de isoforrnas de FSH circulantes en mujeres postmenopáusicas
índice
4.2.1 Niveles de gonadotrofinas sén’cas luego del estímulo con GnRH.................. .. 101 4.2.2 Efecto del GnRH sobre los análogos de carga de la FSH circulante en la pubertad media 102 4.2.3 Efecto del GnRH sobre la bioactividad y la distribución de isoformas de FSH de acuerdo a la estructura interna de sus cadenas carbohidratadas.. 104 4.3 Pubertad avanzada 105 4.3.1 Niveles de gonadotrofinas séricas luego del estimqu con GnRH.................. .. 105 4.3.2 Efecto del GnRH sobre los análogos de carga de la FSH circulante en la pubertad avanzada 105 4.3.3 Efecto del GnRH sobre la bioactividad y la distribución de isoformas de FSH de acuerdo a la estructura interna de sus cadenas carbohidratadas ....... 107 4.4 Análisis comparativo de Ia distribución de análogos de carga de FSH en los distintos estadios de la pubertad en varones 108 4.5 Análisis comparativo de la distribución de isoformas de FSH de acuerdo a la estructura interna de sus cadenas carbohidratadas en los distintos estadios de la pubertad en varones 108
DISCUSION 1 1 1
CONCLUSIONES 136
Posible significado fisiológico de la heterogeneidad de FSH 137
BIBLIOGRAFIA 140
Introducción
Introducción
Hipotálamo
Núcleo supra-óptico
Quiasma ópfico--. (^4) _:-: ' (^) /j Material neurosecretorio Arteria supra-óptica Vasos porta ' Saco hipofisario
- Lóbuloposterior de la hipófisisLóbuloanterior -^ de ¡a hipófisis
FIGURA 1: Esquema del eje hipotálamo-hipofisario
Introducción (pars intermedia) y un lóbulo posterior o neurohipófisis. El lóbulo posterior de la hipófisis es de origen neural y está constituido por axones y terminaciones de neuronas cuyos cuerpos celulares residen en distintos núcleos del hipotálamo. La hipófisis anterior constituye los dos tercios de la glándula y está formada por células que se clasifican de acuerdo a sus productos de secreción en: somatotropos (células secretoras de hormona de crecimiento, GH), lactotropos (secretoras de prolactina, PRL), tirotropos (tirotrofina. TSH), corticotropos (secretoras de hormona adenocorticotrófica, ACTH, y péptidos relacionados) y gonadotropos (secretoras de LH y FSH). FSH y LH regulan el crecimiento, diferenciación y funcionalidad del ovario y del testículo.
El ovan'o cumple la función de sintetizar estrógenos y progestágenos y la de producir ovocitos fertilizables. La principal promotora de la maduración folicular es la FSH que actúa sobre las células de la granulosa. La LH estimula la producción de andrógenos por las células de la teca y participa en la ovulación, causando la ruptura del folículo preovulaton'o y la liberación del ovocito. Luego de la ovulación, las células foliculares se Iuteinizan dando lugar a la formación del cuerpo lúteo. La función principal del testículo es la producción de espermatozoides y la síntesis de andrógenos. Los testículos están constituidos por dos compartimientos: los túbulos seminíferos, donde se desarrolla la espermarmatogénesis, y el tejido intersticial, donde se produce la síntesis de andrógenos. En los túbulos seminíferos las células de Sertoli, reguladas por la FSH, constituyen el soporte nutricional y estructural de las células germinales. El adecuado funcionamiento de estas células es el que permite el normal desarrollo de la espermatogénesis. La función de la célula de Sertoli se encuentra así mismo regulada por la testosterona que es producida en las células de Leydig bajo el control de la LH.
1.2 Regulación de la función del eje "',_ All^ L.^ r A,^ i, _I I
La secreción de LH y FSH depende de la interacción de dos componentes regulatorios, el hipotálamo, a través de la secreción de GnRH, y las gonadas, a través de la secreción de péptidos y esteroides (Figura 2).
