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2.4 CINÉTICA DE LAS REACCIONES MICROBIANAS
Los microorganismos unicelulares como bacterias y levaduras, son capaces de catalizar biorreacciones de la forma:
→ Sin embargo, a diferencia de las reacciones enzimáticas en las reacciones microbianas, la concentración del catalizador es decir la biomasa, no permanece constante a lo largo de la reacción. Las reacciones en la que la concentración del catalizador se incrementa son denominadas reacciones autocatalíticas, siendo las reacciones microbianas por lo general de este tipo. En la cinética de una reacción microbiana pueden identificarse cuatro etapas, tal como es muestra en la Figura 1.
Figura 1. Etapas de la cinética de una reacción microbiana Fase I de adaptación celular. Esta fase también es denominada lag y en ella el microorganismo activa las rutas metabólicas que le permitirán utilizar al substrato como fuente de carbono y energía. A excepción de la glucosa (substrato en el que la ruta metabólica de la glucolisis siempre se encuentra activa) para cualquier otro substrato siempre se presenta un fase de adaptación.
Fase II exponencial de crecimiento celular. En esta fase no existe limitación de substrato y soporta un crecimiento exponencial de la biomasa. Cuando el producto se forma en esta fase se denomina asociado al crecimiento. Fase III mantenimiento celular. En esta fase el substrato no es suficiente para soportar el crecimiento exponencial y las tasas de generación y muerte celular son iguales. Cuando el producto se forma entre las fases II y III se denomina parcialmente asociado al crecimiento. Fase IV decaimiento celular. En esta fase la concentración de substrato es tan baja que ya no es utilizado por el microorganismo y la tasa de muerte celular es mayor a la de generación celular. Cuando el producto se forma en la fase III se denomina no asociado al crecimiento. El sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias que describen la cinética de la reacción microbiana para la biomasa, el substrato y el producto desde la fase I de adaptación hasta la IV de decaimiento celular son las siguientes:
= = ∙ − ∙ ; ^ = 0 = (^) − − − 1
La ecuación (1) es la velocidad de crecimiento de biomasa o rx en g/L h, donde x es la concentración de biomasa en g/L, μ es la velocidad específica de crecimiento de biomasa en h-1^ y kd es el coeficiente de decaimiento celular en h-1.
= ^ = −
∙ − ∙ ; ^ = 0 = − − − 2
La ecuación (2) es la velocidad de consumo de substrato o rs en g/L h, donde s es la concentración de substrato en g/L, Yxs es el rendimiento biomasa substrato en g/g y mx es el coeficiente de mantenimiento celular en g/g h.
= ^ =
⎩^ ⎪
⎪^ ⎧
Las ecuaciones en (3) representan la velocidad de formación de producto rp en g/L h en la que el producto P en g/L esta asociado, parcialmente asociado y no asociado al crecimiento de biomasa, Ypx es el rendimiento del producto formado por la biomasa asociada al crecimiento en g/g, α es el
B = 1
12
∴ 12 =^1 B − − − 8
= 3 E
12
∴ 3 E = ∙ 12 − − − 9
Figura 2. Linealización de la ecuación de Monod para la estimación de μ max y KM a partir de datos del inverso de la velocidad contra el inverso de la concentración por el método diferencial. Para utilizar la ecuación linealizada de Monod es necesario tener los valores de la velocidad específica de crecimiento a diferentes concentraciones del substrato. Asumamos que se disponen de los datos cinéticos experimentales de biomasa, substrato y producto para una cinética microbiana a partir de la etapa I hasta la etapa IV como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Datos experimentales cinética microbiana etapa I a IV tiempo ( t ) Biomasa ( X , g/L)^ Substrato ( S, g/L)^ Producto ( P , g/L) 0 X 0 S 0 0 t 1 X 1 S 1 P 1 t 2 X 2 S 2 P 2 t 3 X 3 S 3 P 3 t 4 X 4 S 4 P 4
- • • •
- • • •
- • • • t i-1 X i-1 S i-1 P i-
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.
1/μ
1/S
m = b = ⊗ ⊗
⊗
⊗ ⊗
⊗
⊗ ⊗ Datos transformados
t i X i S i P i t i+1 X i+1 S i+1 P i+
- • • •
- • • •
- • • • tn -1 Xn -1 Sn -1 Pn - tn Xn Sn Pn Para la etapa II de crecimiento exponencial de la biomasa se tiene que:
= ∙
Despejando la velocidad específica de crecimiento:
=^1
Utilizando diferenciación numérica (métodos numéricos), aplicando una diferencia centrada para la i-esima concentración de biomasa ( Xi ) podemos obtener una aproximación de su i-esima velocidad de crecimiento ( μ i ) a partir de los datos experimentales mediante:
G =
G
H GI =^1
G
H GJK^ −^ G:K
GJK −^ G:K
I − − − 10
Para utilizar la ecuación (10) es necesario que los datos sean de la etapa II de crecimiento exponencial con un numero igual o mayor a diez (para generar al menos cuatro valores de la velocidad de reacción). Así, con los datos experimentales de la etapa II de la Tabla 1 y la ecuación (10) se construye la Tabla 2 , la cual proporciona los valores de velocidad a las diferentes concentraciones de substrato para estimar los parámetros cinéticos μ max y Ks acorde a la ecuación linealizada de Monod.
Tabla 2. Valores de velocidad de crecimiento a diferentes concentraciones de substrato estimados a partir de los datos experimentales de una cinética microbiana por diferencias finitas Si Xi Velocidad especifica de crecimiento μ i S 1 X (^1) K = 1 K
H L^ −^
L −^
I
S 2 X 2 L = 1
L
H M^ −^ K
M −^ K
I
S 3 X 3 M = 1
M
H N^ −^ L
N −^ L
I
Figura 3. Linealización de las ecuaciones de rendimiento para su determinación por regresión lineal. ( a ) Regresión lineal para la determinación de Yxs ; ( b ) regresión lineal para la determinación de Yps. Los datos deben ser tomados de la etapa II de la cinética microbiana. En el caso de producto esta linealización es válida cuando esta asociado al crecimiento. En el método integral , también deben utilizarse los datos experimentales cinéticos de X y S con el tiempo ( Tabla 1 ), pero hasta la Fase II. El método integral se basa en la solución de la ecuación diferencial de velocidad de consumo de substrato generada con Monod, la que posteriormente es linelizada para determinar los parámetros cinéticos Ks y μ max. Para el método integral, el valor del rendimiento Yxs debe ser conocido previamente a partir de los datos experimentales.
Considerando únicamente hasta la Fase II de crecimiento exponencial, la ecuación de velocidad de consumo de substrato vendrá dada por:
= ^ = −
Substituyendo para la tasa específica de crecimiento μ la expresión de Monod (ecuación 4), y para la biomasa la ecuación dada a partir del rendimiento biomasa-substrato Yxs (ecuación 11), entonces la ecuación de velocidad de consumo de substrato puede escribirse como:
= ^ = − H 3 12^ ∙ + ^
I ^ + ^ −
Separando variables e integrando:
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.
X
( S 0 -S )
m = Yxs b = X (^0) ⊗ (^) ⊗ ⊗
⊗ ⊗
⊗
⊗ ⊗^ Datos transformados
(a)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10
P
( X-X 0 )
m = Ypx ⊗
⊗
⊗
⊗
⊗
⊗
⊗
⊗ Datos transformados
(b)
12 ∙ Q + − R = −
S ^ ∙ 3^ + ^ ∙
12 ∙ Q^ + − R^
; ;T
= − S
U
S (^) ^ ∙ 3^ + ^ ∙ 12 ∙ Q^ + − R^
; ;T
Para resolver la integral debe utilizarse el método de integración por fracciones parciales , lo que permite descomponer el término al interior de la integral en:
∙ 3 + ∙ (^) 12 ∙ Q (^) + − R =^
12 ∙ +^
V
Q + − R
Multiplicando la ecuación por el denominador del lado izquierdo de la igualdad: ∙ 3 + ∙ = "Q (^) + − R + V (^) 12 ∙ Para un valor de S =0, la ecuación anterior se reduce a: ∙ 3 = "Q^ + ∙ R Despejando A :
" = ^ ∙ 3 + ∙ Mientras que, para un valor de S = S 0 la ecuación toma la forma: ∙ 3 + ∙ = " ∙ (^) + V ∙ (^) 12 ∙ Substituyendo la expresión de A y despejando a B :
∙ 3 + ∙ = ^ ∙ ^ ∙ 3 + ∙
+ V ∙ 12 ∙
V = ^ ∙ 3^ + ∙ ^ ^ + ^ ∙ −^ ^ ∙ ^ ∙ 3
+ ^ 12 ∙ ^
V = ^ ∙ ^ ∙^ ^ +
L ∙ 3 ∙ + L ∙ L
V =
12^ +
La ecuación (13) puede ser linealizada al dividirla entre ln S 0 / S donde:
= ^ ∙ 3
12 ^ - ∙ ^
^ -
12 ^ - ∙
(* ]^ - ^
Denominando para la regresión lineal :
`
a
(* ]^ - ^
Figura 4. Linealización de la ecuación resuelta de Monod en la velocidad de consumo de substrato para la determinación de Ks y μ max.
Se tendrá una recta donde la pendiente ( m ) y ordenada al origen ( b ) vendrán dadas por:
^ - 3^ - 12 ^ - ∙
B ^ ∙ 3 12^ - ∙
Resolviendo el sistema de ecuaciones de m y b para Ks :
(^3) ^ - ^ ∙ b1 - B c
Con el valor conocido de Ks , el valor de μ max se determina a partir de la ordenada:
12 =^
B + ∙ − − − 16
Con los valores de los parámetros cinéticos ( Ks , μ max ) y los rendimientos ( Yxs , Ypx ) se pueden diseñar reacciones microbianas hasta la Fase II (crecimiento exponencial), mediante simulaciones de la cinética microbiana mediante la solución del sistema de EDOs, utilizando programas como Matlab, Octave y Polymath. Además, determinados los parámetros anteriores, y conocidos datos experimentales en las Fases III (mantenimiento celular) y IV (muerte celular), pueden determinarse los demás parámetros ( kd , mx , α y β) mediante ajuste de los datos experimentales al modelo dado por el sistema de EDOs.
