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informe de laboratrio en el cual se hace ub conteo de levadura
Tipo: Tesis
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Nathally Valencia Maria Paula Osorio Carmen Ibaguen Juan Esteban Angucho Ronald Alejandro Alvarado Valentina Davila Sena – Centro ASTIN Tecnólogo en Química Aplicada a la Industria Ficha: 2186404 Correo-e: nvalencia536@misena.edu.co mposorio754@misena.edu.co, jeangucho8@misena.edu.co, vdavila49@misena.edu.co , clibarguen2@misena.edu.co , raalvarado03@misena.edu.co. RESUMEN: El crecimiento microbiano se define como el incremento de células de una determinada población , dicho crecimiento se da a partir de ciertas condiciones del cultivo y el medio ambiente ( temperatura, nutrientes,ph, tiempo ),este comportamiento se puede ver mediante una gráfica en donde se puedan identificar una serie de fases latencia,exponencial,estacionaria y de muerte en función del tiempo.la práctica tiene como finalidad aplicar la técnica de recuento microbiano en una levadura comercial s (Saccharomyce cerevisiae) mediante el conteo de células presentes en dicha levadura usando la cámara de neubauer la cual permitirá la construcción de una curva en la que se pueda observar las fases mencionadas anteriormente en dicha levadura en un laps Palabras claves: Células, levadura, recuento, cámara de Neubauer, soluciones, microbiano, curva de crecimiento. INTRODUCCIÓN Los microorganismos presentan un crecimiento por factores, tanto nutricionales como ambientales, por lo tanto, bajo condiciones controladas y óptimas en el laboratorio, es posible generar una curva de crecimiento que es característica para cada especie de microorganismo, se tiene la fase de adaptación o latencia, la cual es el intervalo en el que la levadura se adapta al medio en el que está presente. Continúa con la fase de crecimiento o exponencial la cual es el periodo de tiempo en el que la población de microorganismos se duplica. Prosigue con la fase estacionaria la cual se presenta cuando termina la fase de crecimiento, debido a que se agotan los nutrientes, no hay aumento ni decrecimiento del número de células en esta fase. Por último, está la fase de declinación o muerte, en la cual los microorganismos empiezan a morir. (Madigan et al., 2015). El método para cuantificar células se realizó mediante la cama neubauer estaba en un medio líquido, esta cámara tiene la ventaja de dar el cálculo rápido del número de microorganismos presentes. (Rojas Triviño, 2011). Se representa la curva de crecimiento del hongo de la levadura (Saccharomyce cerevisiae) , la levadura requiere de condiciones ambientales específicas para que tengan un comportamiento creciente, estas condiciones deben ser controladas y óptimas dentro del laboratorio. Con el fin de determinar la curva de crecimiento microbiano de la levadura, con la cámara de Neubauer ya mencionada. MÉTODOS Y MATERIALES. Se preparó 200 mL del medio de cultivo que contiene 100 g/L de glucosa, 5 g/L de sulfato de amonio, 3 g/L de
inoculación verificando que su pH estuviese entre 4,0 y 5,0, después de obtener el pH adecuado se llevó al
una solución salina (isotónica), posterior a su activación se realiza una verificación en el microscopio de viabilidad, luego se agrega al medio 1 g de levadura y se pone en agitación constante durante 24 h en el agitador orbital a temperatura ambiente. Para el conteo tomamos una gota de la suspensión de células del apartado anterior, posterior a esto depositamos en las cuadrículas de la cámara de neubauer, tener en cuenta que se le adiciona una gota de azul de metileno, la cámara es colocada en el microscopio el cual este se ajustó al objetivo de 10X con el fin de enfocar el cuadro grande de la cámara, ya enfocada pasamos al objetivo de 40X, luego se procedió al conteo de las células, realizamos de manera diagonal el conteo en los cuadros medianos, ya obtenido el conteo se tomo la ecuación 1. para determinar el # de células/mL. Ecuación 1. Determinación de la concentración celular. En la preparación del mosto se realizó el balance de materia para calcular las cantidades requeridas para preparar el medio de cultivo en 1000 g que contenga el 23% en peso del zumo de piña y aproximadamente 18 °Brix; para esto se utilizó 615.76 de agua destilada, 230 g de zumo de piña y 154 g de sacarosa que fueron necesarios para ajustar el medio de cultivo a los °Brix requeridos, ya que el zumo de piña se encontraba en un promedio de 11.2 °Brix. Luego se calculó los nutrientes menores de sulfato de amonio y ácido cítrico necesarios los cuales dieron valores de 0.5 g y 1.5 g respectivamente. Finalmente se verificó el pH del medio teniendo en cuenta que este se encontrara entre 4.5 y 5.0, se comprobó que el pH inicial se encontraba dentro del rango establecido por lo cual se agregó 2 g de Carbonato de Calcio, por consiguiente esto incrementó el pH a 4. quedando dentro de lo estipulado. Durante la inoculación del medio con levadura ( Saccharomuces cerevisiae ), se tomó 12,4 mL de inóculo para luego adicionar a 250 ml del medio previamente preparado en el paso anterior, es importante tener en cuenta que la concentración de la levadura debe ser de 3,0x10-7. Se determinó el volumen necesario para que 250 mL de medio de cultivo contenga una concentración inicial de 1x10-7 Células/mL, esto se depositó en un frasco tapa rosca, el cual se mantuvo a una temperatura entre 25 y 30 °C. En este punto se tomó una muestra de 2 mL y con la ayuda de un gotero se tomó una muestra para ser adicionada a la cámara de Neubauer, agregando una gota de azul de metileno, que facilita la identificación de células vivas y muertas y se llevó al microscopio para el conteo (ver figura 1), se registran los datos del conteo y la hora la cual será designada tiempo cero (0) que será el inicio de la incubación, a partir de este conteo la actividad tuvo un tiempo de duración de 5 horas y en cada intervalo de conteo se tuvo en cuenta una diferencia de 46 minutos. Con los resultados obtenidos se logra evidenciar las primeras 3 fases de la curva de crecimiento (Ver figura 2).. Figura 1. Conteo de Levadura en la cámara de Neubauer. Fuente: Elaboración propia.
Figura 3. Curva de crecimiento corregido Fuente: Elaboración propia En base a los resultados obtenidos se puede ver que el método de recuento en cámara de Neubauer tiene un mayor número de errores sistemáticos por parte del analista asociados a la metodología, en la inoculación, a la preparación de la disoluciones y el recuento en cámara, otro factor importante es el tiempo en el cual se realiza la curva, ya que no fue posible llegar a la fase de muerte. Se puede deducir que a pesar de ser un método en el cual puede haber muchas variaciones en las medidas es muy usado en el campo, ya que en él se logra observar todas sus fases a diferencias de otros métodos planteados por la literatura. CONCLUSIÓN
Silvia, B. y Cecilia, S. (s.f). Catedra Microbiologia Agricola. Crecimiento Bacteriano. volumen 3, 1 - 8. http://www2.fca.uner.edu.ar/files/academica/deptos/catedras/microbiologia/unidad_3_crecimiento_bacteriano.p df Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H., & Stahl, D. A. (2015). Brock. Biología de los microorganismos (Pearson (ed.); 14th ed.). Rojas Triviño, A. (2011). Conceptos y práctica de microbiología general. In Universidad Nacional de Colombia. http://bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf ANEXOS