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Determinación de la actividad enzimática de la
hexosaminidasa en fluidos biológicos
Marlén Rodríguez ', Angela Sánchez ', Mónica A. Gutiérrez 2, Antonio J. Bermúdez
Resumen
Este estudio describe un método electroforético que emplea el sustrato fluorogénico 4- metilumbelliferil 2-acetamida 2-deoxi-O-D-glucopiranosido, para la determinación enzimática de la hexosaminidasa (HEX) en linfocitos de sangre periférica, líquido amniótico, suero y orina. Se propone que la electroforésis sirva como método confirmatorio del diagnóstico de la gangliosidosis GM2, ya que permite determinar la actividad enzimática de la HEX y hacer la diferenciación de las isoenzimas (HEX A y HEX 8). La deficiencia de estas isoenzimas se detecta por disminución o ausencia de fluorescencia. Summary This study describes a method, that uses electrophoresis for the enzyme hexosamini- dase (HEX), the substrate 4-metil-umbelliferyl 2-acetamide 2-deoxi-beta-D- glucopiranoside. We used samples from serum, urine and amniotic fluid, frorn normal people. We propose this method could be used as diagnostic for gangliosidoses GM2, because of the sensibility for the detection of isoenzymes HEX A and HEX B, and the capability to detect differences in fluorescence.
La hexosaminidasa (HEX) pertenece a la familia enfermedad poseen actividad de HEX A
de las hidrolasas: esta enzima está rese ente en deficiente. oero. la HEX~ ~ ~,, , B es normal (2.~. 3.. 9).,
los lisosomas de todas las células nucleadas
del organismo (1, 2). b,^ En^ la^ de^ Sandhofi^ o^ variante^ O,
se presenta una mutación en el gen La degradación lisosomal de la p-N- (cromosoma 5) que codifica para la acetilgalactosamina terminal del gangliósido subunidad P Estos pacientes tiene deficien-te GM2 requiere tres polipéptidos genéticamente actividad de HEX A y. B (2,. 3, 9).
distintos; las subunidades & y p de la HEX A y la
c. La variante AB de la gangli~sidosis GM proteina activadora GM2. Un defecto en alguno
resulta de un defecto en el cromosorna 5, en
de los tres genes puede deteriorar el el gen que codifica para la proteina catabolismo del gangliósido (2-8). (^) activadora. Estos ~acientestienen activa la Se presentan tres tipos de gangliosidosis GM2: HEX A y HEX B, pero, el catabolismo de a. Enfermedad de Tay-Sachs o variante B; GM2 es deficiente (2, 3, 9). causada por una mutación en el cromosoma Hasta el momento, se han encontrado más de 15, en el locus que codifica para la subunidad cuarenta mutaciones alélicas diferentes en el lo- a de la HEX A. Los individuos con esta cus^ de la subunidad^ a^ como responsables de
' Universidad de los Andes, Santa Fe de Bogotá.
Laboratorio de Genética, Instituto Nacional de Salud, Santa Fe de Bogotá.
RODRIGUEZ M.. SANCHEZ A,. GUTIERREZ M.A.,BERMU0EZA.J.
enfermedades clínicamente diferentes. Todas del Instituto Nacional de Salud (18). Los fibro- están caracterizadas por disminución o ausen- blastos se lavaron^ y^ resuspendieron en solución cia de actividad de la HEX A (10-14). salina^ 0.85%:^ la liberación de las enzimas se realizó por sonicación y se analizó el sobre- Para la determinación de HEX, se han descrito técnicas electroforéticas que emplean el sustra- to sintético 4-metilumbelliferil 2-acetamida 2 Se ensayaron diferentes tiempos de sonicación, deoxi p-D-glucopiranósido. Al hidrolizarse este los cuales variaron entre 2 y 30 segundos, con sustrato, se libera N-acetilglucosamina, forman- un número de pulsos que osciló entre dos^ y^ tres. dose 4-metilumbelliferona (fluorescente). Las bandas se visualizan a 366 nm (2,8, 15). En el presente estudio, se establecieron las condiciones óptimas para determinar la actividad enzimática de la HEX en diferentes fluidos biológicos de individuos normales. Materiales y métodos Se seleccionó una población de 15 individuos normales, de diferente edad, de ambos sexos y sin antecedentes personales ni familiares de patologías genéticas. Se tomaron 10 mL de sangre periférica heparinizada. Se recogieron 10 mL de la primera orina de la mañana, chorro
Análisis electroforético La concentración del gel de agarosa inicial- mente fue al 1% (la), donde sólo se observó separación anódica; por tal motivo, se ensayaron geles de agarosa al 0,8 y 0,7% en solución amortiguadora de Tris 0,008 Miácido cítrico 0,004 M, pH 5,7. Se sembraron 5, 10, 20 y 40 microlitros (pL) del sobrenadante obtenido después de la sonicación de linfocitos de sangre periférica, linfocitos cultivados y líquido amniótico; 5, 10 y 25 pL de suero y 10 pL del control de migración constituido por albúmina bovina al 0,05% con azul de bromofenol como indicador. Se ensavaron tiemuos de mioración
medio. La obtención del Iíquido amniótico de 2.-, 3 - 2 3.5 -.- horas.'
(aproximadamente, 20 a 40 mL) fue mediante
amniocentesis asistida por ecografía y enviada El revelado se hizo utilizando el substrato
dirnrtamnntn -..--.-...-...- al -, lshnrstnrin .---,-.-, .v. sintético 4-metilumbelliferil^2 acetamida-2 deoxi
p-D-glucopiranósido en concentración de 0, Obtención y procesamiento de leucocitos (^) miliqramos en 1 uL de solución amortiguadora La capa de leucocitos se separó de la sangre 10- de^ sitrato^ 0 , l^ M,^ pH^ 4,5.^ Se le adicionó la tal centrifugación;a ésta se le mezcla de substrato al gel^ y^ se dejó reaccionar
agua destilada para hemolizar los hematíes, L~ a 37°C durante 30 min. Para frenar e intensificar
isotonicidad se devolvió con solución sal,na la reacción, el gel se colocó en una cámara de
,,as%, L~ liberación de las intra- amoníaco por 2 horas. La identificación se
lisosómicas se hizo por disrupción con realizó en cámara de luz ultravioleta para
caci~n,Posteriormente, se centrifugó y se utilizó visualizar^ las isoenzimas como bandas brillantes el sobrenadante para la cuantificación de la a 366 nm. enzima (16). Resultados Los linfocitos se cultivaron seaún el urotocolo Los resultados de la estandarización de la descrito por Silva et al. (17). ~ e s p u k sde (^72) sonicación se observan en el cuadro 1. horas de incubación, se lavó el pellet con Análisis electroforético solución salina 0,9% y se continuó el mismo procedimiento que los linfocitos de sangre La cantidad de muestra se modificó de acuerdo oeriférica sin cultivar. con el fluido biolóaico aue se estuviese
Cultivo de fibroblastos
analizando (cuadro 4.LOS' resultados de los
ensavos, aue evaluaron las condiciones. óutimas
Se efectuó según la técnica estandarizada para de voltaje e intensidad para la determinación de líquido amniótico en el Laboratorio de Genética la enzima se muestran en el cuadro^ 3.^ Al
RODRlGUEi M., SANCHEZ A., GUTIERREZ M.A., BERMUDEZ A J
Cuadro 4. Resumen de las condiciones óptimas para la separación electroforética de la HEX.
LA FLB L LC OR SR
Concentración del gel 0,7% Sonicación 2~15s Cantidad de muestra 40 p Voltaie lvoltios) 200 lnteniidad (mÁ) 8 8 8 8 Tiempo 3h 30m 3h 30m 3h 30m 3h^30 m
LA: liquido amniótico LB: fibroblastos L: linfocitos LC: l i n l o ~ i t o ~cultivados OR: orina SR: suero p: pulsos h: horas m: minutos (-): no se pudo analizar electrofaréticarnente.
Discusión las isoenzimas se puede detectar por la
Se utilizaron voltajes e intensidades bajas, como ausencia total o parcial de la fluorescencia, lo recomienda la literatura (19), obteniéndose usando siempre controles normales. Esto se migraciones lentas y difusas. Se realizaron aplica como método confirmatorio de diagnóstico
pruebas aumentando el voltaje y la intensidad, de la enfermedad de depósito lisosómico, pero, con mala resolución y sobrecalentamiento. gangliosidosis^ GM2. s e decidió dejar como voltaje óptimo aquél que produjera buena definición de bandas y baja producción de calor. Según los trabajos realizados por Mosses et al. (20), se recomienda para la migración y separación de las isoenzimas un tiempo de 3 horas y 30 min, en el cual se observó buena resolución de bandas tanto anódicas (HEX A) como catódicas (HEX B). El riesgo al incrementar el tiempo es que la enzima se degrade; sin embargo, esto no se observó aun con este largo tiempo de migración, en el cual iueaa ~ a ~ e ldecisivo el sistema de refrigeración. Los resultados obtenidos con 40 pL concuerdan con lo informado por Harris (19), cantidades menores de muestra fueron insuficientes para visualizar las dos bandas, excepto para fibroblastos en los cuales bastan sólo 20 pL para producir buena fluorescencia. En todas las pruebas realizadas, se observó una mayor cantidad de la enzima en fibroblastos cultivados de líquido amniótico que en los otros fluidos biológicos; por esto, la cantidad de muestra necesaria fue menor. Conclusiones La electroforesis sirve para determinar la actividad enzimática de la hexosaminidasa y permite hacer la diferenciación de las isoenzimas (HEX A y HEX E). La deficiencia de
Como los fibroblastos mostraron una buena definición de bandas y fluorescencia intensa, se puede utilizar la electroforesis en el diagnóstico prenatal de enfermedades con deficiencia de la hexosaminidasa. El substrato sintético específico 4-metilumbe-
lliferil 2-acetamida 2-deoxi fl -D- glucopiranósido,
empleado en este estudio, es una excelente opción para determinar cualitativamente la actividad enzimática de la hexosaminidasa, por su disponibilidad, pureza, sensibilidad y fácil manejo. ~ecomendaciones Como la actividad de la enzima es directamente proporcional a la intensidad de la fluorescencia de la bandas electroforéticas, se puede efectuar un análisis cuantitativo a través de densitometría. Referencias
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ACTIVIDAD ENZlMATlCA DE L A HEXOSAMINIDASA
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