EXTRACCION DEL ADN:DIFERENTES TECNICAS, Apuntes de Biotecnología

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Carrera: LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA Trayecto curricular: Ciclo de Formación Inicial Período: 2º Cuatrimestre – Año 1 - 2021

EXTRACCIÓN “CASERA” DE ADN CROMOSÓMICO DE CÉLULAS DE LA

MUCOSA BUCAL Y DE BANANA.

Procedimiento para extracción de ADN de células de la mucosa bucal:

1. Hacer buches durante 20 segundos con aprox. 10 ml de agua mineral. Depositarlo en un falcon de 50 ml (sin tocar con los labios!!)
2. Agregar al agua del buche media cucharadita de sal y 1 ml del shampoo diluído 1 / 3
3. Mezclar suavemente durante 5 minutos con la varilla. Mientras preparar un falcon con 20 ml de Etanol 96 %.
4. Agregar suavemente por volcado el Etanol a la mezcla, se forman dos fases pero mezclando suavemente van apareciendo los precipitado de DNA
5. Dejar reposar unos minutos y el precipitado se va a la superficie de donde se puede recuperar con una varilla.

ELECTROFORESIS EN

GEL DE AGAROSA

¿Qué es la electroforesis? Es el movimiento de partículas cargadas al ser sometidas a un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga neta positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis , los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo.

¿Para que se utiliza la electroforesis en el laboratorio? Para separar macromoléculas en solución, en forma analítica (es decir, sólo para verlas) o preparativa (para purificarlas). Los ácidos nucleicos tienen un fosfato cargado negativamente por cada nucleótido. Como el peso molecular de los cuatro nucleótidos es similar, la relación q/m es independiente de la secuencia y el tamaño de la molécula. Por lo tanto, la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquier molécula de ácido nucleico. La única diferencia en velocidad de migración estará dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea de su forma y de su tamaño.

Para lograr una separación eficiente, se utiliza un medio soporte que aumente considerablemente la fricción recibida por las macromoléculas y reduzca la difusión a un mínimo. Este medio suele ser una red molecular de algún polímero orgánico, conocida como gel, por su consistencia gelatinosa. Las mezclas de DNAs de distinto tamaño se hacen migrar (correr, en la jerga de laboratorio) a través del gel durante un cierto tiempo y se obtiene una separación en la que la distancia migrada por una molécula dada es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular (o de su longitud en pares de bases). El tamaño de una muestra incógnita puede estimarse corriendo en paralelo muestras de longitud conocida.

En el caso del DNA plasmídico, dentro de la bacteria se encuentra en conformación circular superenrrollada. Sin embargo, si se rompe un enlace fosfodiéster en una de las hebras pueden obtenerse moléculas circulares abiertas donde se ha perdido el superenrrollamiento; si la ruptura se da en las dos hebras de la cadena, la misma queda como fragmento lineal. Estos dos casos pueden darse por fragmentación mecánica durante la extracción del DNA plasmídico, por lo que nuestra preparación podría contener una mezcla de los tres topoisómeros (normalmente la forma superenrollada es más abundante). Topoisómeros: D istintas formas de la misma molécula.

PROCEDIMIENTO

Preparación del gel:

1. Pesar la cantidad de agarosa necesaria según la concentración final requerida.
2. Mezclar con el volumen necesario de buffer TAE 1 X.
3. Disolver calentando en horno de microondas o en baño maría.
4. Dejar entibiar la solución y agregar solución de Br. de Etidio de tal forma de llegar a una concentración final de 0 , 5 g/ml
5. Volcar en la gelera preparada a tal efecto con el/los peine/s puesto/s.
6. Dejar solidificar.
7. Sumergir el gel en la cuba de electroforesis conteniendo buffer de corrida TAE 1 X en cantidad suficiente para cubrirlo.
8. Retirar el/los peine/s con cuidado para no romper las calles.
9. Sembrar las muestras de ADN plasmídico ( 1 , 5 μl) + 1 μl BPB + 7 , 5 μl de H 2

O.

10. Realizar la corrida electroforética a 100 V.