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El procedimiento para determinar el perfil lipídico mediante la medición sérica de colesterol total, triglicéridos, HDL colesterol y LDL colesterol. El documento incluye información sobre el objetivo del análisis, el procedimiento, los componentes de los tubos de ensayo y la interpretación de los resultados.
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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DETERMINACIÓN DEL PERFIL LIPÍDICO, Triglicéridos,HDL-Colesterol
● Emilin Hoyos Fernández ● Milka Núñez Paiva ● Nadia Peña Sernaqué ● Oscar Ojeda Aponte Piura - Perú 2022-
ÁREA DE CIENCIAS GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO 2022 -I ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MEDICINA BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR PRACTICA N ° 07 DETERMINACIÓN DEL PERFIL LIPÍDICO I. INTRODUCCIÓN La determinación del perfil lipídico incluye la medición sérica de colesterol total, triglicéridos, HDL colesterol y LDL colesterol. Estas pruebas tienen utilidad para el despistaje, diagnóstico y monitoreo de las dislipidemias; las que se definen como alteraciones del perfil lipídico ya sea en aumento o disminución de alguno de sus componentes. La etiología para estas alteraciones puede ser primarias (como la hipercolesterolemia familiar, hiperlipidemia familiar combinada, etc) o secundarias a obesidad, diabetes, etc. La hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, el aumento de LDL y la disminución de HDL se asocian a mayor riesgo coronario. II. OBJETIVO Realizar la medición sérica de colesterol, triglicéridos, colesterol LDL por el método enzimático y la determinación de HDL, previa precipitación de las otras lipoproteínas. III. MATERIAL Y EQUIPOS ▪ Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas. ▪ Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc. ▪ Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro.
1) Introducción: El colesterol es una molécula lipídica, base de síntesis de los demás esteroides como las hormonas masculinas, femeninas, gluco y mineralocorticoides, así como las sales biliares y la vitamina D, con ellas comparte el núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno. Forma parte de las biomembranas regulando su fluidez. Tiene origen endógeno por síntesis a nivel hepático, intestino y otros tejidos; y exógeno de la dieta (de origen animal como la yema de huevo, carnes etc.). Se considera importante su participación en la aterogénesis unida a la Lipoproteína de baja densidad o LDL, por ello su determinación aislada o como parte del perfil lipídico es muy importante para evaluar el riesgo coronario.
▪ Lecturas de las muestras en el espectrofotómetro: 6) Actividades a desarrollar por el alumno:
- Cálculos de resultados: Nadia ▪ Cálculo del factor: 𝐹 = 2 𝑔/𝑙 𝑆 ▪ Cálculo de la concentración de Colesterol. (de cada una de las muestras). Colesterol (g/l) = D x F Conversión: Colesterol (g/l) = 0,01 x Colesterol (mg/dl)
Desconocido 2: Colesterol moderadamente alto 2,2 g/dL El colesterol es un lípido esteroide que forma parte indispensable de la vida, siendo un constituyente fundamental de las membranas de las células (sus envolturas) y de diferentes hormonas. Dado que se trata de una grasa, no es soluble en agua o soluciones acuosas, por lo que necesita ser transportado en la sangre (una solución acuosa) en el interior de unas partículas denominadas lipoproteínas. En función del tipo de lipoproteína dentro de la cual viaje, el colesterol puede ser perjudicial (LDL), protector (HDL) o indiferente (VLDL). A una elevada cantidad de colesterol en sangre se le conoce como hipercolesterolemia, la cual casi siempre se debe a un aumento del colesterol LDL, lo que se asocia con un riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares como infarto de miocardio e ictus. 7) Preguntas de aplicación: a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. Nadia b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características. oscar Análisis del sustrato y enzima: ● Sustrato: ésteres de colesterol, ácidos grasos. ● Enzima: colesterol esterasa, peroxidas y colesterol oxidasa. ● Productos: azúcares reductores (glucosa, maltosa, fructosa) Factores que han participado en la reacción: ● Temperatura: 37 °C y (18 a 25 °C). ● Tiempo: 5 minutos y 20 minutos a temperatura ambiente. Sustancias activadoras: Solución de colesterol y solución conteniendo colesterol esterasa. c) ¿Cuál es la importancia del colesterol en nuestro organismo? milka Su cuerpo necesita algo de colesterol para producir hormonas, vitamina D y sustancias que le ayuden a digerir los alimentos. Su cuerpo produce todo el colesterol que necesita.
Una insaturación entre los carbonos C-5 y C-6. El colesterol es una molécula hidrofóbica, es bastante soluble en disolventes apolares como el cloroformo. Resumiendo, la molécula de colesterol se encuentra formada por una parte central de anillos bencenicos (uno de ellos con doble enlace), una cadena alifatica larga (...-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), algunos radicales metilo y UN GRUPO -OH, que es fundamental pues constituye la parte hidrófila de la molécula. g) Elabore un esquema y explique la síntesis de colesterol.
1) Introducción: Los triglicéridos son lípidos simples formados por esteres de glicerol con tres ácidos grasos. Estos pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. Según ATP III son considerados factores de riesgo coronario; asimismo es un constituyente del síndrome metabólico (>= 150 mg/dL). Pueden tener origen exógeno (dieta) o endógeno (síntesis en hígado, tejido adiposo u otros tejidos). Las hipertrigliceridemias (>=200 mg/dL) pueden ser primarias o secundarias (obesidad, diabetes). 2) Fundamento de la Técnica: La técnica empleada en la determinación de triglicéridos en sangre, es una técnica enzimática basada en la siguiente reacción: Triglicéridos glicerol + ácidos grasos; glicerol + ATP glicerol-1-P + ADP Glicerol-1-P + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato; 2 H 2 O^2 + 4-AF + clorofenol quinonimina roja 3) Muestra y Reactivos a emplear: ▪ Muestra: suero sanguíneo. ▪ S. Estándar: solución de glicerol 2.26 mmol/l (equivale a 2 g/l de trioleína).
▪ A. Reactivo A: solución conteniendo buffer Good (pH 6.8), clorofenol, lipoproteinlipasa (LPL), glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF). 4) Procedimiento: ▪ Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de dos pacientes en ayunas. ▪ Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos. ▪ Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos. ▪ Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación. ▪ Para la determinación de triglicéridos: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S (estándar) y D (Desconocido), se debe colocar: COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO B S D Muestra (suero / ul) -- -- 10 Estándar (ul) -- 10 -- Reactivo A (ml) 1.0 1.0 1. Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 20 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua destilada. 5) Resultados: ▪ Luego de la incubación de las muestras: ▪ Lecturas de las muestras en el espectrofotómetro:
Como sucede con la mayoría de las enfermedades, la elevación patológica de las concentraciones de triglicéridos resulta del efecto, en diferente grado, de las características genéticas del individuo y de numerosos factores denominados ambientales, entre los que destacan la dieta, el estilo de vida y la exposición a tóxicos o fármacos. La presencia de una hipertrigliceridemia también puede ser consecuencia de una alteración metabólica debida a otra enfermedad; de tal manera que el trastorno lipídico es una manifestación más del espectro sindrómico de la misma. Cuando el exceso de triglicéridos se origina por una alteración directa en el metabolismo lipídico relacionada con los genes y proteínas que lo regulan se conoce como hipertrigliceridemia primaria. Sin embargo, es más frecuente que se deba a causas ambientales o a otra enfermedad previa, y producir así las hipertrigliceridemias secundarias. Las hipertrigliceridemias primarias comprenden: deficiencia familiar de lipoproteína lipasa (LPL), deficiencia familiar de apo C-II e hipertrigliceridemia familiar. En la deficiencia familiar de LPL, se ha reportado un aumento marcado de quilomicrones y no de VLDL, a pesar de ser esperable un incremento conjunto debido al rol de la LPL en el metabolismo tanto de los quilomicrones como de las VLDL. De manera similar, en la deficiencia familiar de apo C-II puede observarse presencia de hipertrigliceridemia mixta correspondiente a aumento de quilomicrones y VLDL. En este caso, la inyección de plasma humano normal que contiene apo C-II produce la corrección de las anormalidades lipídicas en estos pacientes. 7) Preguntas de aplicación: a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. ● Tiempo: Empleado para el reposo y centrifugación de las muestras ● Temperatura: Empleada para la incubación de las muestras ● Concentración de soluciones: la cantidad de g/dL en las muestras b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características. ▪ Muestra: Suero sanguíneo. El suero sanguíneo es principalmente agua, de un color amarillento puesto que se disuelve con proteínas, hormonas, minerales y dióxido de carbono, así como también es una fuente muy importante de electrolitos.
▪ S. Estándar: Solución de glicerol 2.26 mmol/l (equivale a 2 g/l de trioleína). La trioleína puede ser utilizada como un agente de control de viscosidad, ayuda a proporcionar la viscosidad deseable para un producto. Puede utilizarse en productos para el cuidado del cuerpo, la piel y el cabello, artículos de tocador, productos de maquillaje y cosméticos decorativos ▪ A. Reactivo A: Solución conteniendo buffer Good (pH 6.8), clorofenol, lipoproteinlipasa (LPL), glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF). Buffer Good : son aquellas disoluciones cuya concentración de protones apenas varía al añadir ácidos o bases fuertes La lipoproteinlipasa (LPL): es una enzima que juega un papel importante en el procesamiento de lipoproteínas ricas en triglicéridos, pero su función más importante tiene que ver con la capacidad que esta posee de unirse a lipoproteínas y a componentes específicos de la superficie celular, actuando de esta manera como un puente. La glicerol quinasa: es una enzima que es importante en la lipólisis o la descomposición de las proteínas. Funciona mediante la transferencia de un grupo. c) ¿Cuál es la importancia de los triglicéridos en nuestro organismo? Los triglicéridos son un tipo de grasa que se encuentra en la sangre. Esta grasa es importante por ser: ● Utilizada por los músculos como fuente de energía. ● Productores de calor metabólico. ● Dan protección mecánica. d) Fundamente el porqué la hipertrigliceridemia es considerada como un factor de riesgo coronario. La hipertrigliceridemia asociada a la diabetes mellitus tipo 2 (DM2), se debe principalmente a la resistencia a la insulina (RI), que provoca un aumento del flujo de los ácidos grasos procedentes de la grasa visceral al hígado. En este órgano se incrementa la síntesis de triglicéridos y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lo
g) Elabore un esquema y explique la síntesis de los triglicéridos. La síntesis de triglicéridos tiene lugar en el retículo endoplásmico de casi todas las células del organismo, pero es en el hígado, en particular en sus células parenquimatosas, los hepatocitos, y en el tejido adiposo(adipocitos) donde este proceso es más activo y de mayor relevancia metabólica. En el hígado, la síntesis de triglicéridos está normalmente conectada a la secreción de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL,su acrónimo en inglés) y no se considera un sitio de almacenamiento fisiológico de lípidos. Por tanto, toda acumulación de triglicéridos en este órgano es patológica, y se denomina indistintamente esteatosis hepática o hígado graso. Por el contrario, el tejido adiposo tiene por principal función la acumulación de energía en forma de triglicéridos.
1) Introducción: La lipoproteína de alta densidad o HDL, es considerada antiaterogénica porque interviene en el transporte reverso del colesterol de los tejidos hacia el hígado. Su disminución <40 mg/dL es considerado por ATPIII (NCEP) como un factor de riesgo coronario y como componente del síndrome metabólico (<40 mg/dl en varones y <50 mg/dl en mujeres). 2) Fundamento de la Técnica: Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de sulfato de dextrán de PM 50. en presencia de iones Mg++. En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema enzimático Colesterol oxidasa/Peroxidasa con colorimetría según Trinder (Fenol/4- Ami-nofenazona) 3) Muestra y Reactivos a emplear: ▪ Muestra: suero sanguíneo. ▪ S. Estándar: solución de colesterol = 200 mg/dl (2 g/l). ▪ A. Reactivo A: solución de sulfato de dextrán (PM 50.000) ▪ B. Reactivo B: solución de cloruro de magnesio 1.5M ▪ Reactivo Precipitante: (A+B); mezclar por inversión 2.5 ml de reactivo A y 2.5 ml de reactivo B (1:1). 4) Procedimiento: ▪ Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de dos pacientes en ayunas. ▪ Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.
▪ Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos. ▪ Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación. ▪ Para la determinación se realizará lo siguiente: En un tubo de vidrio colocar: Muestra (suero / ul) 500 Reactivo Precipitante (ul) 50 Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 30 a 40 minutos en refrigerador (2-10 °C) o 15 minutos en baño de agua a la misma temperatura. No colocar en el congelador. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. Usar el sobrenadante límpido como muestra. En 3 tubos marcados B, S y D; armar lo siguiente: COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO B S D Sobrenadante (ul) -- -- 100 Estándar (ul) -- 20 -- Reactivo de Trabajo (ml) 2.0 2.0 2. Mezclar e incubar por 5 minutos a 37°C si se usa el reactivo de trabajo de Colestat enzimático AA/líquida o 15 minutos a 37°C cuando se usa el Colestat enzimático. Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en espectrofotómetro, llevando a cero con el blanco. 5) Resultados: ▪ Luego de la incubación de las muestras: ▪ Lecturas de las muestras en el espectrofotómetro:
acción de enzimas y proteínas de transporte que las remodelan continuamente. Los bajos niveles de colesterol HDL se correlacionan con un riesgo elevado de desarrollar enfermedad aterosclerosa coronaria. La disminución de las HDL afecta el transporte reverso de colesterol, que es la vía metabólica responsable de la remoción del colesterol excedente de las células periféricas y su transporte hacia el hígado para reciclarlo o eliminarlo. Las HDL poseen además propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, antiagregantes, anticoagulantes y profibrinolíticas in vitro. Las HDL son complejos macromoleculares y seudomicelares, constituidos por lípidos anfipáticos (fosfolípidos y colesterol libre), lípidos no polares (triglicéridos y ésteres de colesterol) y por proteínas llamadas apolipoproteínas (apo) (Fig. 1). Los lípidos anfipáticos se organizan en una monocapa en la superficie del complejo, presentando sus grupos polares hacia el medio acuoso. La estabilidad de esta monocapa está garantizada por las apolipoproteínas. Los lípidos no polares son insolubles en un medio acuoso como el plasma y en consecuencia se sitúan en el interior de las lipoproteínas, evitando así las interacciones con grupos polares que serían fisicoquímicamente desfavorables. De esta manera el transporte de los lípidos en plasma está garantizado. Además, las HDL son las lipoproteínas con mayor proporción proteica (55-60% de su masa seca), siendo la apo A-I su apolipoproteína más abundante. 7) Preguntas de aplicación: a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. Nadia ● Tiempo: Empleado para el reposo y centrifugación de las muestras ● Temperatura: Empleada para la incubación de las muestras ● Concentración de soluciones: la cantidad de g/dL en las muestras b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características.Estela Peroxidasa con colorimetría :La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos orgánicos e inorgánicos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno. Es utilizada ampliamente en bioquímica clínica. Así, los ensayos para la determinación y cuantificación de metabolitos como glucosa, ácido úrico, colesterol o triglicéridos en fluidos biológicos usan peroxidasa como enzima acoplada. También se utiliza en inmunoensayos para la detección de virus tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA o el herpesvirus. El método colorimétrico resultó ser útil para cuantificar glucosa y consumo de glucosa en adipocitos 3T3-L1. c) ¿Cómo es el metabolismo de las HDL? oscar
Las HDL nacientes sintetizadas en el hígado y en el intestino remueven eficientemente el colesterol libre desde las células de los tejidos periféricos por mecanismos dependientes de la actividad del transportador ABCA1. Enseguida, las partículas de HDL son procesadas por la enzima LCAT para generar la formación de HDL enriquecidas en ésteres de colesterol. Las HDL entregan colesterol directamente al hígado y los tejidos esteroidogénicos a través del proceso de captación selectiva de colesterol HDL mediado por el receptor SR-BI. El flujo del colesterol desde los tejidos periféricos por medio de las HDL plasmáticas hacia el hígado se conoce como transporte reverso de colesterol. Mientras el colesterol HDL removido por el hígado puede ser destinado para secreción biliar, el colesterol captado desde las HDL en los tejidos esteroidogénicos se utiliza para la síntesis de hormonas esteroidales ABCA1. d) ¿Por qué es importante la determinación de HDL? oscar La prueba del colesterol HDL se utiliza de forma aislada o como parte de un perfil lipídico para tratar de predecir el riesgo que tiene una persona de desarrollar una enfermedad cardíaca y determinar el tratamiento idóneo en el caso de que el riesgo sea alto o se encuentre en el límite. e) ¿Qué alteraciones pueden reportarse de los valores de HDL colesterol?(EMILIN) Una concentración elevada de colesterol HDL (el colesterol «bueno») evita la aterosclerosis y puede reducir el riesgo de infarto de miocardio y de accidentes cerebrovasculares, ya que transporta el colesterol LDL hacia el hígado, evitando así que se almacene en los vasos sanguíneos. Sin embargo, las concentraciones de colesterol HDL pueden aumentar en presencia de algunos trastornos genéticos. En estos trastornos, la concentración elevada de HDL puede no proteger contra infartos de miocardio o accidentes cerebrovasculares, probablemente porque la enfermedad también causa otros cambios en las concentraciones de lípidos y otras anomalías en la forma en la que el organismo descompone los alimentos. Las concentraciones elevadas de HDL pueden ser ● Primarias: causadas por una mutación genética (sobreproducción de HDL o a una reducción de la eliminación de HDL). ● Secundarios: causados por otro trastorno (alcoholismo crónico sin cirrosis, hipertiroidismo, cirrosis biliar primaria, medicamentos). f) ¿Cuándo se consideran de riesgo los valores de HDL? oscar Un alto nivel de triglicéridos, combinado con un colesterol LDL (malo) alto o un colesterol HDL (bueno) bajo está relacionado a las acumulaciones de grasa dentro de las paredes arteriales. Esto aumenta el riesgo de sufrir un ataque cardíaco y derrame cerebral. g) ¿Cómo se mejorarían los niveles de HDL colesterol? oscar Si su nivel de HDL es demasiado bajo, los cambios en el estilo de vida pueden ayudar. Estos cambios también pueden ayudar a prevenir otras enfermedades y le harán sentir mejor en general: ● Coma una dieta saludable
el Colestat enzimático. Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en espectrofotómetro, llevando a cero con el blanco. 5) Resultados: ▪ Luego de la incubación de las muestras: ▪ Lecturas de las muestras en el espectrofotómetro: 6) Actividades a desarrollar por el alumno:
Desconocido 1: 0,635 x 2,7 g/L= 1,7 g/L Desconocido 2: 0,360 x 2,7 g/L= 0,97 g/L
