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Se encuentra 2 genes presentes en ambos sistemas sin estudios previos
Tipo: Tesinas
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Figura 10 Sublonación del ORF y región promotora de SERF 13615 en el vector binario. A) Digestión del promotor (1,569 pb) en el vector binario pB7GWFS7 (12 ,452 pb) que libera 428 pb por el corte de EcoRI que libera los diferentes fragmentos. B) Digestión del ORF(216 pb) en el vector binario pB7FWG2(11,628 pb)....................................................................................................................... 31 Figura 11 Comprobación por PCR de las transformaciones en A.tumefaciens A)PCR 13615 ORF en AGL1 con 216 pares de bases, B) PCR 13615 Promotor en AGL1 con 1569 pares de bases y C) PCR 13615 ORF antisentido en AGL1 con 216 pares de bases................................................................. 31 Figura 12 Perfil de expresión del gen SERF 13615 en plantas Wild Type de A.thaliana.................... 32 Figura 13 Localización de GFP-SERF 13615 ORF en cortes transversales en plantas de N.benthamiana. (A y B) Controles silvestres que muestran autofluoresencia del xilema.(C y D) Localización de GFP SERF 13615 en el haz vascular de hojas. (D) Localización de GFP SERF 13615 en el haz vascular en el campo claro..................................................................................................... 33 Figura 14 Filogenía que agrupa a las proteinas SERF de diferentes grupos taxonómicos, por el metodo de Neighbor Joining (método de distancias), con un numero 1000 bootstrap y se colapsaron aquellas secuencias que representan un porcentaje menor al 50%. Donde sobresalta de color rosa las proteínas SERF 13615 de A.thaliana...................................................................... 35 Figura 15 Filogenía que agrupa a las proteinas SERF del reino plantae, por el metodo de Neighbor Joining (método de distancias), con un numero 1000 bootstrap y se colapsaron aquellas secuencias que representan un porcentaje menor al 50%. Donde sobresalta de color rosa las proteínas SERF 13615 de A.thaliana......................................................................................................................... 36 Figura 16 Estructura de la proteína SERF 13615 predicha por el sitio I-Tasser................................. 37 Figura 17 Superficie de hidrofobicidad de la proteína SERF 13615 predicha por el sitio I-Tasser.... 37 Figura 18 Historial de construcción ORF SERF 13615....................................................................... 40 Figura 19 Historial de construcción ORF antisentido SERF 13615.................................................... 41 Figura 20 Historial de construcción Promotor SERF 13615.............................................................. 42
Tabla 1 Características de la movilidad del RNAm del gen AT4G13615............................................ 11 Tabla 2. Taxonomía de Arabidopsis thaliana (Heynhold, 1841)........................................................ 12 Tabla 3 Aminoácidos pertenecientes a EDRK................................................................................... 13 Tabla 4. Genes pertenecientes a la familia SERF en A. thaliana....................................................... 13 Tabla 5 Mezcla para digestión de SERF 13615 ORF en pCR8/GW/TOPO para determinar orientación de clonas.......................................................................................................................................... 20 Tabla 6 Mezcla de reacción para comprobar las orientaciones de las construcciones..................... 21 Tabla 7 Mezcla de PCR...................................................................................................................... 23
Tabla 8 Mezcla de reacción para PCR en tiempo real....................................................................... 27 Tabla 9 Programa utilizado para PCR tiempo real............................................................................ 28 Tabla 10 Panorama del avance en las construcciones con las que se inició el proyecto.................. 29 Tabla 11 Secuencias de Primers para SERF 13615............................................................................ 43
Diferenciar las funciones que ejerce el gen AT4G13615 en A.thaliana
Llevar a cabo las correspondientes construcciones genéticas para analizar el patrón de expresión del gen AT4G13615, así como para inducir su silenciamiento y sobreexpresión. Transformar plantas de A. thaliana con las construcciones genéticas de regiones promotoras y sobreexpresión del gen AT4G13615. Determinar el perfil de expresión del gen AT4G13615 en plantas silvestres de A. thaliana. Identificar la localización celular de la proteína AT4G13615 en plantas de Nicotiana benthamiana
En el actual proyecto, se utiliza la planta modelo Arabidopsis thaliana , puesto que es el organismo con mayor utilidad por la sociedad científica como modelo para la biología de plantas al contar con las características óptimas para este fin. La finalidad del proyecto es servir como estudio previo a futuras investigaciones ya que en la actualidad no se cuenta con información cuenta con reportes sobre la función que ejerce el gen de estudio en A.thaliana
Las briofitas (Musgos, plantas hepáticas y antecerotes) son considerados como un grupo de plantas crucial en la transición a la tierra de la vida fotosintética, debido a que poseen un gametofito haploide fotosintético, esporofitos mono-esporangiados y escases de tejidos conductores (sin tallo, ni raíces verdaderas) En las plantas vasculares aparece un sistema protector formado por dos tejidos, la epidermis, que recubre la parte más externa del cuerpo primario de la planta y la peridermis, el cual es el tejido que recubre el cuerpo secundario de la planta. Estos sistemas revisten de cutina y suberina, que evitan la perdida de agua, para mantener la erguides sobre la tierra. La clasificación de las plantas vasculares es dividida en 2 grupos, las que tienen semillas (gimnospermas y angiospermas) y las que escasean de ellas, que las últimas son caracterizadas por contener espermatozoides que nadan y requieren un medio acuoso para la reproducción. Las gimnospermas cuyos óvulos y semillas no se forman en cavidades cerradas, las cuales portan células masculinas productoras, el cual se dispersa gracias al viento, mientras que las angiospermas producen semillas encerradas y protegidas por la pared del ovario, que posteriormente, se convierte en fruto. También se pueden clasificar por el número de cotiledones de sus semillas, en dicotiledóneas y monocotiledóneas. Las dicotiledóneas son aquellas cuyas semillas está compuesta de dos cotiledones situados a ambos lados del embrión, mientras que, las monocotiledóneas son plantas angiospermas con flor completa y visible, que poseen una sola hoja embrionaria o cotiledón en sus semillas. [ CITATION Lob13 \l 2058 ].
Las plantas están compuestas por tejidos autotróficos o fotosintéticos, que utilizan el CO 2 como fuente de carbono y de tejidos heterotróficos, como los meristemos, tejido reproductivo, raíces y hojas inmaduras, que dependen del CO 2 fijado en forma de azúcares y exportado por el tejido fotosintético [CITATION Rui02 \l 2058 ].
El tejido vascular en plantas está formado por una red de vasos que derivan de células altamente modificadas y se dividen en dos tejidos conductores: el xilema y el floema; además del procambium/cambium [ CITATION Ore11 \l 2058 ]. El procambium es un tejido meristemático que da origen, tanto el xilema como el floema. Estos tejidos conductores transportan nutrientes, agua, fitohormonas, metabolitos, macromoléculas (proteínas y RNA´s), minerales y diversas sustancias señal de larga distancia [ CITATION Keh07 \l 2058 ]. La combinación de estos tejidos coordina la diversidad de los procesos físicos y el desarrollo de las plantas[CITATION JUA14 \l 1033 ]. El xilema tiene la función de transportar agua y nutrientes, mientras que el floema distribuye el CO 2 fijado en forma de azúcares, aminoácidos, otros nutrientes y además de transportar RNA´s y proteínas. El floema es mayormente activo debido a la diversidad de procesos en la fijación del CO 2 y en la comunicación intercelular por la respuesta a diferentes niveles de estímulos. Ambos tejidos sufren diversas modificaciones para llegar a la madurez, en el caso del xilema ocurre un proceso similar al de muerte celular programada, resultando en la perdida de los organelos y en vasos con una pared celular reforzada; en el floema la mayoría de los organelos se pierden, pero las células mantienen la integridad de sus membrana [ CITATION Rui02 \l 2058 ].
transporte a larga distancia , que puede llegar a indicar una movilización por un conducto continuo a una distancia que ronda por los 100 metros en los arboles grandes. Sin embargo, se ha logrado calcular la velocidad de transporte en el floema, gracias a la aplicación de sustancias marcadas las cuales han entregado datos que rondan entre los 50-100 cm/h[ CITATION Uni11 \l 1033 ]. Cada elemento criboso está relacionado a una o más células acompañantes que asumen funciones esenciales en el metabolismo, que pierden eficiencia en el proceso de especialización de los elementos cribosos. Existen al menos 3 tipos de células acompañantes: Células acompañantes comunes que tienen cloroplastos con tilacoides desarrollados y una pared celular secundaria con interior liso. Célula de transferencia que a diferencia del primer tipo este desarrollo entrantes o rebordes en la pared celular, el cual aumenta el área de la membrana plasmática y su capacidad de transporte. Célula intermediaria , que tiene una cantidad de conexiones superior de plasmodesmos con otras células, aparte del elemento criboso. Están especializadas en el transporte por el simplasto (Comportamiento intracelular de una planta)[ CITATION Uni11 \l 1033 ]. El floema conlleva un rol dentro de la comunicación intercelular, que es sugerido por ciertos comportamientos a estrés ambientales que son recibidos por tejidos independientes a la respuesta. Donde el tejido receptor emite una señal a un segundo tejido que muestra la respuesta observada [ CITATION Rui02 \l 2058 ], por ejemplo: Inducción de floración Defensa contra patógenos Respuesta a déficit hídrico Silenciamiento génico postranscripcional Dominio apical Transporte de virus y macromoléculas en plantas
Por otro lado, de acuerdo con el trabajo de [ CITATION Thi15 \l 2058 ], 2006 genes en A. thaliana, producen 2128 transcritos o RNA’s móviles, uno de esos genes es el AT4G13615. Estos transcritos son capaces de transportarse y realizar su función en partes lejanas de la planta y la mayoría parece seguir la ruta dependiente del floema (transporte de azucares y otros nutrientes de los tejidos fotosintéticos a las raíces de la planta), aunque algunos también se mueven en dirección opuesta. Para identificar estos transcritos móviles y conocer la extensión de su movilidad, se diseñó un experimento basado en el injerto de dos diferentes ecotipos de A. thaliana Col-0 (porta injerto de referencia) y Ped-0, pues tienen las conexiones de injerto más estables y muestran una alta frecuencia de secuencias genómicas SNP (polimorfismos de nucleótido único), las cuales son variaciones de una sola base de la secuencia de DNA y son específicas para cada ecotipo. Se trabajó a diferentes condiciones: nutrientes completos, limitación de fósforo y limitación de nitrógeno; el acomodo del injerto se llevó a cabo de dos formas: Col-0 (raíz)/ Ped- 0 (brote) y Ped-0 (raíz)/Col-0 (brote). Los resultados para el gen AT4G13615 se muestran en la tabla 3. El transcrito de este gen se mueve dirección Col-0 a Ped- pudiendo deberse a una disminución de la actividad de exportación en los tejidos Ped-0 (brote) inducidos por el sistema heterólogo de Col-0 (raíz). Tabla 1 Características de la movilidad del RNAm del gen AT4G Dirección Col-0 a Ped- Condiciones Nutrientes completos
El estudio del contenido del floema nos permite intuir que no solamente los nutrientes minerale o fotosintatos circulan a traves de este [ CITATION Xoc05 \l 2058 ]. Ha sido demostrado que los virus se pueden desplazar de célula a célula por la vía de los plasmodesmos y que estos requieren un sistema vascular, principalmente el floema, pero, estos no tienen el diametro adecuado para permitir el transito de los virus libremente [ CITATION Rui02 \l 2058 ], aunque alguno virus poseen genes para proteínas que aumentan el tamano de exclusión molecular de los plasmodesmos y
Mientras tanto, las siglas de SERF corresponden a su acrónimo en ingles de: “Small EDRK Rich Factor”, y la serie de letras EDRK, corresponden a los aminoácidos: Tabla 3 Aminoácidos pertenecientes a EDRK Letras Aminoácidos E Ácido glutámico D Ácido aspártico R Arginina K Lisina La función de las proteínas de los genes SERF en A.thaliana no ha desarrollada, pero, se han encontrado que son expresadas y que están presentes en diferentes escenarios de estrés. Tabla 4. Genes pertenecientes a la familia SERF en A. thaliana Nombre del gen Nombre de la proteína Longitud (aa) Peso molecular (Da) Punto isoeléctrico At2g23090 At2g23090 78 8375.8 10. At3g24100 At3g24100 69 7251.9 11. At4g13615 At4g13612 71 7177.9 11.
Para el estudio del gen SERF 13615 se elaboraron 3 construcciones genéticas:
9.1.2 Identificación de secuencias (TAIR) promotor y ORF Partiendo del código del gen SERF 13615 se realizó la investigación de las secuencias, que fue llevada a cabo en la base de datos de TAIR ( The Arabidopsis Information Resource, por sus siglas en ingles), la cual contiene una biblioteca de datos de biología molecular y genética de la planta superior Arabidopsis thaliana. Donde se descargaron las secuencias del promotor y ORF. Para el diseño los respectivos primers cabe mencionar que en el grupo de trabajo ya se contaba con los oligos especifícos para la amplificación de las regiones promotoras, ORF y ORF antisentido. En el caso de la zona promotora, se tomó 1500 pb upstream del marco de lectura abierto. Se realizó la misma metodología para la región ORF, eligiendo la secuencia CDS (Araport codig sequence). 9.1.3 Estructura de las construcciones in silico usando el programa de SnapGene La simulación de las construcciones fueron realizadas en el software de SnapGene los cuales nos entregaron un panorama con mayor presición de las construcciones finales, asi como un esquema ilustrativo el cual sirvió como guía dentro del mapa de los vectores utilizados.
Figura Visualización de las construcciones genéticas para el gen SERF 13615 A) Subclonación del Promotor en el vector binario pBGWFS7, B) Subclonación del ORF en el vector binario pB7FWG2, C) Subclonación del ORF antisentido en el vector binario pB7FWG2D La Después de llevar a cabo las construcciones in silico, también se llevó a cabo su corroboración de orientación positiva (5’-3’). El software de SnapGene esta conformado por una biblioteca de datos de las secuencias cargadas, por lo cual es posible hacer un limitado numero de combinaciones de enzimas, que muestran un panorama de las bandas esperadas en el experimento simulado, tanto en el ORF y Promotor. Las enzimas utilizadas en la experimentación y en SnapGene del gen SERF 13615 en el caso de del ORF fueron: EcoRV y PstI, y en el caso del promotor fueron: EcoRV y HindIII.
9.1.4 Amplifición de regiones promotora, ORF y ORF antisentido Se realizó una PCR para amplificar las regiones especificadas de SERF 13615. La mezcla de reacción se llevó a cabo con 1.25 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de solución buffer Takara, 2 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de dNTPs, 1 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de los primers del respectivo para amplificar el Promotor, ORF y ORF ori (-), 1 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de DNA, 0.05 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de enzima Takara y 6.2 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de H 2 O Mili-Q estéril para ser llevado a un volumen final de 12.5 μl de solución buffer Takara, 2 μl del. Las reacciones se incubaron en un termociclador y se realizó un gradiente de temperatura para estandarizar las condiciones óptimas de la PCR. Los productos de PCR fueron cargados en geles de agarosa al 1% conteniendo 0.001% de bromuro de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara con solución TBE (Tris 45nM; ácido bórico 4mM; EDTA 1mM, pH8) a 90 V por 45 min. Los geles fueron observados en un transiluminador bajo luz UV.
9.2.1 Purificación de producto de PCR SERF 13615 Se cortaron las bandas de agar correspondiente a cada región y se purificaron con el kit ZymocleanTM^ Gel DNA Recovery (Zymo Research). Los tubos con el agar fueron pesados y con un tubo de la misma capacidad se hizo una diferencia de pesos, para conocer el volumen del agar y se adicionaron 3 volúmenes de ADB por volumen de agarosa, se incubaron a 60 C durante 5 min con una agitación de 200 RPM, de modo que el agar se solubilizara. La solución resultante se colocó en sobre columnas Zymo Clean de 750 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de capacidad y tubos recolectores, se centrifugó a 13,000 RPM durante 1 min, de modo que el sobrenadante pasara a través de la cámara al tubo colector y se descartó el sobrenadante; este paso se repitió hasta terminar el volumen disuelto de la agarosa. Se adicionaron 200 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de DNA Wash Buffer con etanol a cada columna y se centrifugo nuevamente a 13,000 RPM durante 30 segundos, y este paso se repitió una vez más. Las columnas se centrifugaron nuevamente a las mismas condiciones durante 1 min, para eliminar algún exceso de Buffer de lavado. Finalmente se colocaron las columnas en tubos eppendorf de 1.5 μl de solución buffer Takara, 2 μl del para eluir el producto con 20 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de H 2 O Mili-Q estéril y se mantuvo durante 5 min estacionariamente para que el agua
pudiera penetrar la columna. Se centrifugó a 13,000 RPM durante 1 min y se almacenó a -20 C. 9.2.2 Clonación en vector de entrada pCR8/GW/TOPO En este proyecto cabe recalcar que se contaba con la mayoria de las construcciones en el vector de entrada a excepción de la construcción ORF antisentido de SERF 13615. El cual es extraido a traves de la construcción ORF SERF 13615, por digestiones (Tabla 5) que fueron incubadas a 37˚C por 12 horas, las cuales liberan dos diferentes productos que muestran dos posibles combinaciones de los cuales se puede seleccionar el ORF antisentido, tal como se obtuvo en el software de SnapGene. Tabla 5 Mezcla para digestión de SERF 13615 ORF en pCR8/GW/TOPO para determinar orientación de clonas. Reactivo Volumen(μL) Buffer EcoRI 1 EcoRI 0. DNAp 1 H2O 7. Total 10 9.2.3 Transformación de E.coli (Células quimicompetentes) por choque térmico Se utilizaron células de E.Coli Mach 1 quimicompetentes donde se colocaron 6 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de la ligación con pCR8GWTOPO y se incubaron en hielo durante 20 min , después se colocó en un termoblock para el choque térmico a 42 C˚ grados durante 52 seg, finalmente se incuban en hielo por otros 5 min. Inmediatamente se coloca 250 μl de solución buffer Takara, 2 μl del de medio SOC y fueron incubados a 37 °C y 150 RPM durante 1: h. Las células fueron plaqueadas posteriormente en placas de medio LB con espectinomicina (100 mg/ml) gradualmente 50 μl de solución buffer Takara, 2 μl del, 100 μl de solución buffer Takara, 2 μl del y 150 μl de solución buffer Takara, 2 μl del, y fueron
