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1.10 Características de los péptidos y proteínas. Péptido : Un péptido es una molécula que resulta de la unión de dos o más aminoácidos (AA) mediante enlaces amida. En los péptidos y en las proteínas, estos enlaces amida reciben el nombre de enlaces peptídicos y son el resultado de la reacción del grupo carboxilo de un AA con el grupo amino de otro, con eliminación de una molécula de agua. Generalmente se considera, según el autor, que los péptidos no son mayores de 50 o 100 aminoácidos. De manera también general a una cadena polipeptídica se le considera péptido y no proteína si su peso molecular es menor de 5.000 daltons. Proteínas: Las proteínas con biomoléculas de alto peso molecular constituidas por una cadena lineal de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos que se mantiene plegada de forma que muestra una estructura tridimensional. Las proteínas desempeñan numerosas funciones en el organismo. De manera muy genérica, según su función, se clasifican como proteínas estructurales o proteínas con actividad biológica. Las proteínas estructurales son aquellas que intervienen en la constitución de los tejidos, órganos y células. Como ejemplos se puede citar al colágeno, que forma parte de la piel, ligamentos, tendones, hueso y matriz de varios órganos. Las proteínas con actividad biológica son aquellas que intervienen o facilitan un proceso bioquímico en el organismo. Las funciones aquí son casi innumerables, desde regulación de procesos metabólicos hasta participación en la defensa (sistema inmune), pasando por ser moléculas de transporte de otras moléculas en la sangre. Simples. Constituidas únicamente aminoácidos. Entre ellas tenemos albúminas, globulinas, histonas… Conjugadas. Tienen en su composición otras moléculas diferentes además de los aminoácidos. A esa parte no aminoacídica se le denomina grupo prostético. Entre ellas tenemos las glucoproteínas o mucoproteínas, lipoproteínas, metaloproteínas… 1.11 Estructuras de las proteínas.
1.12 Métodos de purificación y secuenciación de las proteínas. Métodos de purificación Salazón Las proteínas en un extracto crudo son purificadas después precipitándolas en una solución de sal altamente concentrada, tal como sulfato del amonio. Esto trabaja en base de la solubilidad más inferior de la proteína en las altas concentraciones de sal. Sin embargo, todas las proteínas no se precipitan en la misma concentración de sal, que significa que la salazón también ayuda a fraccionar las proteínas. Puede también ser utilizada para concentrar las proteínas en la solución. Este paso aumenta la pureza tres veces y el 92% de la proteína en la solución se recupera. Diálisis Las proteínas son moléculas grandes, y ésta significa que las sales de las proteínas serán conservadas pasando la solución a través de una membrana semipermeable. La celulosa es una membrana típica de la diálisis. La diálisis no se puede utilizar para separar las proteínas de diversos pesos moleculares. Cromatografía La filtración de gel trabaja en base de la separación de talla a través de una columna de las molduras porosas del polímero, tales como dextrano o agarosa. Las moléculas grandes pueden fluir solamente a través de los espacios entre las molduras, mientras que las más pequeñas ocupan estos espacios y el espacio dentro de las
Métodos de secuenciación de las proteínas. Secuenciación de péptidos. Los péptidos se pueden secuenciar (establecer el orden en que se encadenan los aminoácidos en la secuencia) automáticamente utilizando el reactivo de Edman que separa el aminoácido N-terminal del resto del péptido y lo derivatiza para que pueda ser detectado. Se realizan ciclos automáticos de separación e identificación cromatográfica. Más allá del aminoácido 30 el resultado ya no es fiable. método de Sanger Las proteínas se pueden secuenciar tras romperlas en péptidos de tamaño adecuado y separarlos por cromatografía. Para la rotura se emplean enzimas o reactivos que cortan en sitios específicos. Es necesario realizar dos roturas con reactivos diferentes para obtener dos conjuntos de péptidos, todos los cuales son secuenciados. Los péptidos de un conjunto tienen secuencias que solapan las de los péptidos del otro grupo y por comparación se puede establecer el orden en que se encadenan en la proteína entera. Es mucho más fácil y rápido determinar la secuencia de una proteína por secuenciación de su gen y traducción. Sin embargo, este procedimiento no identifica las modificaciones postraduccionales ni los puentes disulfuro. Existen servicios de secuenciación de pago Secuenciación de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masas. Los péptidos se pueden secuenciar también por espectrometría de masas. Hay dos formas principales de transferir a fase gas moléculas de proteína completas: EEI: Electrospray ionization y MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization with Time of Flight detector. Estas técnicas permiten determinar con precisión el PM de la proteína. Para determinar la secuencia hace falta obtener fragmentos que se diferencien en 1 residuo. Habitualmente se hace mediante MALDI-PSD (Post source decay). En la práctica no se procesan proteínas completas sino fragmentos obtenidos por proteólisis. Existen servicios de secuenciación de pago Secuenciación de ADN por el método de Sanger. El método se basa en generar por replicación in vitro de un DNA molde segmentos copia con el mismo origen (en un cebador añadido) pero distinta longitud, que se separan por electroforesis en función de su longitud. Se llevan a cabo 4 reacciones que difieren en que en cada una de ellas está presente un ddNTP distinto (ddATP, ddGTP,...) cuya incorporación detiene el crecimiento del fragmento copia al incorporarse. Las cuatro reacciones se cargan en un gel de electroforesis y la posición de los fragmentos de DNA se revela por autorradiografía porque contienen radiactividad
(originalmente el cebador estaba marcado con 32P; posteriormente parte de las moléculas de ATP para la síntesis contenían 35S). Posteriormente, la electroforesis en geles de acrilamida se sustituyo por electroforesis capilar, se empezó a usar la PCR para amplificar la muestra (y de ahí la señal) y se introdujeron dideoxiNTPs terminadores marcados fluorescentemente (4 colores distintos) de modo que bastaba hacer una reacción. La detección ya no era por autorradiografía sino por un lector láser de fluorescencia. Secuenciación de ADN de segunda generación. Nuevos métodos de detección: pirosecuenciación (con dATPαS), terminadores reversibles, liberación de protones. La secuenciación es muy rápida. Se paraleliza consiguiendo secuenciar muchos fragmentos a la vez. La información se trata conjuntamente con aplicaciones de alineamiento y ensamblado de secuencias. La secuenciación cada vez es más rápida y barata. 1.13 Estructura de las proteínas globulares y fibrosas. Proteínas globulares: la cadena polipeptídica aparece enrollada sobre sí misma dando lugar a una estructura más o menos esférica y compacta. Proteínas fibrosas: si hay una dimensión que predomina sobre las demás, se dice que la proteína es fibrosa. Las proteínas fibrosas, por lo general, tienen funciones estructurales. 1.14 características de las enzimas según su clasificación. Se denomina enzimas a un conjunto de proteínas encargadas de catalizar (disparar, acelerar, modificar, enlentecer e incluso detener) diversas reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles. Esto quiere decir que son sustancias reguladoras en el cuerpo de los seres vivos, por lo general disminuyendo la energía inicial requerida para poner en marcha la reacción. Las enzimas se clasifican en base a la reacción específica que catalizan, de la siguiente manera: Oxidorreductasas. Catalizan reacciones de óxido-reducción, o sea, transferencia de electrones o de átomos de hidrógeno de un sustrato a otro. Ejemplo de ellas son las enzimas deshidrogenasa y c oxidasa.
reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible. Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en: la polaridad del disolvente la fuerza iónica el pH la temperatura 1.16 características generales, clasificación de los lípidos y su importancia en la biotecnología. Los lípidos tienen como característica principal el ser hidrófobos (insolubles en agua) y solubles en disolventes orgánicos. Se los llama incorrectamente grasas, ya que las grasas son solo un tipo de lípidos procedentes de animales. Cumplen diversas funciones en los organismos vivientes. Características generales: Los lípidos son moléculas muy diversas; unos están formados por cadenas alifáticas saturadas o insaturadas, en general lineales, pero algunos tienen anillos (aromáticos). Algunos son flexibles, mientras que otros son rígidos o semiflexibles hasta alcanzar casi una total flexibilidad mecánica molecular; algunos comparten carbonos libres y otros forman puentes de hidrógeno. Los lípidos son hidrofóbicos, esto se debe a que el agua esta compuesta por un átomo de oxígeno y dos de hidrógeno a su alrededor, unidos entre sí por un enlace de hidrógeno. El núcleo de oxígeno es más grande que el del hidrógeno, presentando mayor electronegatividad. los lípidos son largas cadenas de hidrocarburos y pueden tomar ambas formas: cadenas alifáticas saturadas (un enlace simple entre diferentes enlaces de
carbono) o insaturadas (unidos por enlaces dobles o triples). Esta estructura molecular es no polar. Los enlaces polares son más enérgicamente estables y viables, por eso es que las moléculas de agua muestran una clara afinidad por los demás. Pero por el contrario, las cadenas de hidrocarburos no son capaces de establecer un grado sustancial de afinidad con las moléculas de agua y entonces no se mezclan. Los lípidos son insolubles en agua porque no hay adhesión entre las moléculas de agua y la sustancia lipídica. Clasificación bioquímica Los lípidos son un grupo muy heterogéneo que usualmente se subdivide en dos, atendiendo a que posean en su composición ácidos grasos (lípidos saponificables) o no los posean (lípidos insaponificables): Lípidos saponificables
- Simples. Son los que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno.
- Acilglicéridos. Son ésteres de ácidos grasos con glicerol. Cuando son sólidos se les llama grasas y cuando son líquidos a temperatura ambiente se llaman aceites.
- Céridos (ceras).
- Complejos. Son los lípidos que, además de contener en su molécula carbono, hidrógeno y oxígeno, contienen otros elementos como nitrógeno, fósforo, azufre u otra biomolécula como un glúcido. A los lípidos complejos también se les llama lípidos de membrana pues son las principales moléculas que forman las membranas celulares.
- Fosfolípidos.
- Fosfoglicéridos.
- Fosfoesfingolípidos.
- Glucolípidos.
- Cerebrósidos.
- Gangliósidos. Lípidos insaponificables
- Terpenoides.
- Esteroides.
- Prostaglandinas.
Monosacáridos: La fórmula general para un monosacárido es (CH2O) monosacáridos del N. es la forma más simple del hidrato de carbono, que los medios ellos no se pueden hidrolizar o analizar en hidratos de carbono más pequeños. Los monosacáridos son moléculas importantes que los hidratos de carbono complejos están analizados en, para generar energía. Son también esenciales para construir los ácidos nucléicos. Clasificación del monosacárido: Los monosacáridos se pueden clasificar de tres maneras principales, según:
- El número de átomos de carbono - los monosacáridos que contienen tres átomos de carbono se refieren como triosas, mientras que ésos con cuatro carbonos se llaman los tetroses y ésos con cinco se llaman las pentosas etc.
- La situación del grupo de carbonyl - si el grupo de carbonyl es un aldehido, después el monosacárido es una aldosa mientras que si el grupo de carbonyl es una cetona, el monosacárido es un ketose.
- La estereoquímica o el uso de las manos quiral de la molécula - esto refiere a la configuración de la molécula, que puede existir en diversos formas o isómeros estructurales. Su principal función en los organismos es energética, aunque algunos de ellos entran a formar parte de la composición de moléculas con funciones muy diferentes (en los ácidos nucleicos, ATP y otros nucleótidos, etc.). Los oligosacáridos : son polímeros de hasta 20 unidades de monosacáridos. La unión de los monosacáridos tiene lugar mediante enlaces glicosídicos, un tipo concreto de enlace acetálico. Los más abundantes son los disacáridos, oligosacáridos formados por dos monosacáridos, iguales o distintos. Funciones: que llevan a cabo los oligosacáridos unidos a lípidos o a proteínas de la superficie celular caben destacar:
- Los oligosacáridos unidos a lípidos o a proteínas de la superficie celular determinan muchas veces la individualidad antigénica tanto del tipo de
tejido como del propio individuo. Así, las sustancias que determinan la especificidad del grupo sanguíneo de la superficie del hematíe son oligosacáridos complejos. Muchos antígenos tumorales son oligosacáridos de la superficie celular.
- El complemento glicídico de las glicoproteínas varía también en función del desarrollo ontogénico de los tejidos.
- La interacción de ciertos agentes patógenos (bacterias y virus) con las células huésped tiene lugar a través de las glicoproteínas. La cadena de oligosacáridos no tiene que ser necesariamente lineal, y de hecho, con mucha frecuencia se encuentran en la Naturaleza oligosacáridos y polisacáridos ramificados. Los oligosacáridos tienen gran importancia en las funciones de reconocimiento en superficie, ya que son parte integrante de los glicolípidos y glicoproteínas que se encuentran en la membrana plasmática. Los polisacáridos: Un polisacárido es un polímero que está compuesto por una extensa sucesión de monosacáridos, unidos entre sí a través de enlaces glucosídicos. Los polisacáridos pueden incluirse dentro del grupo de los hidratos de carbono, que también son conocidos como carbohidratos o glúcidos. Estos polisacáridos cumplen con diferentes funciones en el organismo: contribuyen al desarrollo de las estructuras orgánicas, permiten almacenar energía y actúan como un mecanismo de protección frente a ciertos fenómenos, por ejemplo. 1.18 Enlace glicosídico. Compuestos con grupos OH, NH2 y SH pueden reaccionar con el OH hemiacetálico del carbono anomérico de un monosacárido, con pérdida de una molécula de agua para formar los compuestos llamados generalmente glicósidos. El enlace acetálico establecido se llama enlace glicosídico. La figura inferior muestra la formación de etilglucósido (un O-glicósido) a partir de glucosa y etanol.
agregan otras biomoléculas que presentan en su estructura, además de la porción glucídica, otra porción químicamente diferente: derivados de monosacáridos, heteropolisacáridos, peptidoglicanos, glucoproteínas y glicolípidos. 1.20 Estructura de los nucleótidos y ácidos nucleicos. Un nucleótido es la pieza básica de los ácidos nucleicos. El ARN y el ADN son polímeros formados por largas cadenas de nucleótidos. Un nucleótido está formado por una molécula de azúcar (ribosa en el ARN o desoxirribosa en el ADN) unido a un grupo fosfato y una base nitrogenada. Las bases utilizadas en el ADN son la adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). En el ARN, la base uracilo (U) ocupa el lugar de la timina. Los ácidos nucleicos están formados por largas cadenas de nucleótidos. Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Los nucleótidos a su vez están formados por tres moléculas: un azúcar, un ácido fosfórico y una base nitrogenada. 1.21 enlace fosfodiestrer. Un enlace fosfodiéster es un tipo de enlace covalente que se produce entre un grupo hidroxilo en el carbono 3' y un grupo fosfato en el carbono 5' del nucleótido entrante, formándose así un doble enlace éster. En esta reacción se libera una molécula de agua y se forma un dinucleótido.
Los enlaces fosfodiéster son esenciales para la vida, pues son los responsables del esqueleto de las hebras de ADN y ARN. También están presentes en los fosfolípidos, moléculas constituyentes de las bicapas lipídicas de todas las membranas celulares. Hay que tener en cuenta que este tipo de enlace conlleva dos enlaces tipo éster, pues, aunque se produzca entre nucleótidos, hay que fijarse en que hay que nombrar también a ese enlace que une al nucleósido con el grupo fosfato. Tanto en el ADN como en el ARN, el enlace fosfodiéster es el vínculo entre el átomo de carbono 3' y el carbono 5' del azúcar ribosa en el ARN y desoxirribosa en el ADN. Los grupos fosfato del enlace fosfodiéster tienen una alta carga negativa. Debido a que los grupos fosfato tienen una constante de equilibrio cercana a 0, su carga es negativa con un pH 7. 1.22 funciones de los nucleótidos y ácidos nucleicos. Las funciones de los ácidos nucleicos tienen que ver con el almacenamiento y la expresión de información genética. El ácido desoxirribonucleico (ADN) codifica la información que la célula necesita para fabricar proteínas. Un tipo de ácido nucleico relacionado con él, llamado ácido ribonucleico (ARN), presenta diversas formas moleculares y participa en la síntesis de las proteínas. 1.23 Reacciones redox biológicas. Las células vivas la reducción simplemente consiste en una ganancia de electrones y la oxidación en una pérdida de electrones. Las reacciones redox son importantes para una amplia variedad de procesos bioquímicos. Los desequilibrios en las reacciones redox celulares han sido vinculados a varias enfermedades, por lo que mantener el balance de estas reacciones es fundamental para nuestra salud. Consideremos las siguientes semireacciones: C ⇌ C4+^ +4e- O 2 +4e-^ ⇌ 2O2- En la primera, el carbono se oxida. En la segunda, el oxígeno se reduce. Juntas, las dos ecuaciones constituyen una reacción redox que parece ser algo puramente químico. Sin embargo, esta reacción constantemente ocurre en nuestro cuerpo. Las reacciones redox en los procesos biológicos
una ribosa, que se une a la base nitrogenada adenina y a la cadena de tres fosfatos. Los tres grupos fosfato se denominan —en orden del más cercano al más alejado del azúcar ribosa— alfa, beta y gamma. El ATP es inestable debido a las tres cargas negativas adyacentes en su cola fosfato, la cuales no se "quieren" e intentan alejarse entre ellas. Los enlaces entre los grupos fosfato se llaman enlaces fosfoanhídridos y puedes encontrar que se conocen como enlaces de "alta energía". El guanosín trifosfato (GTP) también conocido como guanosina-5'-trifosfato, es uno de los nucleótidos trifosfato usados en el metabolismo celular junto al ATP, CTP, TTP y UTP. El GTP es un nucleótido cuya base nitrogenada es la purina guanina. Su función es similar a la del ATP, dado que también es utilizado como moneda energética. Además el GTP es el precursor de la base guanina en la síntesis de ADN (replicación) y en la de ARN (transcripción). Por otro lado el GTP es esencial en ciertas vías de señalización, en las que actúa como activador de sustratos en reacciones metabólicas, al igual que hace el ATP pero de una forma más específica. En estas reacciones, como por ejemplo cuando se asocia a proteínas G, el GTP actúa como segundo mensajero, activando a la proteína G al unirse a esta. Cuando la célula requiere cambiar el estado de activación de esa proteína, entra en acción una proteína GTPasa, que convierte el GTP del complejo GTP-proteína G, a GDP, liberando un sustrato GDP-proteína G inactivo.
Transferencia de energía: El GTP está implicado en la transferencia de energía en el interior de la célula. Por ejemplo, una molécula de GTP es generada en cada recorrido del ciclo de Krebs. Su energía es equivalente a la de generar una molécula de ATP, de hecho, es rápidamente convertida a este. 1.25 rutas catabólicas y anabólicas de las biomoleculas en los diferentes organismos vivos. El catabolismo es la parte del proceso metabólico que consiste en la degradación de nutrientes orgánicos transformándolos en productos finales simples, con el fin de extraer de ellos energía química útil para la célula. La energía liberada por las reacciones catabólicas es usada en la síntesis del ATP.
1. Glúcidos A pesar de su bajo rendimiento energético, la fermentación es utilizada por los humanos tanto de forma biológica (en la acción muscular) como de forma industrial para la fabricación de pan o de bebidas alcohólicas como en la imagen. Tras la digestión, mediante la que los polisacáridos se transforman en glucosa, las moléculas de glucosa siguen tanto en organismos aeróbicos como anaeróbicos la glucólisis, que tiene como resultado la producción de ATP y piruvato. En ausencia de oxígeno el piruvato podrá seguir su catabolización mediante la fermentación. En presencia de oxígeno, el piruvato será oxidado a acetil-CoA para ser degradado en el ciclo de Krebs y producir un mayor número de moléculas de ATP mediante la cadena de transporte de electrones.
- Glucólisis: Es un proceso anaerobio, no es necesaria la presencia de oxígeno. Tras la digestión en la que los polisacáridos han sido degradados a glucosa, se lleva a cabo la glucólisis que degradará, mediante una serie de diez reacciones, cada molécula de glucosa en dos moléculas de piruvato. La reacción global de la degradación de una molécula de glucosa es la siguiente
vías catabólicas de aminoácidos (p. ej. desaminación oxidativa), la beta oxidación de ácidos grasos y la glucólisis. La tercera etapa es la fosforilación oxidativa, en la cual el poder reductor (NADH y FADH2) generado se emplea para la síntesis de ATP según la teoría del acomplamiento quimiosmótico. El ciclo de Krebs también proporciona precursores para muchas biomoléculas, como ciertos aminoácidos. Por ello se considera una vía anfibólica, es decir, catabólica y anabólica al mismo tiempo.
Análisis de bioproductos.
2.1 Buenas pratcicas de laboratorio Las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) representan un sistema de calidad relacionado con los procesos organizativos y las condiciones bajo las cuales los estudios no clínicos de seguridad sanitaria y medioambiental son planificados, realizados, controlados, registrados, archivados e informados. Los principios de las BPL establecen las pautas relativas a: · Organización y personal de la entidad de ensayo · Programa de garantía de calidad · Instalaciones · Aparatos, materiales y reactivos · Sistemas experimentales · Productos de ensayo y de referencia · Procedimientos normalizados de trabajo (PNT) · Realización del estudio · Información de los resultados del estudio · Archivos y conservación de registros y materiales Estos principios deben seguirse para realizar ensayos no clínicos de seguridad, efectuados con fines reglamentarios, de todos los productos químicos, tales como cosméticos, productos químicos industriales, productos farmacéuticos, aditivos alimentarios, aditivos para piensos, productos fitosanitarios y biocidas, con objeto de determinar sus efectos en las personas, los animales y el medio ambiente. Los principios de BPL fueron adoptados por el Consejo de la Organización de Cooperación y Desarrollo Económico (OCDE) el 12 de mayo de 1981, con la recomendación de que los países miembros los aplicasen en los ensayos con productos químicos. 2.2 análisis químico. Un análisis químico es el conjunto de técnicas y procedimientos empleados en muchos campos de la ciencia para identificar y cuantificar la composición química de una sustancia mediante diferentes métodos. En el sector alimentario el análisis
