UNIVERSIDAD MARÍA AUXILIADORA - UMA
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MSc. Stephanie Barbachán O.
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
FARMACOBOTÁNICA
GUÍA DE PRÁCTICAS
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Guía de practica Botanica, Diapositivas de Botánica y Agronomía
. 2024 . FARMACOBOTANICA . GUIA DE PRÁCTICAS , PARA CLASES
Tipo: Diapositivas
2023/2024
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UNIVERSIDAD MARÍA AUXILIADORA - UMA
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
FARMACOBOTÁNICA
GUÍA DE PRÁCTICAS
Ciclo 2024 - I
- PRÁCTICA N° 1: TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA, RECOLECCIÓN Y HERBORIZACIÓN Contenido
- PRÁCTICA N° 2: CONTROL DE CALIDAD DE DROGAS VEGETALES
- PRÁCTICA N° 3: CITOLOGÍA VEGETAL.........................................................................................
- PRÁCTICA N° 4: HISTOLOGÍA VEGETAL: EPIDERMIS, ESTOMAS Y TRICOMAS
- PRÁCTICA N° 5: HISTOLOGÍA VEGETAL: TEJIDO CONDUCTOR Y PROTECTOR………………………….
- PRACTICA Nº 6 HISTOLOGIA VEGETAL: TEJIDO EXCRETOR Y SECRETOR………………………………….
- PRÁCTICA N° 7 : MORFOLOGÍA DE LA RAÍZ
- PRÁCTICA N° 8 : MORFOLOGÍA DEL TALLO
- PRÁCTICA N° 9 : MORFOLOGÍA DE LA HOJA
- PRÁCTICA N° 10 : MORFOLOGÍA DE LA FLOR, INFLORESCENCIA.
- PRACTICA Nº 1 1 : MORFOLOGIA DEL FRUTO ……..……………………………………………………………………
- PRÁCTICA N° 12 : MORFOLOGÍA DE LA SEMILLA
- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
coagulación de las proteínas, evitando la contracción de la célula. Solo en estudios de nucléolos y mitocondrias se utilizan fijadores básicos
3. PROCEDIMIENTO
3.1 Fijación
Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas a las de su estado vivo. Así, los fijadores evitan la autolisis, protegen frente a ataques bacterianos, insolubiliza elementos solubles a estudiar, evita distorsiones y retracciones tisulares. No existe un fijador universal, ni un método de fijación único. Incluso podemos usar varios fijadores secuencialmente según nuestras necesidades. Los fijadores pueden ser simples o compuestos.
- Fijadores simples: El etanol, metanol, acetona fijan por deshidratación y coagulación de las proteínas, sobre todo las citosólicas. Extraen los lípidos de los tejidos, pero no afectan a los carbohidratos. El metanol es mejor fijador que el etanol puesto que no causa tanto endurecimiento del tejido y aporta una mejor preservación. En general, son buenos fijadores de muestras de pequeño tamaño, y preservan bien algunas proteínas como las enzimas, también glucógeno, y pigmentos.
- Fijadores compuestos : FAA (formol, ácido acético, alcohol etilico 96% y Agua 10:5:50:35). es el fijador más usado para estudios taxonómicos e histológicos. Puede ser preparado con uno o varios días de anticipación. Se aconseja utilizar el material después de 24 - 48 h de fijación como mínimo. No debe permanecer indefinidamente en el mismofijador ya que el material se endurece y se torna quebradizo, lo más indicado es pasarlo a alcohol70º luego del tiempo de fijación. Procedimiento para la fijación del material Una vez cortado el órgano a estudiar, colocarlo inmediatamente en el fijador. Si esto no es posible de hacer en el acto, para evitar la deshidratación del material, éste debe colocarse en bolsas plásticas cerradas conteniendo un algodón embebido en agua, y conservar en frío (-4°C) hasta su fijación en el laboratorio. El volumen del fijador debe cubrir el material a fijar. Si el material es grande, debe subdividirse en trozos chicos para que el fijador penetre fácilmente.
3.2 Técnicas de corte
Las características tisulares y celulares se observan con los microscopios. Sin embargo, con estos aparatos sólo se pueden observar muestras de tejido que tengan un grosor muy pequeño, ya que de no ser así hay problemas de difusión y penetración de la luz en el caso de los microscopios ópticos y de penetración de los electrones en el caso del microscopio electrónico de transmisión. Por tanto, las secciones de los tejidos que queremos estudiar pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanómetros hasta centenares de micras. Algunos tejidos vegetales, por sus características celulares, permiten su observación en secciones de cientos de micras de grosor. Las secciones de un grosor de micrómetros se realizan con aparatos mecánicos denominados micrótomos y existen diferentes tipos según el grosor que deseamos conseguir.
3.2.1 Unidades de uso corriente en microscopía La unidad más utilizada es el micrón, micra o micrómetro (μm). Un micrómetro equivale a: Un micrómetro equivale a una milésima de milímetro: 1 μm = 0,001 mm= 10 - 3 mm Una millonésima de metro: 1 μm = 0,000 001 m = 10 - 6 m Mil nanómetros: 1 μm = 1000 nm 1 mm = 1000 μm 1 m = 1 000 000 μm 1nm = 0,001 μm 3.2.2 Tipos de cortes Fig.1 Los cortes o secciones pueden ser transversal y longitudinal (Fig. 3). Fig. 3. A. Corte transversal. B. Corte longitudinal radial. C. Corte longitudinal tangencial 3.2.3 Corte a mano libre: este tipo de corte se puede realizar bajo lupa o con soportes. A mano libre bajo lupa: se coloca el material de estudio sobre el portaobjeto y los cortes se realizan con el elemento cortante (hoja de afeitar, navaja, trincheta o bisturí). Para asegurar un buen corte es necesario que los mismos se realicen en forma perfectamente paralela a la superficie del órgano, para evitar el seccionado a bisel. Una vez realizados los cortes se seleccionarán los más finos, donde los tejidos se observan con claridad y se debe tener en cuenta que el órgano a estudiar esté completo. No debe descartar los otros cortes ya que pueden contribuir en la interpretación del órgano en estudio. Posteriormente, se procede a clarificar los cortes realizados con hipoclorito de sodio 50%, el tiempo de exposición dependerá del material (generalmente entre 1 a 4 minutos). Luego se realizan lavados con agua destilada, repetidas veces, hasta quitar completamente la lavandina. Finalmente estos cortes pueden o no ser teñidos y montados. A mano libre con soporte: se pueden utilizar como soporte a la médula de sauco ( Sambucus peruviana ) o zanahoria ( Daucus carota). Para ello se divide longitudinalmente el soporte elegido, luego se procede a calar un semicírculo, en cada parte, entre las que se colocará el material a ser seccionado
Safranina La solución stock se prepara disolviendo 2,25 g de safranina en 225 ml de alcohol etílico 96º. El fraccionamiento para su uso consiste en diluir parte de esta solución stock en volúmenes iguales de agua destilada o alcohol 50º. El tiempo de exposición de los cortes va desde unos minutos hasta media hora. La coloración que se obtiene es duradera (salvo cuando el material se montó en gelatina glicerinada, que tiende a diluir el colorante). .Tiñe: las paredes secundarias lignificadas se tiñen de rojo intenso y también la cutícula. Los parénquimas toman color rosado. Este colorante no es específico para la detección de lignina. b- Metacromáticos: el mismo colorante tiñe de manera diferencial distintas estructuras según su composición química. Azul de toluidina Disolver 2,5 g de carbonato de sodio en agua destilada, agregar 0,5 g de azul de toluidina y completar a 100 ml con agua destilada. Se emplea en solución acuosa de pH 11 a 11,1. También se puede preparar una solución de azul de toluidina al 0,2%, otra de carbonato de Na al 2,5% y Mezclar partes iguales en el momento de usar. .Tiñe: azul a rosado dependiendo de la naturaleza de la pared c- Combinadas: se emplean varios colorantes, ya sea de manera sucesiva o simultánea. Safranina - Fast Green
- Clarificar los cortes con hipoclorito de NA 50%, lavar varias veces con agua destilada (5 a 6 veces).
- Pasar por alcohol 70°.
- Colorear con safranina a saturación en alcohol 80° durante 10 minutos - 24 h (según el material).
- Realizar un pasaje rápido por alcohol 96°.
- Colorear con verde rápido a saturación en alcohol 100° durante 30 segundos a 1 minuto.
- Realizar pasaje rápido por alcohol 100° (2 cambios).
- Pasar por xilol (2 cambios).
- Montar en bálsamo de Canadá. .Tiñe: paredes secundarias lignificadas de rojo (a veces más oscuro o castaño), paredes primarias o secundarias no lignificadas se colorean de celeste verdoso. d- Indirectas: es necesario que el material a colorear sea previamente tratado con unmordiente (sustancia que lo hace afín al colorante) por Ej.: Hematoxilina. 3.4.2 Vitales: son colorantes poco tóxicos empleados en tejidos vivos ya que no afectan la vida celular, se utilizan en soluciones muy diluidas. Ej: rojo neutro y Verde de jano.
3.5 Test histoquímicos
Cloruro férrico al 10% y carbonato de sodio al 2% : Para detectar taninos A los cortes frescos agregar unas gotas de solución acuosa de cloruro férrico con una pequeña cantidad de la solución acuosa de carbonato de sodio, dejar actuar 2 a 3 minutos y lavar. Una coloración azul-verdosa indica la presencia de taninos.
Otra alternativa para detectar taninos es colocar los cortes en una solución de formol al 10% en la que se ha disuelto 2 g de sulfato férrico. Si hay taninos se observa una coloración azul oscura. Floroglucina : Para detectar lignina
- Clarificar los cortes con hipoclorito de Na (lavandina) al 50% hasta que se observen blancos o casi transparentes (según el material).
- Lavar varias veces con agua destilada (5-6 veces).
- agregar la floroglucina al 1% en alcohol 96º.
- Colocar el cubre y flamear sobre llama, suavemente.
- Retirar de la llama y colocar, en el borde del cubreobjeto, una gota de solución de ácido clorhídrico al 25%, este penetrará coloreando de rojo violáceo las paredes lignificadas. Es una tinción temporal. Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol) : Para detectar almidón Disolver 1 g de ioduro de potasio en 100 ml de agua destilada. Agregar 0,3 g de iodo sublimado. Agitar hasta que el iodo se disuelva. El almidón se tiñe de color azul o azul violáceo Sudán III : Para detectar grasas y aceites
- Lavar los cortes obtenidos por congelación con alcohol de 70°.
- Poner varias gotas del colorante sobre el corte que se desea teñir durante 15 minutos.
- Lavar con alcohol de 70°.
- Montar en glicerogelatina. No es una preparación permanente; no montar en bálsamo ya que se decolora. El Sudan III tiñe de rojo-anaranjado la cutícula y las partes lipófilas de los cortes. Puede completarse la coloración con otro colorante de contraste
4. MATERIALES
- Guantes
- Agua Destilada
- Lupa
- Bisturí Nº 20
- Cubreobjetos
- Portaobjetos
- Pinza
- gotero
5. MUESTRAS
- Zanahoria pequeña ( Daucus carota )
- Cebolla ( Allium cepa)
- Tallo de apio ( Apium graveolens )
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CURSO DE FARMACOBOTÁNICA
PRÁCTICA N° 2: CONTROL DE CALIDAD DE DROGAS VEGETALES
1. OBJETIVOS
- Elaborar protocolos para asegurar el control de calidad de drogas vegetales que serán empleadas en fitomedicamentos.
2. INTRODUCCIÓN
Para lograr una completa estandarización de los medicamentos herbarios, se debe de iniciar analizando la planta; controlando los pasos de producción antes de realizar el control final de los parámetros de seguridad de la línea de producción, debido a que el material vegetal es el que forma parte activa del medicamento y la que tiene las características de potencia, eficacia y calidad del producto terminado. Si se encontrase baja calidad del material vegetal o su inconsistencia, se hará imposible cualquier control de calidad significativo durante el proceso de elaboración de los productos fitoterapéuticos o será imposible asegurar la calidad del producto terminado. Para lograr la calidad de un producto, es necesario describir parámetros que sirvan para determinar la materia prima en su elaboración, es decir para describir la calidad de una droga vegetal; entre los que se pueden mencionar: a) Trazabilidad: Es la recopilación de información sobre el lugar de procedencia, condiciones climáticas de la zona de cultivo, tipo de cultivo (ejemplo: orgánico), características de la recolección, características del transporte (ejemplo: temperatura, humedad, tiempo, etc.) y datos del agricultor o empresa proveedora, pre-tratamientos (ejemplo: lavado, secado, selección, fermentación, etc.), condiciones de almacenamiento, y otras actividades previas a la recepción de la droga vegetal. La trazabilidad permite la evaluación del cumplimiento de las Buenas Prácticas Agrícolas (BPA) de las plantas medicinales de interés. b) Identidad: Permiten la identificación completa del material vegetal. Esta identificación se puede realizar a través de características macroscópicas, microscópicas y fitoquímicas de la planta. La fitoquímica se realiza a través de la utilización de reacciones histoquímicas entre las que se encuentran: La presencia de granos de almidón y de aleurona, la detección de paredes celulósicas, lignificadas, suberificada y cutículas, cristales de carbonato y oxalato de calcio, y metabolitos esenciales tales como: grasas, aceites volátiles, resinas, mucílagos, taninos, etc. c) Características organolépticas: Es la evaluación del material vegetal a través de sus características siendo percibidos por los sentidos, evaluando color, olor, sonidos o chasquidos, frescura, consistencia, textura, entre otros. d) Perfil cromatográfico : Es la clasificación de las plantas basada en sus constituyentes químicos activos, los constituyentes químicos más comúnmente encontrados son metabolitos primarios y secundarios; los cuales contribuyen a la identificación del material vegetal. Entre los constituyentes se encuentran: alcaloides, flavonoides, saponinas, antracenos, aceites esenciales, glicósidos cardiotónicos, cumarinas y ácidos fenolcarboxílicos, entre otros.
Estos constituyentes son conocidos por tener actividad farmacológica y además son la base de la quimiotaxonomía de la planta; éstos suelen ser específicos en ciertas clases botánicas,órdenes y familias e inclusive suelen ser exclusivos de especies por lo que pueden ser usados como compuestos marcadores que identifican apropiadamente el material vegetal e) Humedad: Permite determinar el agua libre que contiene el material vegetal, además conocer si el proceso de secado fue el correcto para conservar su calidad y así proveer un mejor almacenamiento y conservación evitando las reacciones de enmohecimiento y la contaminación bacteriana, el contenido de humedad ha de ser inferior al 10%. f) Cenizas : Constituyen el residuo después de la incineración de la planta, lo cual se obtiene por calcinación en mufla a 400ºC durante 24 hrs. Las cenizas representan las sales inorgánicas que normalmente contienen la droga y las adheridas, así mismo la materia inorgánica que posiblemente se le añadió para adulterarla o las trazas de fertilizantes presentes. Su determinación es de gran importancia para juzgar la identidad, adulteración y la pureza de la droga vegetal. De las cenizas obtenidas se puede evaluar el contenido de elementos minerales disolviéndolos en HCl (1:1). g) Materia extraña: Consiste en la identificación al ojo y estereoscópicamente de las características de la muestra en análisis de cualquier material, contaminación animal, vegetal, mineral o parte de la planta diferente a la conocida. Esto se evalúa realizando comparaciones con estándares obtenidos de especificaciones de farmacopeas propias de cada país o las normas internacionales, para materia extraña se acepta un 2%. h) Caracterización e identificación botánica: La caracterización botánica es uno de los elementos que permite verificar el control de calidad del material vegetal, esto se realiza ya que las drogas vegetales tienen una serie de elementos apreciables observados bajo lupa o microscopio óptico, los cuales le son propios y característicos que permiten su correcta identificación. Primordialmente para la verificación de las propiedades del material vegetal se necesita su identificación a través de la designación por su nombre científico. En la droga vegetal se debe de indicar la especie, subespecie, variedad e indicar la cantidad estipulada de principio activo que la droga debe contener. La identificación botánica se realiza comparando la droga con una droga patrón, con farmacopeas o literaturas especializadas realizando comparaciones por medios indirectos o directos. Los directos se realizan a ojo o con lupa de poco aumento los cuales nos dan caracteres macroscópicos y con ayuda de los sentidos se determina el aspecto general, la superficie y el sabor. Mientras que los indirectos se encuadran en 3 categorías: procesos físicos (microscopía y cromatografía), procesos químicos (reacciones de caracterización e incineración) y los procesos biológicos (hemólisis y hemoaglutinación).
3. MATERIALES Y EQUIPOS
- Guantes
- Agua Destilada
- Papel craft
- Tijera
- Hoja bond
- Lupa
- Bisturí
6.2 Ficha de Trazabilidad
6.3 Protocolo de Identificación Botánica
8.3 Lea, indique y explique brevemente cada capítulo del Manual de BPA. Realice un esquema. Sugerencias o comentarios del estudiante: FECHA DE REVISIÓN: ESTADO: Completo Incompleto En blanco
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CURSO DE FARMACOBOTÁNICA
PRÁCTICA N° 3: CITOLOGÍA VEGETAL
1. OBJETIVOS
- Reconocer la estructura de una célula eucariota vegetal
- Identificar los distintos organoides e inclusiones citoplasmáticas.
2. INTRODUCCIÓN
La célula es la unidad estructural y funcional de los seres vivos. Toda célula eucariota tiene sistema de membranas que la divide en compartimentos. La célula vegetal presenta una estructura y orgánulos exclusivos. Es posible estudiar los aspectos morfológicos celulares más aparentes con el microscopio de luz. Sin embargo, los detalles estructurales son muchas veces observables solamente a gran resolución y requieren métodos especiales como el uso de microscopio electrónico. También es importante anotar que, las estructuras celulares presentan en general muy poco contraste entre si y es necesario hacerlas resaltar selectivamente, ya sea mediante la reacción química con tinciones específicas que destaquen la reacción química con elementos celulares o aumenten específicamente la densidad óptica de los mismos o bien mediante ciertas técnicas de sombreado que permitan apreciar los relieves de la superficie que se observen. Plastidios Los plastos, plástidos o plastidios son orgánulos celulares eucarióticos, propios de las plantas y algas. Su función principal es la producción y almacenamiento de importantes compuestos químicos usados por la célula. Así, juegan un papel importante en los procesos como la fotosíntesis, la síntesis de lípidos y aminoácidos, determinando el color de frutas y flores, entre otras funciones. Pero paulatinamente, van haciéndose claramente distintos, pues laboran sustancias bien definidas. De acuerdo con esto se reconocen los leucoplastos, los cloroplastos y los cromoplastos.
3. MATERIALES Y EQUIPOS
- Microscopio
- Bisturí
- Cubre y portaobjetos
- Corcho o corteza de sauco
- Agua destilada
- Glicerina
- Alcohol 96° y 70°
- Solución de lugol
- Safranina
- Safranina con verde rápido
- Aceite de inmersión o bálsamo de Canadá
a. Raspe con un poraobjetos un trozo de papa pelada. b. Agregue una gota de lugol diluido, cubra, observe y esquematice. c. Utilice el mismo procedimiento en media semilla de frejol (previamente remojada durante 24hrs) y con maíz.
5.3. Observación de inclusiones
5.3.1 Drusas de carbonato y oxalato cálcico
Observe cortes transversales de hojas o tallos de tilo o ruda y esquematice. 5.3.2 Rafidios Observe cortes transversales de hojas, tallos y raíces de uva. 5.3.3 Cistolitos Observe el corte transversal de hojas de ortiga y esquematice. 5.3.4 Prismas Observe el corte transversal de hoja de coca. Esquematice. 5.3.5 Areniscas Observe hojas diafanizadas de paico. Esquematice.
6. RESULTADOS
6.1 Esquematización de célula viva y muerta. Indicar partes.
6.2 Esquematización de plastidios observados en la práctica. Identificar cloroplastos y
amiloplastos.