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Guías de trabajos prácticos de laboratorio - AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO Géneros BAL y sus aplicaciones: fermentos, probióticos, efectos nutricionales y terapéuticos, defensa inmunitaria, preservación de alimentos, ensilaje. Protocolo del trabajo práctico - ENRIQUECIMIENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ESPORULADAS PRODUCTORAS DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS Y SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS Características, hábitats, aplicaciones. Producción de enzimas hidrolíticas de parte de especies del género Bacillus (serina proteasas, metaloproteasas, amilasas, cisteína proteasas, aspártico proteasas). Protocolo del trabajo práctico + clave dicotómica - RECUENTO, ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS CON CAPACIDAD DE DEGRADAR HIDROCARBUROS Y XENOBIÓTICOS Definición de hidrocarburos, xenobióticos. Mención de biorremediación, persistencia, recalcitrancia, biorreactores, biorremediación intrínseca. Protocolo del trabajo práctico.
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO
TRABAJOS PRÁCTICOS DE LABORATORIO
Microbiología II, código 2161
Año 2021
Docentes:
Dra. Carina Magnoli
Dr. Germán Barros
Dra. Sofía Palacios
Dra. Cecilia Carranza
Dra. Eugenia Cendoya
TRABAJO PRÁCTICO N° 1
1- Brindar al alumno el conocimiento y las herramientas metodológicas que permitan reconocer la importancia del aislamiento, a partir de alimentos, y caracterización de bacterias lácticas con potencialidad probiótica. 2- Contribuir a reconocer la importancia de las bacterias lácticas y su potencial uso en biotecnología.
Aislar las bacterias lácticas presentes en muestras como kefir o yogur. Identificar de manera presuntiva los aislamientos por pruebas fisiológicas convencionales. Seleccionar los aislamientos pertenecientes al grupo fisiológico de bacterias lácticas. Caracterizar los aislamientos obtenidos de las muestras con relación a sus propiedades benéficas (capacidad de producir sustancias antimicrobianas, tolerar valores de pH ácido y la presencia de sales biliares) y propiedades tecnológicas (desarrollar en presencia de NaCl y a temperaturas extremas). Determinar el perfil de resistencia- sensibilidad a los antibióticos de los aislamientos obtenidos. Identificar los aislamientos seleccionados por el sistema comercial API50CHL.
Las bacterias lácticas o bacterias ácido-lácticas (BAL), participan en gran número de fermentaciones espontáneas en los alimentos. A través del tiempo, el hombre ha utilizado los procesos fermentativos característicos de las bacterias lácticas para preservar los alimentos y garantizar una vida más prolongada. Los productos lácteos fermentados (queso, yogur, manteca), han sido mencionados en los textos Mesopotámicos antiguos y en la Biblia. Hay referencias en textos arcaicos de Uruk/ Warka (Iraq), que datan del año 3200 A.C. Descubrimientos realizados en excavaciones en Suiza, muestran que el pan fermentado fue utilizado en la dieta típica de sus habitantes hace 5000 años. También el pan fermentado fue mencionado en la Biblia. El concepto de bacterias lácticas o bacterias del ácido láctico, responsables de las fermentaciones naturales , se comenzó a utilizar en los albores de 1900. En un comienzo, la habilidad para fermentar y coagular la leche fueron propiedades utilizadas para agrupar a los microorganismos como BAL. Este grupo incluía bacterias coliformes y bacterias lácticas. La descripción de
degradar hexosas o pentosas según estén presentes las enzimas claves aldolasa o fosfocetolasa de la fermentación homoláctica o heteroláctica, respectivamente.
Género Lactococcus CARACTERÍSTICAS: Cocos Gram (+), esféricos u ovales, en pares o en cadenas más o menos largas, microaerófílos, catalasa negativos. Fermentadores estrictos, con producción de L (+) ácido láctico. Poseen requerimientos nutricionales complejos. En medios sintéticos, requieren de aminoácidos tales como isoleucina, valina, leucina, histidina, metionina, arginina y prolina; y vitaminas (niacina, pantotenato de calcio y biotina).
HABITAT: Los lactococos han sido detectados directamente o por procedimientos de enriquecimiento en plantas, incluyendo judías blancas, repollo, lechuga, arvejas, pepinos y papas. Son poco comunes en suelo o materia fecal.
Género Pediococcus CARACTERÍSTICAS: Cocos Gram (+), con división en dos planos que resulta en la formación de tétradas no siempre detectables; a menudo se observan pares de cocos o paquetes. Son anaerobios aerotolerantes, catalasa negativos. Producen D y L ácido láctico, a excepción de Pediococcus dextrinicus y Pediococcus halophilus , que producen L ácido láctico.
HABITAT: Se encuentra en una gran variedad de plantas y frutas, aunque en pequeño número. Es el género prevalente de BAL presente en las primeras etapas de la fermentación de productos tales como ensilado, pepinos, aceitunas o judías. Asimismo, es frecuente su aislamiento a partir de alimentos proteicos tales como carne cruda y curada, pescado fresco, embutidos y quesos. Puede ser aislado de cerveza y ocasionalmente de vino y sidra, como de alimentos en salmuera.
Género Leuconostoc CARACTERÍSTICAS: Son cocos o cocobacilos Gram (+), microaerófilos, con crecimiento óptimo en condiciones de atmósfera reducida (N 2 , H 2 , o CO 2 o sobres generadores de anaerobiosis), a 20-25°C, durante 48 hs a 10 días. Los requerimientos de crecimiento son complejos, requieren carbohidratos, aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos, vitaminas. Todas las cepas requieren biotina, nicotina, tiamina y ácido pantoténico. Las propiedades fisiológicas son semejantes a las otras bacterias del ácido láctico. Los productos finales obtenidos son CO 2 , etanol y ácido D (-) láctico, aunque algunas cepas producen acetato en lugar de etanol. Prefieren pH neutro o ligeramente ácido, siendo menos acidúricos que los lactobacilos. Poseen crecimiento óptimo entre 20 y 30°C, con un mínimo a 5°C.
HABITAT: Pueden ser aislados a partir de vegetales como uvas y sus hojas.
APLICACIONES Las bacterias lácticas juegan un rol fundamental en la mayoría de los procesos de obtención de alimentos fermentados. A partir de 1900 el desarrollo de
la industria de transformación de los alimentos ha conducido a la producción industrial de bacterias lácticas adaptadas a diferentes derivados lácteos. Las bacterias lácticas producidas como fermentos comerciales son cultivos puros o mezclas de microorganismos pertenecientes a los géneros Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus. Normalmente las especies bacterianas que sirven de base para la elaboración de fermentos se caracterizan por la acidificación, la proteólisis, la formación de aromas, la obtención de una textura particular. Con el desarrollo de la ingeniería genética se han logrado el desarrollo de cepas modificadas genéticamente con nuevas propiedades. Las cepas utilizadas como fermento deben poseer diversas propiedades, tales como: Deben ser capaces de transformar el alimento en un nuevo producto con propiedades definidas y constantes. Deben permitir una adecuada conservación del alimento protegiéndolo del deterioro por otros microorganismos. La acidificación es una propiedad del metabolismo de las BAL que contribuye en este sentido, como así también la producción de bacteriocinas. Estas proteínas antimicrobianas inhiben a las bacterias patógenas sin provocar cambios en las propiedades físico-químicas de los alimentos preservados.
El cultivo del organismo a escala industrial reconoce la necesidad de que la cepa sea adaptada a un transportador (carrier) adecuado o sustrato fermentable (leche), y el producto final tenga una vida media aceptable y atributos tales como color, sabor, aroma y textura. Las cepas deberían presentar elevada viabilidad celular y mantener la actividad metabólica por un tiempo que exceda el de la fecha de consumo.
El crecimiento de bacterias en leche y su actividad en quesos tiene consecuencias benéficas para el alimento. La fermentación de la lactosa en ácido láctico acidifica el medio y junto a la proteólisis de la caseína contribuye a la coagulación de la leche y la formación de la cuajada. Ciertas cepas de Lactococcus lactis biovar diacetylactis o ciertas cepas de Leuconostoc contribuyen al sabor de la manteca y otros productos lácteos mediante la producción de diacetilo. Las bacterias lácticas termófilas Lactobacillus bulgaricus producen acetaldehído a partir de ciertos aminoácidos presentes en la leche. Las bacterias fermentadoras como Leuconostoc producen etanol y acetato contribuyendo a la producción del aroma característico. Todas estas actividades requieren de un buen crecimiento de las bacterias en la leche. Las transformaciones lácteas pueden resultar inhibidas como consecuencia de fagos virulentos que atacan los fermentos lácticos durante su utilización.
PROBIÓTICO A partir de Pasteur, la importancia de la biota intestinal ha sido reconocida, en particular Bifidobacterium y dentro de las bacterias lácticas Lactobacillus. Los desarrollos científicos recientes han abierto nuevas fronteras y posibilitado un mejor entendimiento de la fisiología del tracto gastrointestinal como un complejo y delicado ecosistema balanceado. Actualmente tanto la FAO como la OMS definen a
Estado de salud del hospedador, propiedad que exige el aislamiento de la cepa probiótica a partir de hospedadores con buen estado de salud. Resistencia a antibióticos, propiedad que demanda la ausencia en el microorganismo probiótico de genes transmisibles de resistencia a antibióticos de interés epidemiológico. Las dos últimas propiedades se han incluido recientemente.
EFECTOS NUTRICIONALES EN ALIMENTACIÓN HUMANA Estas bacterias estimulan la digestión de los alimentos a través de la acidificación del medio, y de su capacidad lipolítica y proteolítica. La hidrólisis de proteínas enriquece al medio en aminoácidos libres. El consumo periódico de productos lácteos conteniendo microorganismos beneficiosos tales como Lactobacillus delbruckii subsp. bulgaricu s, por individuos con intolerancia a la lactosa disminuye los síntomas de la intolerancia asociados con el consumo de leche. Este efecto es atribuido a la presencia de ß-galactosidasa (ß- GAL) intracelular, que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa. Esta enzima es estable al pasaje a través del tracto gastrointestinal e hidroliza la lactosa in vivo.
EFECTOS TERAPEÚTICOS SOBRE LA ESPECIE HUMANA Los probióticos han sido usados con fines terapéuticos para modular la inmunidad, disminuir el colesterol, tratar la artritis reumatoidea, prevenir el cáncer, mejorar la intolerancia a la lactosa, reducir los efectos de la diarrea, constipación, candidiasis e infecciones del tracto urinario, actúan sobre la estructura del epitelio intestinal, el número de células productoras de mucus y la rapidez de la renovación celular. Debido a esto son consideradas probióticos o promotores de la salud humana y animal, entre otros microorganismos también considerados como tales. Por ejemplo, Lactobacillus rhamnosus GG es el probiótico más extensamente estudiado en niños y adultos. En adultos, la administración oral de dosis superiores a 10^9 UFC/día coloniza el intestino, al menos de manera temporaria y reduce la diarrea.
TRÁNSITO INTESTINAL El consumo de Lactobacillus acidophilus reduce la constipación, por estimulación de la mucosa intestinal y de la capa muscular subyacente. De igual manera, coloniza el intestino, restaura el equilibrio de la biota intestinal alterado por la acción de los antibióticos. Existen evidencias sobre el rol de las BAL en la prevención y disminución de la severidad de las enfermedades diarreicas, atribuible a un efecto osmótico.
EQUILIBRIO DEL MICROBIOMA INTESTINAL La acidificación del medio intestinal mejora el tránsito intestinal y contribuye a inhibir numerosas bacterias patógenas como E. coli y Salmonell a. En este último caso, el ácido láctico inhibe el metabolismo oxidativo, disminuye el pH intracelular y posee efecto bactericida. Las bacteriocinas producidas por BAL pueden ser responsables de la inhibición de bacterias patógenas del tracto digestivo. Lactobacillus acidophilus es capaz de deconjugar las sales biliares, y así, el ácido biliar actúa más eficazmente inhibiendo el crecimiento de bacterias patógenas.
La administración oral de bacterias lácticas a ratones mejora la respuesta inmunitaria. Los probióticos pueden inducir reguladores inmunes específicos como resultado de la interacción con fagocitos mononucleares y células endoteliales intestinales. Ciertas cepas mostraron propiedades adyuvantes por estimulación de una respuesta inmune específica después de la infección con microorganismos patogénicos. La ingestión de yogur, conteniendo microorganismos beneficiosos, por 20 voluntarios sanos durante 28 días aumentó la concentración de proteínas del suero, el número de linfocitos B y células natural killer (NK), además de la concentración de interferón gamma e IgG.
FORMACIÓN DE COLESTEROL Los probióticos poseen una actividad anticolesterol a través de ciertas bacterias lácticas que pueden incorporar o adherir el colesterol a la célula. La adherencia se realiza mediante los exopolisacáridos o la pared celular, disminuyendo su disponibilidad en sangre. Se ha informado que la ingestión de Lactobacillus acidophilus disminuye la tasa de colesterol en suero sanguíneo de ratas. Ciertas cepas poseen enzimas hidrolasas que les permiten desconjugar el colesterol de las sales biliares. El colesterol puede ser asimilado por estas bacterias en anaerobiosis. Por otro lado, la acción podría ser indirecta, el aumento en el tenor de ácidos biliares libres aceleraría el metabolismo del colesterol.
El desarrollo del cáncer de colon está asociado entre otros factores a una dieta con abundantes grasas y baja en fibra. Muchas de las sustancias carcinogénicas sufren modificaciones químicas por la acción de la actividad enzimática de la microbiota gastrointestinal y en menor medida por las enzimas de la mucosa intestinal. De este modo, la microbiota intestinal juega un importante rol en el proceso carcinogénico. Las reacciones enzimáticas son clasificadas como de fase I (hidrólisis, oxidación o reducción de los componentes) y de fase II (detoxificación de los químicos a través de acilaciones, metilaciones, conjugaciones). Las reacciones de fase II proveen la mayor defensa contra los intermediarios electrofílicos y radicales libres. Si bien las enzimas de la mucosa intestinal contribuyen a la detoxificación enzimática, la microbiota es la que tiene mayor influencia. La ingestión de bacterias productoras de enzimas que incrementan las actividades de fase II, disminuye el riesgo de contraer ciertos cánceres. El consumo de yogur disminuye la actividad -glucuronidasa en el intestino, pero la actividad retorna a niveles normales cuando el yogur es eliminado de la dieta. Las ratas alimentadas con leche suplementada con Lactobacillus acidophilus poseen niveles inferiores de enzimas fecales -glucosidasa y -glucuronidasa, capaces de convertir las sustancias procancerígenas en cancerígenas. Humanos alimentados con la misma leche muestran menores niveles de enzimas fecales (- glucuronidasa, azoreductasa, nitrato reductasa).
crecimiento de bacterias Gram negativas, capaces de fermentar los azúcares y liberar ácido fórmico, acético, butírico, alcohol y anhídrido carbónico. La temperatura óptima para el desarrollo de estos grupos fisiológicos se encuentra entre 26 y 39°C y su crecimiento cesa a los 50°C. Una vez que se agota el oxígeno se inicia el proceso de fermentación por las bacterias lácticas nativas de la pastura, con producción de ácidos orgánicos, tales como láctico, acético y propiónico. El grado de fermentación alcanzado depende del contenido de azúcares fermentables y del nivel de anaerobiosis. En algunos casos se agregan granos molidos o cepas de BAL en el momento del armado del silo para asegurar la eficiencia del proceso de fermentación. Si las condiciones son adecuadas y los azúcares son transformados en ácido láctico, se inicia un período de estabilización en el cual el pH desciende de 4,2 hasta 3,5 y cesa toda actividad enzimática, incluida la de las bacterias; y el ácido láctico se convierte en el verdadero agente de conservación del ensilado. Estos procesos llevan de una a tres semanas, dependiendo del cultivo que va a ensilarse. Se debe tener en cuenta que cuanto más rápido ocurra la fermentación, mayor cantidad de nutrientes se habrá conservado.
KEFIR
El kéfir o búlgaros es una bebida artesanal que contiene una combinación de bacterias probióticas y levaduras en una matriz de proteínas, lípidos y azúcares. El kéfir es originario del Cáucaso y se utiliza desde la época de los sumerios; siempre relacionado al bienestar y a la longevidad. Se obtiene al inocular leche o agua con un cultivo iniciador de bacterias lácticas y levaduras. Ese cultivo generalmente son los nódulos del mismo kéfir. Se forman nódulos blandos y gelatinosos envueltos en una matriz polisacárida, denominada kefiran. Los principales microorganismos aislados de esta bebida son Lactobacillus acidophilus y levaduras. El desarrollo de estos microorganismos produce una bebida semejante al yogur, de mayor contenido en ácidos y con etanol, resultantes de las fermentaciones lácticas y de las levaduras, respectivamente. A esta bebida se le atribuyen efectos benéficos en la salud similares a los informados para los probióticos.
Dentro de los productos de origen bacteriano, el ácido láctico fue el primer ácido orgánico producido a partir del cultivo de bacterias. Las bacterias más frecuentemente empleadas son homofermentadoras que utilizan glucosa, como Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, y lactosuero, como Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus. El producto se obtiene por cultivo en biorreactores con un rendimiento teórico del 90% del azúcar utilizado. Este ácido es utilizado en la industria agroalimentaria como aditivo acidificante y conservante en bebidas, jugos de fruta y jarabes. En la industria farmacéutica se usa bajo la forma de sal, en la industria del tanino como acomplejante de calcio y en la industria del plástico como monómero.
PROPIEDADES TECNOLÓGICAS QUE DEBE REUNIR UNA BAL CON PROPIEDADES PROBIÓTICAS
En general las cepas potenciales probióticas deben reunir requisitos similares a otros microorganismos que se usan en procesos industriales. Es decir sus propiedades deben permanecer inalteradas luego del proceso industrial para garantizar sus efectos benéficos al consumidor. Dentro de las propiedades tecnológicas de una BAL en la industria se deben mencionar: Cepas genéticamente estables, con mínima variabilidad entre los diferentes lotes de productos. Fácilmente cultivable a gran escala. Mantener la viabilidad durante el proceso industrial. En la elaboración de lácteos como quesos duros se utilizan temperaturas variables y concentraciones elevadas de ClNa. Si se aplica a estos productos una BAL con propiedades probióticas, este microorganismo debe mantener sus propiedades y su viabilidad bajo estas condiciones. Resistencia a fagos. La infección por fagos produce una inhibición de los cultivos lácteos. Mantener la viabilidad celular y la estabilidad funcional en el producto que asegure las propiedades probióticas al consumidor.
PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Y SIEMBRA
2- SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS A PARTIR DE LAS COLONIAS AISLADAS DE LOS DIFERENTES SUSTRATOS A partir de las diferentes colonias desarrolladas en agar LAPTg y/ó en MRS realizar coloración de Gram y prueba de la catalasa. Seleccionar aquéllas que responden a las siguientes características: cocos y bacilos Gram positivos no esporulados y catalasa negativos.
Escherichia coli y Pseudomonas spp. sembrar en estrías perpendiculares a la estría central de la cepa potencialmente productora. Incubar a 37°C por 24 horas. Interpretación: (-): ausencia de zonas de inhibición de crecimiento de bacterias patógenas. (+): presencia de zonas de inhibición (> a 2 mm) de crecimiento de bacterias patógenas.
Se empleará el método de difusión en agar y se probarán los antibióticos de interés
rifampicina, vancomicina, norfloxacina, clindamicina, ampicilina sulbactam, tetraciclina, cefotaxima, eritromicina, gentamicina, ácido nalidíxico y amoxicilina. Preparar para cada aislamiento a ensayar un inóculo en caldo MRS a partir de colonias desarrolladas en agar MRS. Igualar la turbidez de los inóculos a la escala 0,5 de McFarland. Sembrar el inóculo por diseminación en superficie con hisopo en placas de Petri conteniendo medio MRS. Distribuir los discos de los diferentes antibióticos sobre la placa equidistante entre sí y con respecto al borde de la misma. Incubar las placas a 37°C por 48 hs en microaerofilia. Determinar la presencia o ausencia de halos de inhibición alrededor del disco y el diámetro de los mismos. Determinar el perfil de sensibilidad o resistencia a los antibióticos ensayados utilizando la tabla estándar correspondiente.
4.3. RESISTENCIA IN VITRO A CONDICIONES GASTROINTESTINALES. Se expondrán los aislamientos a condiciones ácidas y a sales biliares y luego se empleará el método de diseminación en superficie para comprobar la capacidad de supervivencia de los aislamientos a estas condiciones que se presentan en el tracto gastrointestinal. Para realizar este ensayo se seguirá el esquema indicado en la Figura 1. Para cada condición elegir las placas que contengan entre 30 y 300 colonias, realizar el recuento y expresar los resultados en unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml). Comparar los recuentos obtenidos en el control y en los tratamientos. Calcular el porcentaje de sobrevivientes según la fórmula:
% supervivencia: Log 10 UFC/mL Nt Log 10 UFC/mL N 0
Dónde Nt es el total de células viables después del tratamiento y N 0 es el número inicial de células inoculadas.
Figura 1: esquema de inoculación e incubación de medios para la determinación de resistencia in vitro a las condiciones gastrointestinales.
Se identificarán solo aquellos aislamientos que cumplan con los siguientes requisitos:
La identificación definitiva de los aislamientos seleccionados se realizará a través del sistema comercial rápido API50CHL (Biomerieux). A partir del aislamiento puro, realizar una suspensión en caldo LAPTg o MRS e igualar la turbidez al tubo 4 de la escala de McFarland. Sembrar en agar LAPTg o MRS un volumen de 0,1 ml de la suspensión anterior y diseminar con espátula de Drigalsky. Incubar a 30°C durante 48 a 72 horas en microaerofilia. Recoger el crecimiento bacteriano a partir del agar LAPTg o MRS y resuspender en un tubo conteniendo 2 ml de agua destilada estéril ( tubo 1 ). A partir del tubo anterior agregar “n” gotas en otro tubo conteniendo 4 ml de agua destilada estéril ( tubo 2 ) hasta igualar el tubo 2 de la escala de McFarland. Abrir la ampolla que provee el kit comercial (medio CHL), colocar “2n” gotas del tubo 1 en la ampolla. Preparar la cámara plástica donde se colocarán las galerías del sistema comercial API50CHL colocándole en los orificios de la base la cantidad necesaria de agua destilada estéril. Esto proveerá el ambiente de humedad necesario para la incubación de las galerías Sembrar las galerías del sistema comercial API50CHL, inclinando hacia adelante la cámara de incubación y llenando completamente cada galería. Evitar la formación de burbujas apoyando la punta de la pipeta en el borde superior de cada galería. Colocar vaselina estéril en cada cúpula. Incubar a 37°C durante 48 h. Realizar la lectura de los resultados a las 24 y 48 horas. Interpretación: La fermentación se traduce en un cambio de color en el tubo debido a una producción de ácido en anaerobiosis revelada por el indicador de pH del medio. El primer tubo sin principio activo sirve como testigo negativo. La oxidación se traduce por un cambio de color en la cúpula debido a una producción de ácido en aerobiosis revelada por el indicador de pH del medio. La asimilación se traduce por un crecimiento del microorganismo en la cúpula cuando el sustrato se utiliza como única fuente de carbono presente.
Sembrar agar MRS semisólido en columna a partir de la suspensión en caldo LAPTg ó MRS. La movilidad se determinará por el crecimiento bacteriano alrededor de la punción.
Colocar sobre un portaobjetos una colonia desarrollada sobre agar LAPTg ó MRS y una gota de H 2 O 2 (10 volúmenes). Homogeneizar sin utilizar ansa u otro objeto, para evitar falsos positivos. El desprendimiento inmediato de burbujas causado por la liberación de O 2 indica la presencia de la enzima catalasa.
REDUCCIÓN DE NITRATO Sembrar el medio con nitrato a partir de la suspensión en caldo LAPTg ó MRS. Incubar a 37°C durante 48 horas en microaerofilia. Agregar un par de gotas del reactivo 1 y 2 al cultivo bacteriano con desarrollo de turbidez en medio con NO 3. Usar un tubo control sin inocular.
Sembrar el medio con agua peptonada a partir de la suspensión en caldo LAPTg ó MRS. Incubar a 37°C durante 48 horas en microaerofilia. Agregar 0,2 ml. de reactivo de Kovac’s al cultivo y agitar. Reacción positiva: producción de indol; anillo rojo en la superficie; presencia de triptofanasa. Reacción negativa: sin producción de indol; anillo amarillo en la superficie; ausencia de triptofanasa. La enzima triptofanasa que hidroliza el triptófano según la siguiente reacción: Triptófano + H 2 O indol + ácido pirúvico + NH 3
ACTIVIDAD GELATINASA Sembrar por punción en caldo MRS con 1,2% de gelatina (2ml de medio en cada tubo en columna)
1- Brindar al alumno el conocimiento y las herramientas metodológicas que permitan reconocer la importancia del aislamiento, a partir de muestras naturales, de bacterias productoras de enzimas hidrolíticas y antibióticos de importancia en Biotecnología. 2- Enriquecer bacterias aerobias productoras de esporas a partir de muestras de suelo. 3- Aislar las bacterias esporuladas a partir de las muestras enriquecidas. 4- Determinar en las bacterias aisladas la capacidad de producción de enzimas hidrolíticas. 5- Determinar la producción de sustancias con actividad antimicrobiana por las bacterias esporuladas previamente aisladas. 6- Identificar preliminarmente a las cepas aisladas a nivel de género y/o especie por pruebas fisiológicas. 7- Identificar los aislamientos seleccionados por el sistema comercial API50CHL.
La familia Bacillaceae se distingue por la capacidad de formar endosporas, las cuales son estructuras altamente refráctiles redondas, ovales o cilíndricas formadas dentro de las células bacterianas. El género Bacillus está representado pos bacilos Gram positivos aerobios estrictos (la mayoría) o facultativos, con reacción positiva a la prueba de catalasa. La endosporas, como espora libre o como estructura dentro de la célula vegetativa, en cuyo caso la entidad entera se denomina esporangio, es fácilmente detectable mediante microscopía de contraste de fase. La tinción de Gram permite determinar la presencia de esporas, dado que las esporas permanecen sin teñir mientras las células vegetativas o la parte vegetativa del esporangio se tiñe. La detección microscópica de la espora y su resistencia al calor, permite con cierta facilidad el aislamiento de esporoformadores. Presentan gran variedad de tipos fisiológicos: degradadores de la mayoría de los sustratos derivados de fuentes provenientes de plantas y animales incluyendo celulosa, almidón, proteínas, agar, hidrocarburos y otros. Productores de antibióticos, nitrificantes heterótrofos, desnitrificantes, fijadores de nitrógeno,
precipitadores de hierro, oxidadores de selenio, oxidadores y reductores de manganeso, quimiorganótrofos versátiles, halófilos, alcalófilos, psicrófilos y termófilos.
HABITATS
Los bacilos esporulados han sido aislados a partir del medio ambiente (agua, suelo, polvo, larvas de insectos, heces, fuentes marinas, plantas, sedimento marino y de lagos, alimentos). Siendo saprófitas la mayoría de las especies.
Resulta difícil cuantificar el impacto de los procesos microbiológicos en la existencia humana, dada la amplia variedad de productos cuya elaboración involucra directa o indirectamente la acción de microorganismos. Los microorganismos son importantes unidades de producción de sustancias como macromoléculas o moléculas más pequeñas. Como parte de su evolución, han desarrollado mecanismos regulatorios para evitar la producción excesiva de estos compuestos, por lo que son sintetizados en pequeñas cantidades. Sin embargo la producción a nivel industrial de estas sustancias, orienta la búsqueda de cepas con capacidad de sobreproducción de un compuesto particular.
PRODUCCION DE ENZIMAS HIDROLITICAS POR ESPECIES DEL GÉNERO Bacillus
Las especies del género Bacillus han jugado un rol importante en el desarrollo de la microbiología aplicada. Las bacterias aerobias formadoras de endosporas, son una rica fuente de polimerasas extracelulares activas sobre carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos, de antibióticos y de sustancias usadas en el control de plagas. De esta manera, el espacio limitado requerido para el cultivo y la facilidad para aplicar técnicas de manipulación genética ha convertido a los microorganismos pertenecientes al género Bacillus en una fuente atractiva para la producción de sustancias de interés industrial. Dos importantes principios deben ser tenidos en cuenta para la secreción de proteínas extrañas. a-Una secuencia señal parece suficiente para iniciar el proceso de exportación de cualquier proteína, resultando en muchos casos en la secreción completa. b-La exportación de proteínas ha sido altamente conservada a través de la evolución, de forma tal que las células procariotas reconocen y procesan péptidos señal de origen eucariótico y viceversa. De esta manera, cualquier proteína puede ser potencialmente secretada por bacterias Gram positivas tal como Bacillus , aunque en E. coli estas proteínas se acumularían en el periplasma. Estas propiedades contribuyen a usar B. subtilis como huésped para el clonado de genes con fines industriales.
Las proteínas extracelulares tienen varias ventajas en biotecnología. La facilidad de recuperación y purificación y el potencial para la producción en gran escala son importantes consideraciones a tener en cuenta en la relación costo-efectividad de
