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Facultad de Salud Escuela de Microbiología y Bioanálisis Laboratorio de Bioquímica I Semestre II- 2019
Práctica No. 8 y 9. Influencia de pH y temperatura sobre la
actividad enzimática. Cinética enzimática.
María Camila Muñoz Castellanos - 2180824 Laura Valentina Ortiz Argüello - 2180828 Grupo de Laboratorio: 3 - J Fecha de la elaboración de la práctica: 2 020 - 03 - 04 Fecha de presentación del informe:2020 - 03 - 11 Objetivos
- Experimentar la actividad enzimática bajo diferentes condiciones.
- Determinar cómo diferentes factores influyen sobre la actividad catalítica de las enzimas.
- Evaluar la actividad enzimática bajo condiciones de temperatura, pH, concentración de soluto y concentración de enzima. Resultados y discusión Efecto de la temperatura Los tubos 1, 2, 3 y 4 contenían 4 mL de buffer (pH 7,5), 2 mL de NaCl y fueron llevados a temperaturas de 4°C, 25°C, 37°C y 94°C respectivamente. Esto para asegurar que en cada tubo se proporcionen condiciones óptimas de pH para la reacción. La actividad enzimática es mejor cuando se alcanza la “temperatura óptima”, toda reacción catalizada por enzimas sigue esta regla, pero las enzimas al ser proteínas lábiles, a partir del aumento de determinada temperatura se desnaturalizan debido al rompimiento de sus enlaces peptídicos (en combinación con el ácido agregado). De los resultados arrojados en la práctica se puede observar que en los tubos sometidos a temperaturas de 4°C y 25°C la enzima no ha perdido su estructura, por lo que se mantiene su función, aunque está mínimamente inhibida. A temperatura de 37°C la actividad catalítica fue máxima, por lo que esta es la temperatura óptima de la enzima alfa- amilasa, esto tiene congruencia con el hecho de que es una hidrolasa esencial en la digestión. A temperaturas altas la proteína pierde su estructura y su funcionalidad completamente, al estar desnaturalizada su actividad catalítica es nula y se evidencia con él % de intensidad de color. Figura1. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Facultad de Salud Escuela de Microbiología y Bioanálisis Laboratorio de Bioquímica I Semestre II- 2019 Tubo Sln saliva 20% (mL) Lugol (gotas) Temperatura (°C) %Int %Rxn 1 1 2 4 15 85 2 1 2 25 20 80 3 1 2 37 5 95 4 1 2 94 100 0 Efecto del pH Los tubos del 1 al 7 y el blanco (control negativo) contienen 2 mL de NaCl (0,9% p/v), 4 mL de almidón (0.5% p/v) y 4 mL de buffer a diferentes pH de 3 - 4 - 5 - 7.5 - 9 - 10 - 11 - 7. respectivamente. Posterior se adiciona 1 mL de saliva (20%) a los tubos del 1 al 7 y al blanco se le agregó 1 mL de agua. El tubo rotulado con + tiene NaCl, almidón, y saliva sin diluir. Al evaluar la velocidad de reacción en cada tubo a un pH específico, notamos que al igual que en temperatura, al pH en donde la enzima presenta máxima actividad se le conoce con el nombre de pH óptimo. Estos resultados se pueden interpretar pensando que en el pH óptimo la enzima tiene la conformación tridimensional que le permite la mayor actividad catalítica. Si se modifica este pH, la conformación nativa se pierde y la enzima ya no puede catalizar adecuadamente. Conociendo que los pH más cercanos a los del lugar donde reacciona la enzima alfa amilasa (hidrolasas digestivas, es decir, pH 6 y 7) son en los cuales se observa una mayor catálisis por parte de la enzima. Figura 2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática. Tabla 1. Efecto de la temperatura sobre la actividad catalítica de la amilasa salival representada en % de reacción y de intensidad.
Facultad de Salud Escuela de Microbiología y Bioanálisis Laboratorio de Bioquímica I Semestre II- 2019 En las reacciones de primer grado, al aumentar la enzima, aumenta la velocidad de manera constante (dependiente). Se obtuvo la gráfica esperada al evaluar el comportamiento debido a la concentración de sustrato. La cantidad de enzima presente en la solución determinará la velocidad de ésta puesto que al aumentar la concentración de enzima se está incrementando la cantidad de puntos activos que pueden reaccionar con el sustrato y por ende la velocidad de la reacción. Conclusiones
- Gracias a la práctica realizada, se puede observar el comportamiento de la actividad enzimática y qué tipos de factores pueden afectar el correcto desarrollo de ésta, como, por ejemplo, la alteración de las condiciones específicas haciendo que ésta tienda a perder o disminuir su función.
- La actividad catalítica de las enzimas es altamente dependiente de la estructura tridimensional que tenga la cadena polipeptídica. Generalmente hay una conformación nativa, que es la que tiene la enzima en el sitio en donde se encuentra de manera natural (citoplasma, sangre etc.), por tal razón, es de vital importancia que, al transferir estas proteínas de su medio natural al tubo de ensayo, modificar lo menos posible las condiciones del medio en que se encuentra la enzima, ya que, de lo contrario corre un alto riesgo de inhibirla.
- Al evaluar la actividad enzimática, gráficamente podemos observar que en los casos en que la cantidad de sustrato es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. Por el contrario, en altas concentraciones de sustrato, o cuando se llega saturan todos los sitios activos de la enzima, la velocidad ya no depende de del sustrato y, por tanto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax). Gráfica 1. Comportamiento enzimático a diferentes concentraciones de enzima.
Facultad de Salud Escuela de Microbiología y Bioanálisis Laboratorio de Bioquímica I Semestre II- 2019 CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO Práctica 1. Consulte sistema de información integral de enzimas “BRENDA” URL: http://www.brenda- enzymes.org, busque la enzima alpha amylase de Homo sapiens (EC: 3.2.1.1) y Pyrococcus furiosus, y complete la siguiente tabla (en caso de que un factor presente varios valores, colocar el valor menor y mayor). Explique las diferencias más relevantes de la enzima alfa-amilasa de Homo sapiens y de Pyrococcus furiosus.
- Pyrococcus furiosus es una especie extremófila de archea, por tal razón, es entendible que los rangos de condiciones óptimas sean muchos más amplios y altos a comparación de la enzima presente en los Homo sapiens.
- Las especies del género Pyrococcus furiosus son utilizados como fuentes de enzimas termoestables en biotecnología e industria.
- El pH óptimo, la temperatura, y el peso molecular son factores en los que Pyrococcus furiosus muestra su naturaleza termófila y mucho más amplia que la del Homo sapiens.
- El número de recambio para Pyrococcus furiosus (maltotriosa) es menor que el del Homo Sapiens (alpha-maltosyl), es decir, la enzima alfa-amilasa de éste último, tiene una mayor capacidad para convertir un sustrato en producto en unidad de tiempo. Esto se puede comprobar evaluando la constante de Km, ya que la del Homo sapiens es menor que la de Pyrococcus furiosus, por tal razón, tiene una mayor afinidad y como consecuencia, una mayor velocidad de reacción Factor Homo sapiens Pyrococcus furiosus pH pH Optimun pH Optimun Máximun pH range pH range máximum
- pH Optimun: 5,5 - 7
- pH range: 5.5 - 10
- pH Optimun:4,5 - 7,
- pH range: 3.5 - 7.
- pH range máximum: 6 - 8 Temperatura Temperature Optimun Temperarure Optimun Maximun Temperature range Temperature range Máximun Temperature Stability
Facultad de Salud Escuela de Microbiología y Bioanálisis Laboratorio de Bioquímica I Semestre II- 2019 c) Con base en los resultados descritos en la tabla 1 realice una gráfica de “%REACCIÓN vs pH” Explique, ¿Cómo afecta el pH la actividad catalítica de la enzima? El pH influye en la carga de los grupos de cadenas laterales de sus aminoácidos. La conformación de la proteína dependerá en gran parte de sus cargas eléctricas y habrá un pH en el que la conformación de la enzima será la más adecuada para llevar a cabo su actividad catalítica, este es el pH óptimo. ¿cuál es el rango de pH óptimo para la amilasa salival? Se debe encontrar entre 5,5 - 7. ¿Cuál será la utilidad del tubo No 8 (blanco) durante la evaluación de la actividad catalítica de la enzima? ¿es un control positivo o negativo de la reacción de hidrólisis de amilosa? Funciona como control negativo, ya que al no poseer la enzima (saliva diluida) el almidón no será hidrolizado. d) Con los datos de la tabla 3: Realice una gráfica de “%REACCIÓN vs. Temperatura (°C)”
Facultad de Salud Escuela de Microbiología y Bioanálisis Laboratorio de Bioquímica I Semestre II- 2019 Explique los resultados en términos de reacción de hidrólisis de amilosa a diferentes temperaturas. La hidrólisis del almidón es casi completa a una temperatura de 37°C, por lo que está es su temperatura óptima. La hidrólisis fue buena pero no completa en temperaturas menores a la temperatura óptima y finalmente la hidrólisis del almidón es nula a una temperatura extrema de 94°C. CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO Practica 2.
- Cuál es la coloración esperada para la reacción si el máximo de absorción es 500 nm? En la región visible apreciamos el color visible de una solución que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. En caso de 500 nm, sería color rojo.
- Haga una hipótesis para cada uno de los ensayos, analizando cómo debería ser el cambio en el máximo de absorción Vs cantidad de enzima o cantidad de sustrato.
- Vmax Vs concentración de enzima
- Si aumentamos la concentración de enzima, también se produce un aumento de la velocidad, en este caso de forma lineal o proporcional. Fisiológicamente esta situación no suele darse ya que las enzimas actúan a concentraciones bajas y constantes.
- Vmax Vs concentración de sustrato
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- Con los datos obtenidos en 1, y la fila de actividad enzimática (UI/L) de la tabla N°1, grafica la curva de actividad enzimática (Eje Y) Vs concentración de sustrato en unidades Molares (Eje X).
- A partir de la gráfica obtenida en el punto 2, haz la linealización de Lineweaver-Burk tomando como eje Y la variable 1/actividad enzimática y como eje X la variable 1/ [S] y halla el Km y Vmáx de GO en esta reacción particular. Siguiendo la fórmula de diagrama de lineweaver-burk y la ecuación de la recta de la linealización tendremos 1 𝑉 0 =^ 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥^ (^ 1 [𝑆])^ +^ 1 𝑉𝑚𝑎𝑥^ donde^ 𝑦^ =^ 1 𝑉 0 ,^ 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥^ =^0 ,^0051 ,^ 1 [𝑆] =^ 𝑥^ ,^ 1 𝑉𝑚𝑎𝑥^ =^0 ,^3045 La velocidad maxima será 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 1 0 , 3045 = 3 , 28 y 𝐾𝑚 = 0 , 0051 ∙ 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 0 , 0167 Si la [S]= 0,008 tendremos: 𝑉 0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝐾𝑚+[𝑆]
3 , 28 ( 0 , 008 ) 0 , 0167 + 0 , 008
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- Con los resultados de la tabla N°2, grafique el efecto de la adición de cantidades crecientes de enzima. Usa el volumen de suero como eje X y la actividad enzimática (UI/L) como Eje Y. Siguiendo la fórmula de diagrama de lineweaver-burk y la ecuación de la recta de la linealización tendremos 1 𝑉 0
𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥
1 [𝑆]
1 𝑉𝑚𝑎𝑥 donde 𝑦 = 1 𝑉 0
𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥
1 [𝑆]
1 𝑉𝑚𝑎𝑥
La velocidad maxima será 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 1 4 , 9197 =^0 ,^203 y^ 𝐾𝑚^ =^11 ,^365 ∙^ 𝑉𝑚𝑎𝑥^ =^2 ,^307 Si la [S]= 6 tendremos: 𝑉 0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝐾𝑚+[𝑆] =^ 0 , 203 ( 6 ) 2 , 307 + 6 =^0 ,^1466
- Las células tumorales, principalmente aquellas asociadas con leucemia linfocítica aguda (LLA), en rápida división requieren mayores cantidades de asparagina que las células normales. La L- asparaginasa (L-ASP) es una enzima que hidroliza la asparagina en amonio y ácido aspártico y la
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- La creatinfosfokinasa (CK) es una enzima dimérica localizada en diferentes tejidos como músculo (CK-MM), corazón (CK-MB) y cerebro (CK-BB). Su función es catalizar la fosforilación de la creatina para producir fosfocreatina, una molécula muy importante en la generación de ATP por vía anaerobia. En un episodio de infarto de miocardio, la isoenzima CK-MB puede estar aumentada y se constituye en una herramienta diagnóstico después de las primeras 6-8hs de ocurrido el suceso. Sin embargo, la isoenzima CK-MM también puede estar alterada en un episodio de grandes esfuerzos musculares como carreras de maratón. Se encontró un análisis positivo para la reacción test de presencia de CK, pero se desconoce cuál es la isoenzima presente en el plasma evaluado. Evaluar el valor de Km es una herramienta que permite diferenciar la isoenzima responsable de la actividad observada. Dado que las tres isoenzimas catalizan la misma reacción, se pidió al laboratorio un análisis de Km para determinar cuál es la isoenzima responsable del resultado positivo previamente analizado. Los resultados usando fosfocreatina (CP) como sustrato fueron los siguientes: Ayuda al técnico de laboratorio a identificar la isoenzima responsable del resultado positivo en el análisis teniendo en cuenta los valores de Km reportados en la literatura. Identifica si el resultado positivo encontrado en el análisis obedece a un episodio de infarto de miocardio o a grandes esfuerzos musculares
Facultad de Salud Escuela de Microbiología y Bioanálisis Laboratorio de Bioquímica I Semestre II- 2019 El resultado positivo encontrado obedece a una alteración debido a un episodio de grandes esfuerzos musculares auspiciado por la isoenzima CK-MM, teniendo en cuenta que el valor de ADP es más cercano al producido por esta isoenzima, además su Km: Y= X= 0, 0= 0, 2857 x + 0, Intersección en gráfica: - 0,1, entonces 1/ 0,1 => 10 0,2854 (Vmax) => 0,2854 (1/ 0,02857) = 9,989. ● Bibliografía Silva, E., & Jasso, R. (2020). Scielo.org.mx. Retrieved 14 March 2020, from http://www.scielo.org.mx/pdf/reb/v32n3/v32n3a5.pdf. Página sugerida: http://www.brenda-enzymes.org Cuestionario [1] Rodrigez, J., Narvaez, C., & Restrepo, L. (2020). ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE POLIGALACTURONASA EN LA CORTEZA DE PITAYA AMARILLA (Acanthocereus pitajaya). Scielo.org.co. Retrieved 14 March 2020, from http://www.scielo.org.co/pdf/abc/v11s1/v11s1a05.pdf. [2] Ortega, R. (2020). Prueba del almidón: Reacción con yodo. Murciaeduca.es. Retrieved 15 March 2020, from https://www.murciaeduca.es/iesricardoortega/sitio/upload/Prueba_del_Iodo.pdf.
