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PURIFICACIÓN DE LA FAVINA: Extracción de proteínas, Cromatografía de Afinidad y Electroforesis Angela Jazmin A Pérez. Angie Fernanda Arias,Maria Paula Cuervo, Juan Camilo Cardona Biología,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Presentado el 15 de Julio de 2019, Grupo 7. aabrilp@unal.edu.co anfariasla@unal.edu.co , jccardonazu@unal.edu.co , mcuervog@unal.edu.co , RESULTADOS Extracción de Proteínas Gráfica 1. Curva de calibración para cuantificación de proteínas Abs 280 nm vs Concentración (mg/ml). Muestra Volumen (mL) Factor de dilución Absorbancia 280 nm Concentración (mg/mL) Extracto Crudo 50 1:1000 1.2 804. Albúminas 5.75 1/70 1.401 148. Globulinas 25 1/25 0.641 23. Tabla 1. Datos para extracción de proteínas
Cromatografía de afinidad
- Utilizar la curva de calibración construida en la Práctica 7.1 para completar la siguiente tabla de datos: Eluidos de mayor absorbancia de: Volumen del eluido (mL) Factor de dilución Absorbancia 205 / 280 nm Concentración estimada (mg/mL) Proteínas no retenidas
Favina 49.5 - 0.716* / 0. Tabla 2. Datos para purificación de favina
- Graficar el perfil de elución de la cromatografía de afinidad: Absorbancia 280 nm VS Volumen de elución (ml). Gráfica 2 Perfil de elución de la cromatografía de afinidad
Gráfica 3 Log Pesos moleculares Vs. movilidad relativa (Rf) El carril 11 fue el correspondiente al grupo, por tanto. Dado que la migración en este carril presentó dos bandas concentradas, se realizó la medición y el posterior cálculo del PM para cada banda. Carril 11 Rf PM (kDa) Banda superior 0.63 16, Banda inferior 0.67 14, Tabla 3. Pesos moleculares y movilidad relativa de subunidades proteicas de Favina CALCULOS Extracción de Proteínas Concentración de muestras usando la curva de calibración Absorbancia obtenida (280nm) (ver tabla 1) Extracto crudo: 1. Albúminas: 1. Globulinas: 0. Usando la ecuación de la recta obtenida: y=06622x + 0. Se reemplaza respectivamente y se despejan los valores Extracto crudo: 1.200 - 0.0097 /0.6622 = 0,8043 mg/mL Albúminas: 1.401 - 0.0097 /0.6622 =2,116 mg/mL
Globulina: 0.6410 - 0.0097 /0.6622 =0.9532 mg/mL Luego se multiplica por los factores de diluciones correspondientes para hallar la concentración inicial. (ver tabla 1) Extracto crudo: 0,8043 * 1000= 804.3 mg/ mL Albúminas: 2,116 *70 = 148.1 mg/mL Globulina: 0.9532 * 25 = 23.83 mg/mL Se reemplazan los valores Cromatografía de afinidad ANÀLISIS El haba (Vicia Faba) es una planta perteneciente a la familia de las fabáceas tiene una gran importancia como alimento tanto para animales como para consumo humano siendo la séptima legumbre de grano con mayor importancia ( Confalone, 2008) esto debido a su alto contenido proteico. La mayoría de las especies pertenecientes a la familia de las leguminosas presentan lectinas (hemaglutininas), las lectinas vegetales son proteínas de gran estabilidad que tienen la capacidad de unirse reversiblemente con alta afinidad y especificidad a diferentes tipos de carbohidratos (Sharon, 2007) y que son sintetizadas durante el desarrollo de las semillas, la germinación y el crecimiento de las plantas, y que pueden ser abundantes en órganos de las plantas, tales como raíces, hojas y tallos.En las plantas se han detectado, principalmente en los cotiledones y endospermos de las semillas y constituyen del 2 al 10 % del total de las proteínas de éstas. (2) Para la preparación de la muestra se usó harina de haba a la cual se le agregó NaCl al 1 % (p/v), lo anterior se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos, obteniéndose un precipitado, el cual se desechó, y un sobrenadante, que se guardó como M1: “Extracto crudo”, en donde se encontraban las globulinas y albúminas. Luego, se tomaron 5 ml de M1 y se le adiciona sulfato de amonio hasta el 50 % de saturación, se centrifugó y el sobrenadante se marcó como M2, en esta muestra se hallan las albúminas, el precipitado se suspendió en NaCl 1 % (p/v) y se rotuló como M3, el cual contiene las globulinas. Para la purificación de la favina se usó el soporte Sephadex G-75, con el fin de realizar una cromatografía por afinidad, se usó 10 ml de M3 y se inició la elución con NaCl 1 % (p/v), se recogieron fracciones cada 0.5 ml y se midieron las absorbancias a 220 nm y 280 nm, se obtuvieron dos picos de absorbancia máxima, el primero corresponde a la fracción no retenida (M4) y el segundo es la M5, en donde se encuentra la Favina. Con base en la curva de calibración obtenida para la caseína (ver gráfica 1) donde se observa la absorbancia vs. la concentración, se logró determinar la concentración del extracto crudo (X), las albúminas de mayor concentración (23.83 mg/ml) y las globulinas menos concentradas (23.83 mg/ml). Ésta misma curva de calibración se utilizó para
Sin embargo, los resultados analizados pertenecen a otro laboratorio que realizó el mismo procedimiento. La electroforesis de nuestra práctica no fue exitosa, ya sea por errores en la preparación del gel, degradación de las muestras o errores técnicos que afectaron la cámara de electroforesis. Por otro lado, las muestras estudiadas posiblemente no se manejaron adecuadamente. Permitiendo la actividad de enzimas de degradación, que son reguladas mediante el control de variables como la Temperatura que puede eliminar su actividad. Sin embargo es importante tener en cuenta que las características de estas moléculas dependen en gran medida de su fuente, sea animal o vegetal e incluso de la especie. Algunos azúcares como las aldohexosas con hidroxilos libres en posición trans actúan como inhibidores de la Favina (Silva y Montes, 1993), las muestras pudieron haber sido contaminadas o pudieron estar presentes estos inhibidores durante el proceso de purificación. Finalmente, es importante resaltar que las muestras estuvieron almacenadas por un rango de tiempo significativo ( días) y durante este tiempo las enzimas se pudieron haber degradado si no se conservaban en condiciones óptimas. CUESTIONARIO Extracción de proteínas
- ¿Qué es y cómo funciona un pH-metro? El pH-metro o potenciómetro es un sensor utilizado en el método electroquímico para medir el pH de una disolución. El PH-metro mide la actividad del ion hidrógeno en soluciones acuosas midiendo asì la diferencia de potencial eléctrico entre un electrodo de pH y un electrodo de referencia. Esta diferencia de potencial eléctrico se relaciona con la acidez o el pH de la solución. El medidor de pH se utiliza en muchas aplicaciones que van desde la experimentación de laboratorio hasta control de calidad. Los medidores de pH más comunes incorporan esta forma de medición.. El medidor de voltaje convierte a un valor de pH y la muestra en la pantalla digital, permitiendo así la cómoda medición de cualquier líquido o suelo. Por otro lado algunos medidores de pH digitales vienen con una función denominada compensación automática de temperatura. Éstos medidores tienen un termómetro incorporado que automáticamente se ajusta para cualquier discrepancia de la línea de base de 25 °C.
- Cuál es la función de ajustar el pH del Extracto Crudo a 4.65? Las lectinas se organizan como dímeros o tetrámeros, dependiendo del pH.
- ¿Qué funciones biológicas desempeña la favina? La favina es una proteína del grupo de las lectinas específica para (Vicia faba), Las lectinas son proteínas que se unen a azúcares con una elevada especificidad para cada tipo distinto.
Su principal papel está en los fenómenos de reconocimiento, tanto a nivel molecular como celular, las lectinas son particularmente abundantes en las leguminosas. Estas proteínas poseen interesantes propiedades que convierten a esta clase de proteínas en herramientas invalorables en los laboratorios biológicos, por lo que se utilizan en numerosas investigaciones que incluyen: estudio de la estructura de las membranas, detección de transformaciones malignas, purificación de glicoconjugados, estudios citogenéticos, así como también en ensayos histoquímicos, enzimáticos y en el tipaje de grupos sanguíneos. Cromatografía de afinidad
- ¿Porqué se utiliza NaCl 1% (P/V) como fase móvil en la práctica? Explique En el caso de esta purificación se utiliza el NaCl para poder generar la elución, generando el movimiento necesario de los componentes, que son arrastrados por la fase móvil (que contiene el NaCl) a lo largo del lecho o fase estacionaria. Luego de completar la elución o elusiones, la distribución final de los componentes en función de su posición sobre la fase estacionaria o el tiempo en el que eluyen ( elución causada por el NaCl) nos darán el cromatograma buscado
- Para purificar la favina, un grupo de trabajo utilizó una columna Sephadex G- 75 equilibrada con glucosa 5% (P/V)-NaCl 1% (P/V). Graficar el perfil de elución esperado una vez finalizado el protocolo de purificación. El resultado de la gráfica de Abs vs el volumen de la elución debería tener un comportamiento de dos curvas normales, solo que la segunda será más pequeña debido a la elución de la proteína retenida pero ambas tendiendo a 0 luego del punto más alto
- ¿Cuál es el objetivo de monitorear la absorbancia a 280 nm de las diferentes fracciones recogidas recogidas durante el protocolo de purificación? Esto es debido a la necesidad de cuantificar la presencia de proteínas a diferentes volúmenes de elución y se mira la absorbancia a 280 debido al pico de absorción máxima a 280 nm y esto, a su vez, se debe a los aminoácidos aromáticos como la tirosina y el triptófano que componen las proteínas , Electroforesis
- ¿Qué es y cuáles son las utilidades de una electroforesis nativa de proteínas? La electroforesis nativa son una serie de series técnicas electrofotometros utilizadas para la separación individual de proteínas y complejos proteicos, siendo métodos de micro escala. Se busca en la carga eléctrica neta y en el medio de PH diferente, llegando a causar migraciones. Entre sus usos está la identificación de cargas de las moléculas, estructura de
- http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-
