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Sistemas de membrana
citoplásmica: estructura,
función y tránsito en la membrana
B
ajo el microscopio óptico, el citoplasma de las células vivas se observa como una estructura relativamente vacía. Sin embargo, incluso antes del inicio del siglo xx, el examen de cortes teñidos de tejidos animales sugirió la existencia de una extensa red de membranas dentro del citoplasma. No obstante, fue hasta el desarrollo del microscopio electrónico en el decenio de 1940 cuando los biólogos empezaron a identificar la diversa disposición de las estructuras limitadas por membranas presentes en el citoplasma de la mayoría de las células eucariotas. Estos primeros microscopistas elec- trónicos vieron vesículas limitadas por membranas de diámetros variables que contenían material con diferente densidad electrónica, canales largos delimitados por membranas que se irradiaban por el citoplasma para formar una red interconectada de canales y sacos aplanados delimitados por membranas llamadas cisternas. A partir de estos primeros estudios con el microscopio electrónico y las investigacio- nes bioquímicas que siguieron se hizo evidente que las células eucariotas se subdividían en diferentes compartimientos delimitados por barreras de membrana. A medida que se examinaron más tipos de células, resultó aparente que estos compartimientos membra- nosos en el citoplasma formaban organelos que podían identificarse en diversas células,
8.1 Revisión del sistema
endomembranoso
8.2 Algunas aproximaciones
al estudio de las endomembranas
8.3 El retículo endoplásmico
8.4 El aparato de Golgi
8.5 Tipos de transporte en vesículas
y sus funciones
8.6 Lisosomas
8.7 Vacuolas de las células vegetales
8.8 La vía endocítica: movimiento
de membrana y materiales dentro
de la célula
8.9 Captación de proteínas
por peroxisomas, mitocondrias
y cloroplastos después
de la traducción
PERSPECTIVA HUMANA: Trastornos
secundarios a defectos de la función
lisosómica
VÍAS EXPERIMENTALES:
Endocitosis mediada por receptor
Micrografía electrónica de barrido con color artificial de un neutrófilo humano, un tipo de leucocito, que ingiere varias bacterias por el proceso de fagocitosis. Los neutrófilos son componentes esenciales de la inmunorreacción innata contra los patógenos. (Tomada de Scott D. Kobayashi, et al., portada de PNAS, vol. 100, núm. 19, 2003, cortesía de Frank R. DeLeo.)
274
C A P Í T U L O
8.1 R E V I S I Ó N D E L S I S T E M A E N D O M E M B R A N O S O 275
desde levaduras hasta plantas y animales. La extensión en la que el citoplasma de una célula eucariota está ocupado por estruc- turas membranosas se ilustra en la micrografía electrónica de una célula radicular del maíz en la figura 8-1. Como se advierte en las páginas siguientes, cada uno de estos organelos contie- ne un complemento particular de proteínas y está especializado en actividades específicas. Por lo tanto, tal y como una casa o un restaurante se dividen en estancias especializadas en las que pueden realizarse diferentes actividades independientes unas de otras, el citoplasma de una célula se divide en compartimientos membranosos especializados por razones análogas. Al examinar las micrografías de este capítulo hay que tener presente que estos organelos citoplásmicos pueden parecer estructuras estables, como las habitaciones de una casa o restaurante, pero de hecho son compartimientos dinámicos con un flujo continuo. En este capítulo se examinan la estructura y funciones del retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, endosomas, lisoso- mas y vacuolas. Considerados en conjunto, estos organelos for- man un sistema de endomembrana en el que los componentes individuales funcionan como parte de una unidad coordinada. (Mitocondrias y cloroplastos no son parte de este sistema inter- conectado y fueron los temas de los capítulos 5 y 6. En la actua- lidad existen indicios de que los peroxisomas, que se expusieron en el capítulo 6, tienen un origen doble. Como lo indican las micrografías que abren este capítulo, es probable que los ele- mentos básicos de la membrana limitante surjan del retículo endoplásmico, pero la mayor parte de las proteínas de mem- brana y las proteínas internas solubles son tomadas del citosol, como se describe en la sección 8.9.) ●
8.1 REVISIÓN DEL SISTEMA
ENDOMEMBRANOSO
Los organelos del sistema de endomembrana son parte de una red dinámica integrada en la que los materiales se envían y regresan de una parte de la célula a otra. Casi en su totalidad, los materiales se trasladan entre los organelos, por ejemplo del aparato de Golgi a la membrana plasmática, en pequeñas vesí- culas de transporte limitadas por membrana que se desprenden de un compartimiento donante de membrana (fig. 8-2 a ). 1 Las vesículas de transporte se mueven por el citoplasma en forma dirigida, a menudo tiradas por proteínas motoras que operan sobre rieles formados por microtúbulos y microfilamentos del citoesqueleto (véase fig. 9-1 a ). Cuando llegan a su destino, las vesículas se fusionan con la membrana del compartimiento receptor, el cual recibe el cargamento soluble de la vesícula así como su envoltura membranosa (fig. 8-2 a ). Los ciclos repetidos de desprendimiento y fusión trasladan diversos materiales por los numerosos trayectos que cruzan la célula. Ya se han identificado distintas vías a través del citoplas- ma y se ilustran en la revisión que se muestra en la figura 8-2 b. Se puede distinguir una vía biosintética en la que se sintetizan proteínas en el retículo endoplásmico, se modifican a su paso por el aparato de Golgi y se transportan del aparato de Golgi a varios destinos, como la membrana plasmática, un lisosoma o una gran vacuola en una célula vegetal. Esta ruta también se conoce como la vía secretora , ya que muchas de las proteínas sintetizadas en el retículo endoplásmico (así como los polisacá- ridos complejos producidos en el aparato de Golgi, página 296) se descargan ( secretan ) de la célula. Las actividades secretoras de las células pueden dividirse en dos tipos: constitutivas y regu- ladas (fig. 8-2 b ). Durante la secreción constitutiva , los mate- riales se transportan en vesículas secretoras de los sitios donde se producen para descargarse en el espacio extracelular en forma continua. La mayor parte de las células lleva a cabo secreción constitutiva, un proceso que contribuye no sólo a la formación de la matriz extracelular (sección 7.1), sino también a la forma- ción de la membrana plasmática misma. Durante la secreción regulada , los materiales se almacenan en paquetes delimitados por membrana y se descargan sólo como respuesta a un estímu- lo apropiado. La secreción regulada ocurre, por ejemplo, en las células endocrinas que liberan hormonas, en las células de los ácinos pancreáticos que liberan enzimas digestivas y en las célu- las nerviosas que liberan neurotransmisores. En algunas de estas células, los materiales que se secretan se almacenan en grandes gránulos secretores densos y delimitados por membrana (véase fig. 8-3). Proteínas, lípidos y polisacáridos complejos se transpor- tan por la célula mediante la vía biosintética o secretora. Esta primera parte del capítulo se enfoca en la síntesis y transpor- te de proteínas, como se resume en la figura 8-2 b. Durante la
ERERER
VesículaVesícula secretorasecretora
Vesícula secretora
Aparato deAparato de GolgiGolgi
Aparato de Golgi
FIGURA 8-1 Compartimientos del citoplasma unidos a la membrana. El citoplasma de esta célula de la tapa radicular de una planta de maíz contiene un conjunto de organelos unidos a la membrana cuya estructura y función se examinan en este capítulo. Como resulta evidente en esta micrografía, la superficie combinada de las membranas citoplásmicas es muchas veces mayor que la membrana plasmática circundante. (Cortesía de Hilton H. Mollenhauer.)
(^1) El término “vesícula” se refiere a un portador de forma esférica. El cargamento también puede trasladarse en portadores irregulares o tubulares limitados por mem- brana. Por razones de sencillez, en general se hará referencia a los portadores como “vesículas”, aunque hay que tener en mente que no siempre son esféricos.
el retículo endoplásmico mientras que otra podría ser reclutada por una región específica del aparato de Golgi. En los últimos 30 años se han hecho grandes avances en el mapeo de los patrones de tránsito de las células eucariotas, la identificación de domicilios y receptores específicos que regulan el flujo del tránsito y la disección de los mecanismos que asegura que los materiales se entreguen en los sitios correctos de la célula. Estos temas se tratan con detalle en las páginas siguientes. Las proteínas motoras y los elementos del citoesqueleto, que tienen papeles clave en los movimientos de las vesículas de transporte y otras endomembranas se describen en el capítulo siguiente. El estudio de éstas se inicia con la discusión de algunas de las formas experimentales más importantes que condujeron a la comprensión actual de este tema.
8.2 ALGUNAS APROXIMACIONES
AL ESTUDIO DE LAS ENDOMEMBRANAS
Los estudios iniciales con el microscopio electróni- co proporcionaron a los biólogos un retrato detallado de la estructura celular, pero suministraron poca información sobre las funciones de los componentes que observaban. Para identi- ficar las funciones de los organelos citoplásmicos fue necesario el desarrollo de técnicas nuevas y la ejecución de experimentos innovadores. Los primeros esfuerzos en estas áreas se vieron recompensados con el premio Nobel en 1974 para tres biólo- gos celulares: Christian De Duve, de la Universidad de Lovaina en Bélgica, y Albert Claude y George Palade, de la Rockefeller University. Las técnicas experimentales descritas en las seccio- nes siguientes resultaron muy útiles para establecer la base de conocimiento sobre la cual se finca la investigación actual de los organelos citoplásmicos.
Información obtenida de la autorradiografía
Entre los cientos de células diferentes del cuerpo, las células aci- nares del páncreas tienen un sistema de endomembrana en par- ticular extenso. La función principal de estas células es la síntesis y secreción de enzimas digestivas. Después de la secreción pan- creática, estas enzimas se envían al intestino delgado mediante conductos, donde degradan el alimento ingerido. ¿En qué sitio de las células acinares pancreáticas se sintetizan las proteínas secretoras y cómo llegan a la superficie de las células de las que se expulsan? Estas preguntas son difíciles de responder porque todos los pasos del proceso de secreción ocurren al mismo tiem- po dentro de la célula. Para seguir los pasos de un solo ciclo de principio a fin, es decir, desde la síntesis de la proteína secretora a su salida de la célula, James Jamieson y George Palade utiliza- ron la técnica de la autorradiografía.
Como se describe con detalle en el capítulo 18, la autorra- diografía es un medio para visualizar los procesos bioquímicos al permitir que el investigador determine la localización de mate- riales con marca radiactiva dentro de una célula. En esta técnica, los cortes hísticos con los isótopos radiactivos se cubren con una capa delgada de emulsión fotográfica, la cual se expone por la radiación que emana de los radioisótopos del tejido. Los sitios de las células que contienen radiactividad se revelan al microsco- pio por los granos de plata de la emulsión que se aplicó encima (fig. 8-3). Para reconocer los puntos en los que se sintetizan las proteí- nas secretoras, Palade y Jamieson incubaron fragmentos de tejido pancreático en una solución que contenía aminoácidos radiac- tivos durante un periodo corto. Durante este lapso, las células vivas captaron estos aminoácidos marcados y los incorporaron en las enzimas digestivas que se sintetizaban en los ribosomas. Los tejidos se fijaron y con la autorradiografía se identificó la localización de las proteínas que se habían sintetizado durante el breve periodo de incubación con aminoácidos marcados. Con esta técnica se descubrió el retículo endoplásmico como el sitio donde se sintetizan las proteínas secretoras (fig. 8-3 a ). Para determinar la vía intracelular que siguen las proteínas secretoras desde el punto donde se sintetizan hasta el sitio don- de se descargan, Palade y Jamieson realizaron un experimento adicional. Después de incubar el tejido por un breve periodo con aminoácidos radiactivos, lavaron el tejido para retirar el exceso de isótopos y transfirieron el tejido a un medio que contenía sólo aminoácidos no marcados. Un experimento de este tipo se llama pulso-persecución. El pulso se refiere a la incubación breve con radiactividad durante la cual los aminoácidos marca- dos se incorporan en la proteína. La persecución se refiere al lapso en que el tejido se expone al medio no marcado, un periodo durante el cual se sintetizan proteínas adicionales con aminoáci- dos sin marca. Cuanto mayor sea el tiempo de persecución, más lejos se desplazan las proteínas radiactivas producidas durante el pulso de su sitio de síntesis en la célula. Con esta técnica es posible seguir los movimientos de las moléculas recién sinteti- zadas mediante la observación de la onda de material radiactivo que se mueve por los organelos citoplásmicos desde un punto al siguiente hasta que se completa el proceso. La figura 8-3 b - d resume los resultados de estos experimentos, que definieron por primera vez la vía biosintética (o secretora) y vincularon varios compartimientos membranosos que parecían inconexos en una unidad funcional integrada.
Información obtenida a partir de la proteína verde fluorescente
Para los experimentos con autorradiografías descritos en la sec- ción anterior fue necesario que los investigadores examinaran cortes delgados de células diferentes que se fijaron en distintos momentos después de introducir una marca radiactiva. En los últimos años se desarrolló una nueva tecnología que permite a los investigadores seguir con sus propios ojos los movimientos de proteínas específicas mientras éstos ocurren dentro de una sola célula viva. Esta tecnología emplea un gen aislado de una medusa que codifica una pequeña proteína, la proteína ver- de fluorescente (GFP) , que emite una luz fluorescente de dicho color. Para usar esta técnica, el DNA (ácido desoxirribonucleico)
REVISIÓN?
- Compare y contraste la vía biosintética con la vía endo- cítica.
- ¿Cómo se dirigen las proteínas particulares a los com- partimientos subcelulares específicos?
8.2 A L G U N A S A P R O X I M A C I O N E S A L E S T U D I O D E L A S E N D O M E M B R A N A S 277
278 Capítulo 8 S I S T E M A S D E M E M B R A N A C I T O P L Á S M I C A : E S T R U C T U R A , F U N C I Ó N Y T R Á N S I T O E N L A M E M B R A N A
que codifica la GFP se fusiona con el DNA que codifica la pro- teína a estudiar y el DNA quimérico resultante (compuesto) se introduce en las células, las cuales pueden observarse al micros- copio. Una vez dentro de una célula, el DNA quimérico expresa una proteína quimérica que consiste en GFP fusionada con el final de la proteína a estudiar. En la mayoría de los casos, la pre- sencia de la GFP unida con el final de una proteína tiene poco o ningún efecto en el movimiento o función de esa proteína. La figura 8-4 presenta un par de micrografías que muestran células que contienen proteína fusionada con GFP. En este caso,
las células se infectaron con una cepa del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en la que uno de los genes virales ( VSVG ) se fusionó con el gen GFP. Los virus son útiles en estos tipos de estudios porque convierten a las células infectadas en fábricas para producir una o varias proteínas virales, las cuales son trans- portadas igual que cualquier otro cargamento de proteína por la vía biosintética. Cuando una célula está infectada con el virus VSV, se producen cantidades masivas de la proteína VSVG en el retículo endoplásmico (ER). Después, las moléculas de VSVG viajan por el aparato de Golgi y se transportan a la membrana plasmática de la célula infectada, donde se incorporan en envol- turas virales. Como en el experimento con pulso radiactivo y persecución, el uso de un virus permite a los investigadores seguir una onda relativamente sincrónica de movimiento de las proteí- nas, en este caso representada por una oleada de fluorescencia verde que se inicia poco después de la infección. La sincronía puede intensificarse, como se hizo en el experimento mostrado en la figura 8-4, mediante el uso de un virus con una proteína VSVG mutante que no puede salir del retículo endoplásmico de las células infectadas que se cultivan a una temperatura elevada (p. ej., 40°C). Cuando la temperatura se reduce a 32°C, la pro-
(a)
Granos de plataGranos de plata
ER rugosoER rugosoER rugoso
GránuloGránulo secretorsecretor
Gránulo secretor
Granos de plata
(b) (c) (d)
Retículo endoplásmico Núcleo
Mitocondria
Aparato de Golgi
Gránulos
Luz
3 min 20 min^ 120 min
FIGURA 8-3 Autorradiografía que revela los sitios de síntesis y transporte subsiguiente de las proteínas secretoras. a Micrografía electrónica de un corte de una célula acinar pancreática que se incubó durante tres minutos en aminoácidos radiactivos y luego se fijó y preparó de inmediato para la autorradiografía (véase sección 18.4 para obtener una descripción de la téc- nica). Los granos negros de plata que aparecen en la emulsión después del desarrollo se localizan en el retículo endoplásmico. a d Diagramas de una secuencia de autorradiografías que muestran el movimiento de las proteínas secretoras marcadas (representadas por los granos de plata en rojo) a través de la célula acinar pancreática. Cuando la célula se marca con técnica de pulso durante tres minutos y luego se fija de inmediato (como se muestra en a , la radiactividad se localiza en el retículo endoplásmico (b. Después de un pulso de 3 min y persecución de 17 min, la marca radiactiva se concentra en el aparato de Golgi y vesículas adyacentes (c. Después de un pulso de 3 min con persecución de 117 min, la radiactividad se concentra en los grá- nulos secretores y empieza a liberarse a los conductos pancreáticos (d. ( A , Cortesía de James D. Jamieson y George Palade.)
280 Capítulo 8 S I S T E M A S D E M E M B R A N A C I T O P L Á S M I C A : E S T R U C T U R A , F U N C I Ó N Y T R Á N S I T O E N L A M E M B R A N A
ción 18.6. Una vez aisladas, puede identificarse la composición bioquímica de varias fracciones. Por ejemplo, con esta técnica se encontró que las vesículas derivadas de distintas partes del aparato de Golgi contenían enzimas que agregaban diferentes azúcares al final de una cadena creciente de carbohidrato en una glucoproteína o un glucolípido. Se pudo aislar una enzima espe- cífica de la fracción microsómica y luego usarse como antígeno para preparar anticuerpos contra esa enzima. Así, los anticuer- pos podían unirse con materiales, como partículas de oro que se podían visualizar con el microscopio electrónico y así reconocer la ubicación de la enzima en el compartimiento de membrana. Estos estudios detallaron el papel del aparato de Golgi en el ensamble secuencial de los carbohidratos complejos. En los últimos años, la identificación de las proteínas pre- sentes en las fracciones celulares se llevó a un nuevo nivel con la aplicación de la compleja tecnología proteómica. Una vez que se aísla el organelo particular, es posible extraer las proteínas, separarlas e identificarlas mediante espectrometría de masas, como se describe en la página 70. Se pueden reconocer cientos de proteínas al mismo tiempo, lo que proporciona un retrato molecular completo de cualquier organelo que puede prepararse con relativa pureza. En un ejemplo de esta nueva tecnología se encontró que un simple fagosoma (pág. 317) que contiene una cuenta de látex ingerida contenía más de 160 proteínas diferen- tes, muchas de las cuales nunca se habían identificado o no se sabía que participaran en la fagocitosis.
Información obtenida a partir
de sistemas libres de células
Tras desarrollar las técnicas para fraccionar los organelos mem- branosos, los investigadores empezaron a explorar las capacida- des de estas burdas preparaciones subcelulares. Encontraron que las partes aisladas de una célula eran capaces de realizar activi- dades notables. Dichos sistemas libres de células , llamados así porque no contienen células completas, suministraron mucha información sobre los procesos complejos imposibles de estudiar con células intactas. Por ejemplo, durante el decenio de 1960, George Palade, Philip Siekevitz y sus colegas de la Rockefeller University se dedicaron a aprender más acerca de las propieda-
des de la fracción microsómica rugosa (mostrada en la figura 8-5 c ), que se deriva del retículo endoplásmico rugoso (pág. 284). Estos investigadores hallaron que podían liberar una prepara- ción microsómica rugosa de sus partículas adheridas y las par- tículas aisladas (ribosomas) eran capaces de sintetizar proteínas
2
1
3
Homogeneizado
Transferir sobrenadante posnuclear
Sobrenadante posnuclear
Homogeneizado
Homogeneizar
Células completas, núcleos, mitocondrias
Microsomas
Centrifugar 20 000 g durante 20 min
Sobrenadante posmicrosómico
Centrifugar 50 000 g durante 2 horas
Células completas
(a)
FIGURA 8-5 Aislamiento de una fracción microsómica por centrifugación diferencial. a Cuando una célula se rompe por homogeneización mecáni- ca (paso 1), los diversos organelos membranosos se fragmentan y forman vesículas membranosas esféricas. Las vesículas derivadas de los distintos organelos pueden separarse mediante varias técnicas de centrifugación. En el procedimiento mostrado aquí, el homogeneizado de células se somete pri- mero a centrifugación de baja velocidad para formar pelotillas con las par- tículas más grandes, como núcleos y mitocondrias, lo que deja las vesículas más pequeñas (microsomas) en el sobrenadante (paso 2). Los microsomas pueden retirarse del sobrenadante por centrifugación a mayor velocidad por periodos más prolongados (paso 3). Una fracción microsómica general de este tipo puede fraccionarse en distintos tipos de vesículas en pasos subsi- guientes. b Micrografía electrónica de una fracción microsómica lisa en la que las vesículas membranosas carecen de ribosomas. c Micrografía electró- nica de una fracción microsómica rugosa que contiene membranas tachona- das con ribosomas. ( B y C , cortesía de J. A. Higgins y R. J. Barnett.) (b) (c)
cuando contaban con los ingredientes necesarios del citosol. En estas condiciones, los ribosomas tan sólo liberaban las proteínas recién sintetizadas al medio acuoso del tubo de ensayo. Cuando se realizó el mismo experimento con microsomas rugosos intac- tos, las proteínas recién sintetizadas ya no se liberaban al medio de incubación, sino que quedaban atrapadas dentro de la luz de las vesículas membranosas. Con base en estos estudios se con- cluyó que la membrana microsómica no era necesaria para la incorporación de aminoácidos en las proteínas, pero sí para secuestrar las nuevas proteínas secretoras sintetizadas dentro del espacio de las cisternas del retículo endoplásmico. En los últimos decenios, los investigadores emplearon sis- temas libres de células para identificar los papeles de muchas de las proteínas participantes en el tránsito de membrana. La figura 8-6 muestra un liposoma con vesículas que se desprenden de su superficie (flechas). Como se explica en la página 128, los liposomas son vesículas cuya superficie consiste en una bicapa artificial que se crea en el laboratorio a partir de fosfolípidos purificados. Las yemas y vesículas que se ven en la figura 8- se produjeron después de incubar la preparación de liposomas con proteínas purificadas que en condiciones normales forman cubiertas en la superficie citosólica de las vesículas de transporte dentro de la célula. Sin las proteínas de cubierta adicionales, no ocurriría el desprendimiento de vesículas. Utilizando esta estra- tegia, en la que los procesos celulares son reconstituidos in vitro, los investigadores pudieron estudiar las proteínas que se unen con la membrana para iniciar la formación de vesículas, las pro- teínas encargadas de la selección del cargamento y las proteínas que cortan la vesícula de la membrana donante.
Información obtenida del estudio de mutantes genéticos
Un mutante es un organismo (o célula cultivada) cuyos cro- mosomas contienen uno o más genes que codifican proteínas anormales. Cuando una proteína codificada por un gen mutan- te es incapaz de realizar su función normal, la célula que tiene la mutación presenta una deficiencia característica. La identi- ficación de la naturaleza precisa de la deficiencia proporciona información sobre la función de la proteína normal. El estu- dio de la base genética de la secreción se ha realizado sobre todo en células de levadura y la mayor parte del trabajo la han realizado Randy Schekman y sus colegas de la University of California , en Berkeley_._ Las levaduras son muy susceptibles a los estudios genéticos porque tienen una pequeña cantidad de genes en comparación con otros tipos de eucariotas; son orga- nismos unicelulares pequeños fáciles de cultivar y pueden crecer como haploides durante la mayor parte de su ciclo celular. Una mutación en un solo gen de una célula haploide tiene un efecto observable porque las células carecen de una segunda copia del gen que enmascararía la presencia de la anormal. En las levaduras, como en todas las células eucariotas, las vesí- culas se desprenden del retículo endoplásmico y viajan al aparato de Golgi, donde se fusionan con las cisternas de Golgi (fig. 8-7 a ). Para identificar los genes cuya proteína codificada participa en esta parte de la vía secretora (esto es, genes SEC ), los investigado- res buscan células mutantes que tienen una distribución anormal de membranas citoplásmicas. La figura 8-7 b muestra una micro- grafía electrónica de una célula de levadura nativa. La célula que se muestra en la figura 8-7 c tiene una mutación en el gen que codi- fica una proteína que participa en la formación de vesículas en la membrana del retículo endoplásmico (paso 1, fig. 8-7 a ). Cuando no forman vesículas, las células mutantes acumulan un retículo endoplásmico extenso. En cambio, la célula mostrada en la figura 8-7 d posee una mutación en un gen que codifica una proteína par- ticipante en la fusión de las vesículas (paso 2, fig. 8-7 a ). Cuando el producto de este gen es defectuoso, las células mutantes acumulan un número excesivo de vesículas no fusionadas. Los investigado- res han aislado docenas de mutantes diferentes, que consideradas como grupo presentan interrupciones en todos los pasos de la vía secretora. Ya se clonaron los genes causantes de estos defectos y se identificó su secuencia, además de aislar las proteínas que codifi- can. El aislamiento de las proteínas de la levadura inició búsquedas exitosas de proteínas homólogas (es decir, proteínas con secuencia relacionada) en sistemas de mamíferos. Una de las lecciones más importantes que se aprendieron con el uso de todas estas técnicas es que las actividades dinámicas del sistema de endomembrana están muy bien conservadas. No sólo las células de levaduras, plantas, insectos y seres humanos efectúan procesos similares, sino que los llevan a cabo con pro- teínas muy parecidas. Es evidente que la diversidad estructural de las células contradice sus similitudes moleculares subyacen- tes. En muchos casos, las proteínas de especies muy distintas son intercambiables. Por ejemplo, los sistemas libres de células obte- nidos de células de mamíferos pueden usar proteínas de levadu- ras para facilitar el transporte de vesículas. Por el contrario, las células de levaduras con deficiencias genéticas que interrumpen alguna fase de la vía biosintética a menudo pueden “curarse” con ingeniería genética para incorporarles genes de mamíferos.
FIGURA 8-6 Formación de vesículas cubiertas en un sistema libre de célu- las. Micrografía electrónica de una preparación de lisosomas que se incubó con los componentes necesarios para promover la gemación dentro de la célula. Las proteínas en el medio se unieron con la superficie de los lipo- somas e indujeron la formación de yemas cubiertas con proteína (flechas). (Cortesía de Lelio Orci y Randy Schekman.)
8.2 A L G U N A S A P R O X I M A C I O N E S A L E S T U D I O D E L A S E N D O M E M B R A N A S 281
evidente en la descripción siguiente, la composición del espacio luminal o cisternas dentro de las membranas del ER es muy diferente de la del espacio citosólico circundante. Las proteínas y lípidos con marcas fluorescentes pueden difundirse de un tipo de retículo endoplásmico al otro, lo que indica que las membranas están interconectadas. De hecho, los dos tipos de compartimientos de dicho retículo comparten muchas de sus proteínas y realizan ciertas actividades comunes, como la síntesis de algunos lípidos y colesterol. Sin embargo, al mismo tiempo muchas proteínas se encuentran sólo en uno u otro tipo de retículo. Como resultado, los dos retículos endoplás- micos tienen diferencias estructurales y funcionales notorias. El retículo endoplásmico rugoso posee ribosomas unidos a su superficie citosólica, en tanto que el liso carece de los riboso- mas. El RER casi siempre se compone de una red de sacos apla- nados ( cisternas ), como se muestra en la figura 8-9. El RER se
continúa con la membrana externa de la envoltura nuclear, que también tiene ribosomas en su superficie citosólica (fig. 8-2 b ). En cambio, los elementos membranosos del SER casi siempre son tubulares (figs. 8-8 y 8-10) y forman un sistema interco- nectado de tuberías que se curvan por el citoplasma. Cuando las células se homogeneizan, el SER se fragmenta en vesículas de superficie lisa, en tanto el RER se fragmenta en vesículas de superficie rugosa (fig. 8-5 b , c ). Los diferentes tipos de células contienen proporciones muy distintas de los dos tipos de retículo endoplásmico, según sean las actividades de la célula. Por ejemplo, las células que secretan grandes cantidades de proteínas, como las pancreá- ticas o las células de las glándulas salivales, tienen regiones extensas de RER (fig. 8-9 b , c ). Más adelante se regresa a la función del RER, pero primero se describen las actividades del retículo endoplásmico liso.
FIGURA 8-9 El retículo endoplásmico rugoso (RER). a Esquema que muestra las pilas de cisternas aplanadas que conforman el ER rugoso. La superficie citosólica de la membrana tiene ribosomas unidos, los cuales dan a las cisternas su apariencia rugosa. b Micrografía electrónica por trans- misión de una porción del ER rugoso de una célula acinar pancreática. Es evidente la división del ER rugoso en un espacio de cisterna (libre de ribo- somas) y un espacio citosólico. c Micrografía electrónica de barrido del ER
rugoso en una célula acinar pancreática. d Visualización del ER rugoso en una célula cultivada completa como se muestra con tinción inmunofluores- cente para la proteína isomerasa de disulfuro (PDI), una proteína residen- te del ER. ( B , Cortesía de S. Ito; C , tomada de K. Tanaka, Int Rev Cytol :101, 1980; D , tomada de Brian Storrie, Rainer Pepperkok y Tommy Nilsson, Trends Cell Biol 10:338, 2000. © 2000, con auto- rización de Elsevier Science.)
Ribosoma
Cisternas del retículo endoplásmico
Citosol
(a) (b)
Ribosomas
Espacio de cisterna
Espacio citosólico
(c) (d)
ERERER
NúcleoNúcleoNúcleo
8.3 E L R E T Í C U L O E N D O P L Á S M I C O 283
284 Capítulo 8 S I S T E M A S D E M E M B R A N A C I T O P L Á S M I C A : E S T R U C T U R A , F U N C I Ó N Y T R Á N S I T O E N L A M E M B R A N A
El retículo endoplásmico liso
El SER está muy desarrollado en diversos tipos celulares, entre ellos los del músculo esquelético, túbulos renales y glándulas endocrinas productoras de esteroides (fig. 8-10). Las funciones del SER incluyen:
● Síntesis de hormonas esteroideas en las células endocrinas de las gónadas y la corteza suprarrenal.
● Desintoxicación en el hígado de diversos compuestos orgáni- cos, como barbitúricos y etanol, cuyo consumo crónico puede conducir a la proliferación del SER en las células hepáticas. La desintoxicación la realiza un sistema de enzimas que trans- fieren oxígeno (oxigenasas), incluida la familia del citocromo P-450. Estas enzimas son notables por su falta de especificidad de sustrato y pueden oxidar miles de compuestos hidrófobos distintos y convertirlos en sustancias más hidrofílicas y más fáciles de excretar. Los efectos no siempre son positivos. Por ejemplo, el compuesto relativamente inocuo benzo[ a ]pireno que se forma cuando se requema la carne en una parrilla se convierte en un carcinógeno potente por efecto de las enzimas “desintoxicantes” del SER. Las enzimas del citocromo P- metabolizan muchos medicamentos prescritos y la variación genética en estas enzimas en los seres humanos explica las diferencias en la efectividad y acciones colaterales de muchos fármacos entre unas personas y otras.
● Secuestro de iones calcio dentro del citoplasma de las células de los músculos esquelético y cardiaco. La liberación regula- da de Ca2+^ del SER (o retículo sarcoplásmico en el caso de las células musculares) inicia la contracción.
Funciones del retículo endoplásmico rugoso
Las investigaciones iniciales sobre las funciones del RER se realizaron en células que secretan grandes cantidades de proteí- na, como las células acinares del páncreas (fig. 8-3) o las células
secretoras de moco del recubrimiento del tubo digestivo (fig. 8-11). A partir del dibujo y la micrografía de la figura 8- resulta evidente que los organelos de estas células epiteliales secretoras se disponen de tal forma en la célula que producen una polaridad distinta en uno y otro extremos de ella. El núcleo y un conjunto grande de cisternas de RER se localizan cerca de la superficie basal de la célula, la cual está próxima al aporte sanguíneo. El aparato de Golgi se localiza en la región central de la célula. La superficie apical de la célula está junto a un conduc- to que transporta las proteínas secretadas fuera del órgano. El citoplasma del extremo apical de la célula está lleno de gránulos secretores cuyo contenido está listo para liberarse hacia el con- ducto en cuanto llega la señal apropiada. La polaridad de estas células epiteliales glandulares refleja el movimiento de las pro- teínas secretoras por la célula, desde el sitio de síntesis hasta el punto por donde se descargan. El retículo endoplásmico rugoso es el punto inicial de la vía biosintética: es el punto donde se sintetizan las proteínas, cadenas de carbohidratos y fosfolípidos que viajan por los compartimientos membranosos de la célula.
Síntesis de proteínas en ribosomas unidos a la mem- brana o en ribosomas libres Ya fue descrito (fig. 8-3) el descubrimiento del retículo endoplásmico rugoso como sitio de la síntesis de proteínas secretoras en las células acinares pan- creáticas. Se obtuvieron resultados similares para otros tipos de células secretoras, incluidas las células caliciformes del intestino que secretan mucoproteínas, las células endocrinas que produ- cen hormonas polipeptídicas, las células plasmáticas que secre- tan anticuerpos y las células hepáticas que secretan proteínas séricas a la sangre. Experimentos posteriores han revelado que los polipépti- dos se sintetizan en dos puntos distintos dentro de la célula.
- Ciertos polipéptidos se sintetizan en los ribosomas unidos con la superficie citosólica de las membranas del RER. Éstos incluyen: a) las proteínas que secreta la célula, b) proteínas integrales de la membrana y c) proteínas solubles que se encuentran en compartimientos del sistema de endomem- brana, como el retículo endoplásmico, aparato de Golgi, liso- somas, endosomas, vesículas y vacuolas vegetales.
- Otros polipéptidos se sintetizan en ribosomas “libres”, es decir, los que no están unidos al RER, y luego se liberan al citosol. Esta clase incluye a: a) las proteínas destinadas a per- manecer en el citosol (como las enzimas de la glucólisis y las proteínas del citoesqueleto), b) proteínas periféricas de la superficie interna de la membrana plasmática (como espec- trinas y anquirinas que sólo mantienen una relación débil con la superficie citosólica de la membrana), c) proteínas transportadas al núcleo (sección 12.1) y d) proteínas que se incorporan en los peroxisomas, cloroplastos y mitocondrias. Las proteínas de los dos últimos grupos se sintetizan hasta terminarlas en el citosol y luego se importan después de la traducción al organelo apropiado a través de su membrana limitante (pág. 318).
¿Qué determina el sitio de la célula en el que se sintetiza una proteína? A principio del decenio de 1970, Günter Blobel, en colaboración con David Sabatini y Bernhard Dobberstein
FIGURA 8-10 El retículo endoplásmico liso (SER). Micrografía electrónica de una célula de Leydig del testículo que muestra el ER liso extenso en el que se sintetizan las hormonas esteroideas. (Tomada de Don Fawcett/ Visuals Unlimited.)
286 Capítulo 8 S I S T E M A S D E M E M B R A N A C I T O P L Á S M I C A : E S T R U C T U R A , F U N C I Ó N Y T R Á N S I T O E N L A M E M B R A N A
según el cual las proteínas tienen incluidos “códigos postales”, se aplica en principio a todos los tipos de proteína que transitan las vías de la célula. Blobel recibió el premio Nobel de Medicina en 1999 por estos estudios pioneros.
Síntesis de proteínas secretoras, lisosómicas o vacuolares vegetales en los ribosomas unidos a membranas Los pasos durante la síntesis de una proteína secretora, lisosómica o vacuolar vegetal se muestran en la figura 8-12. La síntesis del polipéptido inicia después que un RNA (ácido ribonucleico) mensajero se une con un ribosoma libre, es decir, uno que no esté unido con una membrana citoplásmica. De hecho, se cree que todos los ribosomas son idénticos; los empleados en la síntesis de proteínas secretoras, lisosómicas o las de las vacuolas vegeta- les se toman de la misma población ( reserva ) que los utilizados en la producción de proteínas que permanecen en el citosol. Los polipéptidos sintetizados en ribosomas unidos con membranas contienen una secuencia de señal, que incluye un segmento de seis a 15 residuos de aminoácidos hidrófobos, y que dirige al polipéptido naciente a la membrana del retículo endoplásmico, y además conduce a la división en compartimientos del polipép- tido dentro de la luz de este retículo. (Un polipéptido naciente es uno que esté en proceso de síntesis.) Aunque la secuencia de señal casi siempre se localiza en o cerca del extremo N, en algu- nos polipéptidos ocupa una posición interna. Conforme surge del ribosoma, una partícula de reconoci- miento de señal (SRP) identifica la secuencia de señal hidró- foba; dicha partícula posee en las células de mamíferos seis polipéptidos distintos y una pequeña molécula de RNA, llama- da RNA 7S. La SRP se une tanto a la secuencia señal en el polipéptido naciente como al ribosoma (paso 1, fig. 8-12), con lo que detiene temporalmente la síntesis de más polipéptido. La
SRP sirve como una marca que permite que el complejo entero (SRP-ribosoma-polipéptido naciente) se una específicamente a la superficie citosólica de la membrana del retículo endoplásmi- co. La unión a este último ocurre a través de cuando menos dos interacciones bien definidas: una entre la SRP y el receptor de SRP (paso 2), y la otra entre el ribosoma y el translocón (paso 3). El translocón es un canal recubierto de proteína embebido en la membrana del retículo endoplásmico, a través del cual el polipéptido naciente puede moverse en su paso del citosol a la luz del retículo endoplásmico. En los últimos años, uno de los mayores desafíos en el campo del tráfico de membrana ha sido la determinación de la estructura tridimensional de una versión procariótica del trans- locón mediante cristalografía de rayos X. Este esfuerzo reveló la presencia dentro del translocón de un poro con forma de reloj de arena, con un anillo de seis aminoácidos hidrófobos en su diámetro más estrecho. En el estado inactivo (es decir, sin trans- posición), que fue el estado en el que se cristalizó la estructura, la abertura del anillo del poro está taponada por una hélice α corta. Se propone que este tapón sella el canal, impidiendo el paso indeseado de calcio y otros iones entre el citosol y la luz del retículo endoplásmico. Una vez que el complejo SRP-ribosoma-cadena naciente se une a la membrana del retículo endoplásmico (paso 2, fig. 8-12), la SRP se libera de su receptor en el ER, el ribosoma se une al extremo citosólico del translocón, y la secuencia señal en el polipéptido naciente se inserta en el estrecho canal acuoso del translocón (paso 3). Se propone que el contacto de la secuencia señal con el interior del translocón causa el desplazamiento del tapón y la abertura del pasaje. El polipéptido en crecimiento se transpone entonces a través del anillo del poro hidrófobo hacia la luz del retículo endoplásmico (paso 4). Dado que el anillo
FIGURA 8-12 Modelo esquemático para la síntesis de una proteína secre- tora (o una enzima lisosómica) en un ribosoma unido con la membrana del ER rugoso. La síntesis del polipéptido comienza en un ribosoma libre. Conforme la secuencia señal (mostrada en rojo) emerge del ribosoma, se une a la SRP (paso 1), lo cual detiene la traducción hasta que el complejo SRP-ribosoma-cadena naciente puede hacer contacto con la membrana del retículo endoplásmico. El complejo SRP-ribosoma choca entonces con un receptor de SRP situado dentro de la membrana del retículo endoplásmico y se une con él (paso 2). La unión de este complejo al receptor de SRP es seguida por la liberación de la SRP y el enlace del ribosoma con un trans-
locón de la membrana del retículo endoplásmico (paso 3). Estos últimos procesos son acompañados por la hidrólisis recíproca de moléculas de GTP (no se muestra) unidas tanto a la SRP como a su receptor. En el modelo descrito aquí, el péptido señal se une entonces al interior del translocón, desplazando el tapón del canal y permitiendo que el resto del polipéptido se trasponga a través de la membrana de manera cotraduccional (paso 4). Después de que el polipéptido naciente pasa a la luz del ER, el péptido señal se escinde por acción de una proteína de membrana (la peptidasa señal, que no se muestra), y la proteína se pliega con la ayuda de carabinas del retículo endoplásmico, como BiP.
mRNA tRNA SRP
Péptido de señal en polipéptido naciente Receptor del SRP
Receptor del SRP
SRP SRP
Tapón
SRP
Membrana del ER Tapón Tapón
Citosol
Luz del ER BiP u otra chaperona
Translocón
1
2 3 4
Tapón
del poro observado en la estructura cristalina tiene un diámetro (5 a 8 Å) considerablemente menor que el de una cadena poli- peptídica helicoidal, se supone que el poro se expande cuando la cadena naciente atraviesa el canal. (La expansión es posible porque los residuos que constituyen el anillo están situados en diferentes hélices de la proteína del translocón.) Cuando ter- minan la traducción y el paso del polipéptido completo por el translocón, el ribosoma unido a membrana se libera de la mem- brana del retículo endoplásmico y el tapón helicoidal se reinserta en el canal del translocón. Varios de los pasos incluidos en la síntesis y tránsito de las proteínas secretoras se regulan mediante la unión o hidrólisis de GTP (trifosfato de guanosina). Como se trata con detalle en el capítulo 15 y en otra parte de este capítulo, las proteínas de unión con GTP (o proteínas G ) tienen papeles reguladores clave en muchos procesos celulares diferentes. 3 Las proteínas G pueden estar presentes en por lo menos dos conformaciones alternativas, una que contiene una molécula de GTP unida y la otra con una molécula GDP. Las versiones unidas con GTP y GDP de una proteína G tienen conformaciones diferentes y, por consiguiente, capacidades distintas para unirse con otras proteí- nas. A causa de esta diferencia en las propiedades de unión, las proteínas G actúan como “interruptores moleculares”, la proteí- na unida con GTP casi siempre activa el proceso y la hidrólisis del GTP unido lo apaga. Entre los componentes mostrados en la figura 8-12, la SRP y el receptor para SRP son proteínas G. La hidrólisis del GTP unido con estas dos proteínas ocurre entre los pasos 2 y 3 e inicia la liberación de la secuencia de señal por la SRP y su inserción en el translocón.
Procesamiento de proteínas recién sintetizadas en el re- tículo endoplásmico Cuando un polipéptido naciente entra a la cisterna del RER, se somete a la acción de varias enzimas localizadas dentro de la membrana o en la luz del RER. La por- ción N-terminal que contiene el péptido de señal se retira de la mayoría de los polipéptidos nacientes por acción de una enzima proteolítica, la peptidasa de señal. Los carbohidratos se agregan a la proteína naciente mediante la enzima oligosacariltransferasa (descrita en la página 291). La peptidasa de señal y la oligosaca- riltransferasa son proteínas integrales de la membrana que están próximas al translocón y actúan sobre las proteínas nacientes conforme entran a la luz del retículo endoplásmico. El RER es una importante planta procesadora de proteínas. Para realizar sus funciones, la luz del RER está empacada con carabinas moleculares que reconocen proteínas desplegadas o mal plegadas, se unen a ellas y les dan la oportunidad de adquirir su estructura tridimensional correcta (nativa) (pág. 291). La luz del retículo endoplásmico también contiene varias enzimas pro- cesadoras de proteínas, como la isomerasa de disulfuro de proteína (PDI, del inglés protein disulfide isomerase ). Las proteínas entran en la luz del retículo endoplásmico con sus residuos cisteína en el estado reducido (—SH), pero salen del compartimiento con muchos de estos residuos unidos entre sí como disulfuros oxi- dados (—SS—) (pág. 53). La formación (y el reordenamien-
to) de los enlaces disulfuro es catalizada por PDI. Los enlaces disulfuro tienen una función esencial en el mantenimiento de la estabilidad de las proteínas que se encuentran en la superfi- cie extracelular de la membrana plasmática o que se secretan al espacio extracelular. El retículo endoplásmico tiene la construcción ideal para cumplir su papel como puerto de entrada a la vía biosintética de la célula. Su membrana suministra una gran superficie en la cual pueden unirse muchos ribosomas (se estima que son 13 millo- nes en cada célula hepática). La luz de las cisternas del retículo endoplásmico proporciona un ambiente local que favorece el plegamiento y ensamble de las proteínas, así como un compar- timiento en el que las proteínas secretoras, lisosómicas y vacuo- lares de las células vegetales pueden separarse de otras proteínas recién sintetizadas. La separación de las proteínas nuevas en las cisternas del ER las retira del citosol y permite modificarlas y enviarlas a su destino final, ya sea fuera de la célula o dentro de alguno de los organelos membranosos del citoplasma.
Síntesis de proteínas integrales de membrana en los ribo- somas unidos a la membrana Las proteínas integrales de la membrana, distintas a las de las mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas, también se sintetizan en los ribosomas unidos a la membrana del retículo endoplásmico. Estas proteínas de mem- brana se trasladan a la membrana del ER conforme se sintetizan (esto es, al mismo tiempo que la traducción) con los mismos mecanismos descritos para la síntesis de las proteínas secretoras y lisosómicas (fig. 8-12). Sin embargo, a diferencia de las proteí- nas secretoras solubles y las lisosómicas, que pasan por completo a través de la membrana del retículo endoplásmico durante la transposición, las proteínas integrales de membrana contienen uno o más segmentos transmembranosos hidrófobos (pág. 130) que son desviados directamente del canal del translocón hacia el interior de la bicapa lipídica. ¿Cómo puede ocurrir tal transfe- rencia? Los estudios de cristalografía de rayos X del translocón antes descritos mostraron que este último tiene una conforma- ción en forma de almeja con un surco o costura a lo largo del costado de la pared, donde el canal podría abrirse y cerrarse. Se propone que cuando un polipéptido pasa por el translocón, este “puente” lateral en el canal se abre y cierra continuamente, lo cual da a cada segmento del polipéptido naciente la oportuni- dad de dividirse conforme a sus propiedades de solubilidad en el compartimiento acuoso del interior del canal del translocón o el centro hidrófobo circundante de la bicapa lipídica. Aquellos segmentos del polipéptido naciente que sean lo suficientemente hidrófobos se “disolverán” de manera espontánea en la bicapa lipídica y a fin de cuentas se convertirán en segmentos trans- membranosos de una proteína integral de membrana. Este con- cepto ha recibido fuerte apoyo de un estudio in vitro en el cual se dio a los translocones la oportunidad de transponer proteínas nacientes “personalizadas” que contenían segmentos de prueba de diversas hidrofobicidades. Cuanto más hidrófobo el segmen- to de prueba, tanto mayor la probabilidad de que pasara por la pared del translocón y se integrara como un segmento trans- membranoso de la bicapa. La figura 8-13 muestra la síntesis de un par de proteínas integrales de membrana que contienen un solo segmento trans- membranoso. Las proteínas que cruzan una sola vez la mem- brana pueden estar orientadas con el extremo N hacia el citosol o hacia la luz del retículo endoplásmico (y en última instancia
(^3) Las proteínas GTP casi siempre requieren proteínas accesorias para realizar su función. Los papeles de estas proteínas se describen en el capítulo 15 y se ilustran en la figura 15-19. No se consideran en este capítulo, aunque participan en estas actividades.
8.3 E L R E T Í C U L O E N D O P L Á S M I C O 287
Las membranas de los diferentes organelos tienen una composición de lípidos muy diferente (fig. 8-15 a ), lo cual indica que se producen cambios a medida que la membrana fluye por la célula. Existen varios factores que pueden propiciar tales cam- bios (fig. 8-15 b ):
- La mayor parte de los organelos membranosos contiene enzimas que modifican los lípidos que ya están dentro de su membrana y convierte un tipo de fosfolípidos (p. ej., fosfati- dilserina) en otro (p. ej., fosfatidilcolina) (paso 1, fig. 8-15 b ).
- Cuando las vesículas se desprenden de un compartimiento (como en la figura 8-2 a ), algunos tipos de fosfolípidos pue- den incluirse de manera preferencial dentro de la membrana de la vesícula en formación, mientras que otros tipos se dejan atrás (paso 2, fig. 8-15 b ).
FIGURA 8-15 Modificación de la composición de lípidos de las membra- nas. a Histograma que indica el porcentaje de cada uno de los tres fosfolí- pidos (fosfatidilcolina, fosfatidilserina y esfingomielina) en tres membranas celulares diferentes (ER, aparato de Golgi y membrana plasmática). El porcentaje de cada lípido cambia en forma gradual a medida que la mem- brana pasa del ER al aparato de Golgi y luego a la membrana plasmática. b Esquema que muestra tres mecanismos distintos que podrían explicar cómo la composición de fosfolípidos de una membrana en un sistema endomem-
branoso puede ser diferente de otra membrana en el sistema, aunque los compartimientos membranosos tienen una continuación temporal y espa- cial. 1) Los grupos cabeza de los fosfolípidos de la bicapa se modifican por medios enzimáticos; 2) la membrana de una vesícula en formación contiene una composición distinta de fosfolípidos respecto de la membrana de la que se originó; 3) los fosfolípidos pueden retirarse de una membrana e insertarse en otra mediante proteínas para transferencia de fosfolípidos.
2
1
3 50%
ER
ER= retículo endoplásmico GC= aparato de Golgi PM= membrana plasmática eritrocítica
PC= fosfatidilcolina PS= fosfatidilserina SM= esfingomielina
% de fosfolípido total
GC PM ER GC PM ER GC PM
(a)
PC PS SM
(b)
FIGURA 8-14 Mantenimiento de la asimetría de la membrana. Cuando cada proteína se sintetiza en el ER rugoso, se inserta en la bicapa de lípidos con una orientación predecible determinada por su secuencia de aminoácidos. Esta orientación se mantiene mientras viaja en el sistema endomembranoso, como se ilustra en la figura. Las cadenas de carbohidrato, que son las prime- ras agregadas en el ER, representan una manera conveniente de valorar la lateralidad de la membrana porque siempre están en el lado de la cisterna de las membranas citoplásmicas, que se convierte en el lado exoplásmico de la membrana plasmática después de la fusión de las vesículas con ésta.
Exterior
Membrana plasmática
Membrana de la vesícula
Aparato de Golgi
Retículo endoplásmico
Citosol
Proteínas
8.3 E L R E T Í C U L O E N D O P L Á S M I C O 289
290 Capítulo 8 S I S T E M A S D E M E M B R A N A C I T O P L Á S M I C A : E S T R U C T U R A , F U N C I Ó N Y T R Á N S I T O E N L A M E M B R A N A
- Las células contienen proteínas de transferencia de fosfolípidos que pueden unirse y transportar a los fosfolípidos a través del citosol acuoso de un compartimiento de membrana a otro (paso 3, fig. 8-15 b ). Estas enzimas facilitan el movimiento de fosfolípidos específicos del ER a otros organelos. Esto repre- senta una importancia particular para el traslado de lípidos a los peroxisomas, mitocondrias y cloroplastos, que no son parte del flujo normal de membrana a lo largo de la vía bio- sintética.
Glucosilación en el retículo endoplásmico rugoso Casi todas las proteínas producidas en los ribosomas unidos con membranas se convierten en glucoproteínas, ya sean componen- tes integrales de una membrana, enzimas lisosómicas solubles,
vacuolares o partes de la matriz extracelular. Los grupos de car- bohidratos tienen papeles clave en la función de muchas gluco- proteínas, sobre todo como sitios de unión en sus interacciones con otras macromoléculas. También ayudan al plegamiento correcto de la proteína a la que están unidos. Las secuencias de azúcares que comprenden los oligosacáridos de las glucoproteí- nas son muy específicas; si los oligosacáridos se aíslan de una proteína purificada, su secuencia es consistente y predecible. ¿Cómo se logra el orden de los azúcares en los oligosacáridos? La adición de azúcares a una cadena de oligosacárido es catalizada por una familia de enzimas unidas a la membrana llamadas glucosiltransferasas , que transfieren un monosacári- do específico de un azúcar de nucleótido, como GDP-manosa o UDP- N -acetilglucosamina (fig. 8-16), al extremo creciente de
FIGURA 8-16 Los pasos de la síntesis de la porción central de un oligosa- cárido con enlace N en el ER rugoso. Los primeros siete azúcares (cinco manosas y dos residuos de NAG) se transfieren uno a la vez al dolicol-PP en el lado citosólico de la membrana del ER (pasos 1 y 2). En esta etapa, el dolicol con su oligosacárido unido se gira al otro lado de la membrana (paso
- y los azúcares restantes (cuatro manosas y tres residuos de glucosa) están unidos al lado luminal de la membrana. Estos últimos azúcares se unen de una sola vez en el lado citosólico de la membrana con el extremo de la molé- cula de fosfato de dolicol (como en los pasos 4 y 7), que luego se gira al otro
lado de la membrana (pasos 5 y 8) y cede sus azúcares al extremo creciente de la cadena de oligosacárido (pasos 6 y 9). Una vez que el oligosacárido está ensamblado por completo, se transfiere mediante mecanismos enzimáticos a un residuo de asparagina del polipéptido naciente (paso 10). El dolicol-PP rota de nueva cuenta al otro lado de la membrana (paso 11) y está listo para empezar a aceptar azúcares otra vez (pasos 12 y 13). (Tomada de D. Voet y J. G. Voet, Biochemistry, 2nd ed. © 1995, John Wiley & Sons, Inc. Reimpresa con autorización de John Wiley & Sons, Inc.)
P
PP PP
PP
PP
PP PP
PP
PP
P
P
P
P
P
Pi
12
P
P
5 GDP 5 GDP
4 GDP
4 GDP
= N -acetilglucosamina (NAG)
= Glucosa = Manosa = Fosfato de dolicol
13
1
2
2 UDP 1 UMP Dolicol
1 UDP
CDP CTP
Asn-X-Ser/Tre
3 UDP 3 UDP
7
Citosol
Membrana del retículo endoplásmico
mRNA
Ribosoma
Polipéptido naciente
4
8
6
5
(^9 )
11
Luz
Retículo endoplásmico
3
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de modo correcto y continúa su camino (paso 6) o permanece mal plegada, o bien se destruye (paso 7). Se retoma la historia de la glucosilación de las proteínas en la página 296, cuando se describa la manera en que el oligosacá- rido que se ensambló en el retículo endoplásmico crece a su paso por el aparato de Golgi en su camino por la vía biosintética.
Mecanismos que aseguran la destrucción de las proteínas mal plegadas Recién se describió el modo en que las enzimas del retículo endoplásmico identifican las proteínas que no se plie- gan de manera apropiada. Fue una sorpresa descubrir que las pro- teínas mal plegadas no se destruyen en el retículo endoplásmico, sino que se transportan al citosol por un proceso de “transposición inversa”. Sigue siendo incierta la manera en que las proteínas mal plegadas son llevadas de regreso (transposición inversa) al citosol a través de los translocones por los que pasaron en su camino a la luz del retículo endoplásmico o por medio de un canal de trans- posición inversa separado de identidad incierta. Una vez en el citosol, las cadenas de oligosacáridos se retiran y las proteínas mal plegadas se degradan en los proteasomas, que son máquinas des- tructoras de proteínas cuya estructura y función se describen en la sección 12.7. Este proceso, conocido como degradación vinculada al retículo endoplásmico ( ERAD , del inglés ER-associated degrada- tion ), asegura que las proteínas aberrantes no sean transportadas a otras partes de la célula, pero puede tener consecuencias negativas. En casos graves de fibrosis quística, la membrana plasmática de las células epiteliales carece de la proteína codificada por el gen de la fibrosis quística (pág. 160). En todos estos casos, la proteína mutante es destruida en el proceso de control de calidad del retículo endoplásmico, por lo que no llega a la superficie celular. En ciertas circunstancias, las proteínas mal plegadas pue- den generarse en el retículo endoplásmico a mayor velocidad de la que pueden transportarse al citoplasma. La acumulación de proteínas mal plegadas, que puede ser fatal para la célula, inicia un “plan de acción” completo dentro de la célula que se cono- ce como respuesta de proteína no plegada (UPR). El retículo endoplásmico contiene sensores de proteína que vigilan la con- centración de proteínas no plegadas o mal plegadas en la luz del ER. De acuerdo con una propuesta presentada en la figura 8-18, los sensores se mantienen en estado inactivo por chapero- nes moleculares, en especial BiP. Si las circunstancias conducen a la acumulación de proteínas mal plegadas, las moléculas BiP de la luz del retículo endoplásmico se reclutan al servicio como chaperonas para las proteínas defectuosas, lo que las hace incapaces de inhibir a los sensores. La activación de los sensores da origen a una multitud de señales que se transmiten hacia el núcleo y el citosol y el resultado incluye lo siguiente.
● Expresión de cientos de genes diferentes cuyas proteínas codificadas tienen la capacidad de aliviar las condiciones de estrés dentro del retículo endoplásmico. Se incluyen genes que codifican a) chaperonas moleculares con base en el retículo endoplásmico que ayudan a las proteínas mal plega- das a alcanzar su estado nativo; b) proteínas que intervienen en el transporte de proteínas fuera del ER, y c) proteínas que participan en la destrucción selectiva de proteínas anorma- les, como se mencionó antes.
● Fosforilación de una proteína clave (eIF2α) necesaria para la síntesis de proteína. Esta modificación inhibe la síntesis proteica y disminuye el flujo de proteínas nuevas al retículo
BiP BiP
BiP
1
2
3a
3b
3c
4
Proteína mal plegada
Sensores inactivos Sensores activados
Factor de traduc- ción fosforilado
Factor de traducción elF2α
Subunidad ribo- sómica pequeña
Proteínas capaces de aliviar el estrés del ER
mRNA
P (^) P
P
P
BiP
BiP BiP BiP
FIGURA 8-18 Un modelo de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR) de los mamíferos. El ER contiene proteínas transmembranosas que funcionan como sensores de los fenómenos que ocurren en la luz del ER. En condicio- nes normales, estos sensores se encuentran en estado monomérico inactivo como resultado de su relación con moléculas chaperonas, en especial BiP (paso 1). Si el número de proteínas desplegadas alcanzara un nivel alto, se congregan las moléculas chaperonas para ayudar al plegado de las proteínas, lo cual las separa de su relación con los sensores y permite que éstos formen dímeros. Después de la dimerización hay fosforilación de un tipo de sensor y separación del dominio citosólico del otro tipo de sensor, lo que conduce a su activación (paso 2). Una vez activados, los sensores emiten señales a otras partes de la célula. En la figura se indican dos tipos de señales; existe un tercer tipo, que no se muestra. La porción citosólica de un tipo de sensor se difunde por el citosol (paso 3a) y hacia el núcleo (paso 3b), donde estimula la expresión de genes cuyas proteínas codificadas pueden aliviar el estrés en el ER (paso 3c). Estas proteínas incluyen chaperonas, proteínas de cubierta que se forman sobre vesículas de transporte y proteínas de los mecanismos para el control de calidad. El paso 4 muestra un tipo diferente de señal en la que el sensor activado del ER tiene una proteína fosforilada (eIF2α) que se necesita para iniciar la síntesis de proteínas. Este factor de traducción se halla inactivo en el estado fosforilado, lo cual impide que la célula sintetice más proteínas en el ER y suministra más tiempo a la célula para procesar las proteínas que ya están en la luz del retículo endoplásmico.
endoplásmico. Esto suministra a la célula una oportunidad de retirar las proteínas que ya están en la luz del retículo endoplásmico.
Un dato interesante es que la respuesta a la proteína no plega- da es más que un mecanismo de supervivencia celular; también incluye la activación de una vía que conduce a la muerte de la célula. Se presupone que la reacción a la proteína no plegada confiere un mecanismo para aliviar a la célula de condiciones de estrés. Si estas medidas correctivas no tienen éxito, se activa la vía de muerte celular y la célula se destruye.
Del retículo endoplásmico al aparato de Golgi:
primer paso en el transporte vesicular
Los sitios de salida de las cisternas del RER están desprovis- tos de ribosomas, y en ellos se forman las primeras vesículas de transporte de la vía biosintética. El viaje desde el retículo endo- plásmico al aparato de Golgi puede seguirse en forma visual en células vivas si las proteínas secretoras se marcan con la proteí- na verde fluorescente (GFP, del inglés green fluorescent protein ), como se describe en la página 277. Con ésta y otras técnicas se descubrió que en cuanto se desprenden de la membrana del retículo endoplásmico, las vesículas de transporte se fusionan unas con otras para formar vesículas más grandes y túbulos inter- conectados en la región entre el ER y el aparato de Golgi. Esta región se llamó ERGIC (del inglés e ndoplasmic r eticulum G olgi i ntermediate c ompartment , compartimiento intermedio entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi), y los transpor- tadores vesiculotubulares que se forman en él se denominaron VTC (del inglés vesicular-tubular carrier ) (véase fig. 8-25 a ). Una vez formados, los VTC se alejan del retículo endoplásmico hacia el aparato de Golgi. La figura 8-19 muestra el movimiento de dos de estos transportadores membranosos vesiculotubulares del ERGIC al aparato de Golgi. El movimiento de los VTR ocurre sobre rieles compuestos por microtúbulos.
8.4 EL APARATO DE GOLGI
En los últimos años del siglo xix, un biólogo italia- no, Camillo Golgi, inventó nuevos procedimientos de tinción para revelar la organización de las células nerviosas dentro del sistema nervioso central. En 1898, Golgi aplicó una tinción metálica a las células nerviosas del cerebelo y descubrió una red teñida de oscuro localizada cerca del núcleo celular. Esta red, que más tarde se identificó en otros tipos celulares y se llamó aparato de Golgi , llevó a su descubridor a obtener el premio Nobel en 1906. El aparato de Golgi permaneció como centro de controversia durante decenios entre los que creían que el organelo existía en las células vivas y los que pensaban que era un artefacto , es decir, una estructura artificial formada durante la preparación para el estudio microscópico. No fue sino hasta que el aparato de Golgi se identificó con claridad en células sin fijación, preparadas por congelamiento y fractura (véase fig. 18-17) que se comprobó su existencia más allá de cualquier duda razonable.
REVISIÓN?
- ¿Cuáles son las principales diferencias morfológicas entre el RER y el SER y cuáles son sus funciones?
FIGURA 8-19 Visualización del tránsito de membrana con el uso de una marca fluorescente. Esta serie de fotografías muestra una pequeña porción de una célula viva de mamífero que se infectó con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) que contiene el gen quimérico VSVG - GFP (pág. 278). Una vez que se sintetiza en el ER rugoso, la proteína de fusión emite una fluorescencia verde que puede seguirse conforme la proteína se mueve por la célula. En la serie de fotografías que se muestran,
dos portadores vesiculotubulares (flechas) que contienen la proteína fluo- rescente se desprendieron del ER y se mueven hacia el aparato de Golgi (GC). La serie de fenómenos representados tienen lugar en un periodo de 13 segundos. La barra representa 6 μm_._ (Reimpresa con autorización de John F. Presley et al., Nature 389:82, 1997; © 1997, Macmillan Magazines, Ltd.)
- Describa los pasos que ocurren entre el momento en que el ribosoma se une con un RNA mensajero que codifica una proteína secretora y el momento en que la proteína sale del retículo endoplásmico rugoso.
- ¿Cómo se insertan las proteínas recién sintetizadas en una membrana?
- Describa algunas de las formas en que los organelos membranosos pueden mantener su composición única a pesar del tránsito continuo de membranas y materia- les a través de ellos.
- Describa cómo se mantiene la asimetría de la membra- na conforme ésta se mueve del retículo endoplásmico a la membrana plasmática.
- Describa los mecanismos por los cuales la célula ase- gura que las proteínas mal plegadas: a) no salgan del retículo endoplásmico y b) no se acumulen hasta niveles excesivos dentro de la luz del retículo endoplásmico.
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