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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA
source in the culture medium. Additionally we
evaluated the ratio of organic-inorganic nitrogen
source in the culture medium, with the purpose
of improving the insecticide crystal protein (ICP)
for a native strain.
Keywords : Bacillus thuringiensis , biopesticides,
growth media, fermentation
INTRODUCCION
El hombre necesita de los procesos bioquímicos para la obtención de productos benéficos y necesarios tales como alcoholes, antibióticos, vitaminas, entre otros muchos; todo esto mediante el empleo de organismos tales como bacterias, hongos y levaduras. Hacia mediados del siglo pasado, Pasteur observó que los procesos de alcohólisis eran producidos específicamente por levaduras; fue así como comenzaron una serie de estudios encaminados a la obtención de productos químicos como el glicerol, ácidos láctico, acético, cítrico, productos farmacéuticos como endorfinas, insulina, vacunas; y más recientemente la producción de polímeros por fermentación denominados biopolímeros; por lo tanto es preciso integrar disciplinas que abarcan variados aspectos convirtiéndose, de esta manera, en un área multidisciplinaria e interactuante con un objetivo en común: obtención de productos benéficos a la humanidad. En la busqueda de nuevas alternativas en el control de plagas, se ha generado a nivel mundial gran cantidad de conocimiento sobre el Bacillus thuringiensis, bacteria que produce una inclusión cristalina cuando esporula, cuya actividad patogénica sobre diferentes larvas de insectos ha sido ampliamente reportada. Para países como Colombia se constituye en oportunidad el estudio y evaluación de su biodiversidad microbiana, particularmente de Bacillus thuringiensis , con el propósito de obtener
RESUMEN
En este trabajo se estudio el medio de cultivo
para la fermentación con Bacillus thuringiensis
tendiente a la producción del ingrediente activo
de un biopesticida que emplea cepas nativas de
esta bacteria. Se realizaron fermentaciones en
matraz de 1000 mL de volumen total con 100
mL de volumen de fermentación, utilizando 10
mL de inóculo bacteriano, una temperatura de
29 oC y una velocidad de agitación de 200
revoluciones por minuto (rpm). El estudio se
realizó empleando un modelo de diseño
experimental con glucosa como fuente de
carbono evaluando la concentración de las
fuentes de minerales en el medio de cultivo para
la cepa HD1. También se evaluó la relación
óptima entre el nitrógeno orgánico y el nitrógeno
inorgánico en el medio de cultivo, para la
producción de proteina asociada al cristal para
la cepa nativa Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional (IBUN) 28.5.
Palabras Claves: Bacillus thuringiensis ,
biopesticidas, medio de cultivo, fermentación.
SUMMARY
In this work was studied the culture medium for
the Bacillus thuringiensis fermentation, the
purpose was the production of biopesticide using
as active ingredient native strains. The culture
was developed in flasks of 1000 ml containing
100ml of culture medium, which was inoculated
with 10ml of the bacteria, incubated at 29 C
and 200 rpm. In this study we used an
experimental design model for the strain HD
of Bacillus thuringiensis , with glucose as carbon
source, evaluating the concentration of mineral
(^1) Investigadores del Instituto de Biotecnologia de la Universidad Nacional.
ESTRATEGIA PARA EL DISEÑO DE UN MEDIO DE CULTIVO PARA LA
FERMENTACION CON BACILLUS THURINGIENSIS
STRATEGY TO CULTURE MEDIA DESIGN FOR THE FERMENTATION OF
BACILLUS THURINGIENSIS
Beltrán^1 L, Díaz S, Berdugo C, Zamora A, Buitrago G, Moreno N.
insumos de origen biológico con capacidad para controlar insectos plaga.
Las componentes más importantes del medio de cultivo con respecto al crecimiento de Bacillus thuringiensis son la concentración de la fuente de carbono y la relación entre el nitrógeno orgánico y el inorgánico (Rossa y Mignone, 1993). De esta manera se ha planteado como objetivo principal del presente trabajo la formulación de un medio de cultivo que favorezca la producción de biomasa y su esporulación con la consecuente liberación del cristal proteico (inclusión paraesporal), empleando la subespecie kurstaki de Bacillus thuringiensis ; estos resultados se aplicaron en fermentaciones a nivel de laboratorio empleando una cepa nativa de Bt procedente del cepario del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN).
Se han dedicado esfuerzos a diseñar medios de cultivo que aporten fuentes de carbono, nitrógeno y elementos nutritivos que favorezcan tanto la formación de espora como de cristal. Se propone el uso de una combinación de fuente de nitrógeno orgánico (debido a que la bacteria requiere de algunos aminoácidos o péptidos esenciales para el crecimiento) e inorgánico. De ellos los más apropiados son el extracto de levadura y el sulfato de amonio respectivamente.
Del trabajo de Sakharova y colaboradores (1989), quienes estudiaron la subespecie galleriae, se concluye que el exceso de glucosa en el medio genera una reducción en el número de células y en la velocidad de crecimiento durante la fase exponencial, afectando la formación de esporas; adicionalmente establecieron que a niveles mayores de 15 g/L de extracto de levadura se inhibe la esporulación. Avignone (1989) realizó investigaciones con el objeto de estudiar la influencia de las combinaciones de nitrógeno orgánico (extracto de levadura) e inorgánico (sulfato de amonio) y la relación C:N sobre el crecimiento y producción de proteína de Bacillus thuringiensis , subespecie israelensis. El extracto de levadura por sí solo no garantiza una adecuada producción de toxina, por lo que se debe emplear sulfato de amonio. Así, mostraron que tiene mayor influencia sobre la producción de proteína la combinación de fuentes de nitrógeno que la relación C:N.
Navarro y Acosta (1994) en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional, realizaron un estudio de tres fuentes de carbono (glucosa, sacarosa y glicerol) para determinar cual permitia mayor producción, al tiempo que evaluaron el efecto del extracto de levadura y el sulfato de amonio sobre la producción de la toxina. Concluyeron que la mejor fuente de carbono es la glucosa y propusieron el medio cuya composición en g/ L es: glucosa 6, sulfato de amonio 2 y extracto de levadura 2, emplearon como variable respuesta en el análisis, el conteo de esporas, como medida indirecta
de la cantidad de cristales producidos durante la fermentación.
MATERIALES Y METODOS La cepa de interés proveniente de placas de mantenimiento se reactivó en placas con medio Luria Bertani (LB) sólido (Cerón, 1991) cuya composición y pH son: bacto-triptona 1.0%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 1.0%, agar 1.5%, pH 7.3. El preinóculo se preparó en 10 mL de medio LB líquido (sin agar), sembrando una asada de la bacteria proveniente de la placa y en estado de esporulación, se incuba por 12 horas para posteriormente sembrar 90 mL del medio de acuerdo con el diseño experimental (Berdugo y Zamora, 1995).
Con el propósito de establecer condiciones de experimentación sin limitación de oxígeno se realizaron ensayos en erlenmeyers de 250 mL con niveles de volumen vacío en relación 1:5 a 1:10 con tapones de algodón, encontrando que, para la primera relación se estancaba la esporulación, en tanto que para la segunda esta aumentaba substancialmente la formación de espora con lo cual se seleccionó para el presente trabajo la segunda condición. Esto garantiza un suministro de oxígeno tal que su concentración en el medio no sea condición limitante para el microorganismo.
Medio de cultivo. El medio para el crecimiento debe contener una fuente de materia y energía; en este trabajo se estudio la glucosa como fuente de carbono. Como fuente de nitrógeno inorgánico se empleó sulfato de amonio, que se consume en la fase exponencial del crecimiento (Abarca et al, 1992) y como fuente orgánica de nitrógeno el extracto de levadura que suministra adicionalmente aminoácidos (Nickerson y Bulla, 1974) que también son fuente de energía (Anderson, 1990). Dentro de los minerales informados como importantes en la literatura se evaluaron los siguientes por las razones que a continuación se exponen:
Ca+ : es importante en la esporulación puesto que forma la pared de la espora, obra como compuesto estabilizador, especialmente para el calor y los rayos ultravioleta. La limitación del crecimiento por Ca produce esporas menos resistentes al calor (Ertola, 1985). K+ : es fundamental para el crecimiento, esporulación y producción de la endotoxina (Wakisaka et al, 1982). Mn2+: es esencial para la formación de endoesporas en las distintas especies de Bacillus (Harwood, 1989). Mg2+ : junto con el fósforo intervienen en las reacciones que involucran adenosín difosfato en la transferencia de energía.
Se incluyen también Zn2+ , Cu2+ y Fe2+ , minerales que aunque en menor grado son importantes, su ausencia podría ser limitante de crecimiento.
ESTRATEGIA PARA EL DISEÑO DE UN...
Tabla 2. Composición de los medios de cultivo evaluados (g/L).
Tabla. 3 Minerales constituyentes empleados en el medio.
Tabla 4. Concentración de fuentes de nitrógeno para cada relación No/Ni
Tabla 5. Resultados obtenidos para los experimentos de la tabla No. 2
Aquí se observa la mayor producción de proteína con el medio número 3, mientras que la mayor cantidad de esporas se obtiene con el medio número 9. Se destaca la importancia del CaCl 2 , MgSO 4 y el extracto de levadura en la producción de esporas, así como el MnSO 4 , MgSO 4 y el sulfato de amonio en la producción de proteina.
Para el análisis de interacción entre factores se utilizó el paquete estadístico STATGRAPHICS. Los resultados que arroja el paquete se aprecian en las tablas Nos. 6, 7 y 8. Se evaluan interacciones hasta de segundo orden. Las interacciones de ordenes 3 y 4 están enmascaradas y permiten calcular el error. Resultan relevantes las interacciones cuyo nivel de significancia sea menor de 0.10. Los coeficientes de regresión positivos indican que la respuesta se favorece incrementando los niveles de los factores involucrados. Si los coeficientes son negativos, se favorece la respuesta al disminuir los niveles de los factores (Lui y Liao, 1994).
Tabla 6. Interacciones relevantes en la producción de biomasa
R cuadrado: 0. A: Glucosa; B: Extracto de levadura; C: Sulfato de amonio D: CaCl 2 ; E: K 2 HPO 4 ; F: KH 2 PO 4 ; G: MnSO 4 ; H: MgSO 4
En cuanto a la producción de biomasa se observa relevancia en las interacciones (A) glucosa con (C) sulfato de amonio, (E) K2HPO4 , (F) KH2PO4, (G) MnSO4, (H) MgSO4 donde se verifica la importancia de estos sustratos en el crecimiento.
En la producción de esporas se destacan las interacciones: glucosa (A) - CaCl2 (D) glucosa (A) - MgSO4 (H) glucosa (A) - Ext. de levadura (B)
En la producción de proteína, las interacciones más importantes son: K2HPO4 (E) - MnSO4 (G) K2HPO4 (E) - MgSO4 (H) KH2PO4 (F) - (NH4)2SO4 (C) KH2PO4 (F) - MgSO4 (H)
Factores independientes e interactuantes
Coeficiente de regresión
Estadígrafo t Nivel de significancia
CONSTANTE 1.933125 111.1243 0. A 0.035625 2.0479 0. C 0.034375 1.9760 0. E -0.049375 -2.8383 0. AC 0.066875 3.8443 0. AE 0.043125 2.4790 0. AF 0.043125 4.2035 0. AG -0.106875 -6.1436 0. A*H -0.100625 -5.7844 0.
Factor Ensayo A B C D E F G H 1 20 1.73 2 0.08 0.32 0.8 0.0017 0. 2 20 1.73 2 0.16 0.32 1.6 0.0034 0. 3 20 1.73 5.88 0.08 1.029 0.8 0.0034 0. 4 20 1.73 5.88 0.16 1.029 1.6 0.0017 0. 5 20 3.46 2 0.08 1.029 1.6 0.0017 0. 6 20 3.46 2 0.16 1.029 0.8 0.0034 0. 7 20 3.46 5.88 0.08 0.32 1.6 0.0034 0. 8 20 3.46 5.88 0.16 0.32 0.8 0.0017 0. 9 30 1.73 2 0.08 1.029 1.6 0.0034 0. 10 30 1.73 2 0.16 1.029 0.8 0.0017 0. 11 30 1.73 5.88 0.08 0.32 1.6 0.0017 0. 12 30 1.73 5.88 0.16 0.32 0.8 0.0034 0. 13 30 3.46 2 0.08 0.32 0.8 0.0034 0. 14 30 3.46 2 0.16 0.32 1.6 0.0017 0. 15 30 3.46 5.88 0.08 1.029 0.8 0.0017 0. 16 30 3.46 5.88 0.16 1.029 1.6 0.0034 0.
Reactivo Concentración mg/ml KH 2 PO 4 6. FeSO 4 ·7H 2 O 0. MgSO 4 ·7H 2 O 0. ZnSO 4 ·7H 2 O 0. MnSO 4 0. CaCl 2 0.
No/Ni Extracto de levadura (g/L) Sulfato de amonio (g/L) 1 4.47 1. 2 5.92 1. 3 6.7 0. 4 7.18 0. 5 7.47 0.
MEDIO BIOMASA (mg/mL)
ESPORAS (esporas/mL)
PROTEINA (mg/mL)
1 1.79 3.4x10^7 0. 2 2.18 1.10x10^7 0. 3 1.96 2.5x10^8 0. 4 1.96 1.2x10^6 0. 5 1.79 1.4x10^6 0. 6 1.98 1.7x10^6 0. 7 1.88 0 0. 8 2.11 1.2x10^7 0. 9 1.91 3.5x10^8 0. 10 1.80 3.4x10^7 0. 11 2.18 2.3x10^8 0. 12 2.06 1.2x10^8 0. 13 1.58 3.4x10^7 0. 14 2.18 2.5x10^7 0. 15 2.18 2.3x10^7 0. 16 1.93 3.4x10^7 0.
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Tabla 7. Interacciones relevantes en la producción de esporas.
R cuadrado: 0. A: Glucosa; B: Extracto de levadura; C: Sulfato de amonio D: CaCl2; E: K 2 HPO 4 ; F: KH 2 PO 4 ; G: MnSO 4 ; H: MgSO 4
Por último se presentan los resultados obtenidos en el estudio de la relación No/Ni. El objetivo de realizar ensayos correspondientes a dos niveles de glucosa en el medio obedeció a determinar cual de los niveles reportados en la bibliografia es el mejor en cuanto a la producción de biomasa utilizando una cepa nativa de Bt (Scherrer y colaboradores, 1973). Este se establece en 6 g/L por producirse a este nivel mayor concentración de biomasa (5.8 mg/mL) respecto al de 8 g/L con el cual se obtuvo una concentreación de biomasa de 3.7 mg/mL.
Tabla. 8 Interacciones relevantes en la producción de
proteína R cuadrado: 0. A: Glucosa; B: Extracto de levadura; C: Sulfato de amonio D: CaCl2; E: K 2 HPO 4 ; F: KH 2 PO 4 ; G: MnSO 4 ; H: MgSO 4
Para las diferentes relaciones de nitrógeno se presentan los resultados en la tabla No. 9. Los altos valores de nitrógeno encontrados en el medio de cultivo pueden deberse a la presencia de restos procedentes de la lisis celular, la cual no es posible controlar; esto podría estar enmascarando el verdadero consumo de nitrógeno.
De acuerdo con lo observado, se tiene que para la primera relación su tiempo de duplicación es de dos horas y media, mientras que para las demás es cerca de hora y media, esto permite concluir que a medida que se aumentan las relaciones, se reproduce más rápido el
microorganismo, ventaja económica si se piensa en la producción de la proteína a nivel industrial. El valor reportado corresponde al promedio entre la fermentación y su duplicado. La desviación estándar de los ensayos no supera el 5 %, valor estadístico máximo válido para ensayos en suspensiones (Scragg, 1996). A pesar de que la máxima producción de biomasa se obtuvo con la relación No/Ni = 1, su contenido de proteína asociada al cristal fue uno de los más bajos de las relaciones estudiadas, mientras que para No/Ni=5 se produjo la más baja cantidad de biomasa pero su contenido proteico fue de los más altos.
Tabla 9. Resultados del estudio de la relación No/Ni en el medio de cultivo
ND No fue evaluado.
El estudio estadístico se realizó con el fin de obtener una correlación matemática que reproduzca el sistema con el objeto de determinar el punto de máxima producción de proteína asociada al cristal en función de la relación No/Ni. Después de analizados los resultados entre la relación No/Ni y la cantidad de proteína asociada al cristal se obtuvo como modelo matemático:
(2)
donde P es la proteína asociada al cristal y R la relación No/Ni
Desarrollando matemáticamente la ecuación anterior en su primera derivada se obtienen las raíces: R 1 = 1,49; R 2 = 4,22. Reemplazandolas en la segunda derivada de la ecuación (1) se tiene: Reemplazando el valor de máxima producción en el modelo se tiene que la cantidad de proteína esperada en la fermentación para R = 4,22 es P = 0,904 mg/mL. Con el fin de comprobar la validez de la correlación matemática propuesta, se realizó una fermentación por duplicado utilizando el nivel de máxima producción, con las cepas IBUN28.5 y HD1. Las concentraciones de las
Factores independientes e interactuantes
Coeficiente de regresión
Estadígrafo t Nivel de significancia CONSTANTE 8.64125E+7 7.7777 0. A 4.55875E+7 4.1032 0. B -5.73625E+7 -5.1630 0. E -2.85875E+7 -2.5731 0. F 2.47875E+7 2.2310 0. G 3.99625E+7 3.5969 0. AD -3.92375E+7 -3.5316 0. AH -2.90125E+7 -2.6113 0. A*B -2.41375E+7 -2.1725 0.
Factores independientes e interactuantes
Coeficiente de regresión
Estadígrafo t Nivel de significancia
CONSTANTE 0.492813 41.0414 0. A 0.019688 1.6396 0. EG 0.023188 1.9311 0. C 0.025938 2.1601 0. EH 0.032188 2.6806 0. FC -0.028062 -2.3370 0. FH 0.021563 1.7957 0.
(No/Ni) Biomasa (mg/mL)
Proteína (mg/mL)
%N Consumido
μ (h-1)
td (h)
Esporas/mL (*10-8) 0 2.35 0.43 - ND ND 3. 1 5.88 0.64 16 0.285 2.43 3. 2 5.34 0.62 17.43 0.468 1.48 3. 3 5.76 0.79 23.1 0.484 1.43 3. 4 5.69 0.88 25 0.432 1.60 3. 5 5.04 0.82 19.3 0.519 1.33 3.
P = − 0 02945 , * R^3 + 0 2525, * R^2 − 0 5580, * R +0 9749,
Para R = 1,
d P
dR
> 0 Minimo
Para R = 4,
d P
dR
< 0 Maximo
2 2 2 2
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El medio de cultivo propuesto para la cepa nativa IBUN28. tiene una composición de 6 g/L de glucosa, 7.3 g/L de extracto de levadura, 0.57 g/L de sulfato de amonio y los minerales presentados en la tabla No. 3. El modelo propuesto para la proteína en función de la relación No/Ni fue determinado y corroborado para los límites propuestos; sin embargo al ser extrapolado para relaciones por debajo de la unidad, la proteina producida es mayor a la encontrada en No/Ni =1, esto va en contra de lo reportado en la literatura para la
utilización de las fuentes de nitrógeno por parte del microorganismo, (Avignone, 1990; Arcas et al., 1984), pero sobre todo en contra vía de los resultados encontrados en este trabajo, al nivel No=0, por lo tanto el modelo propuesto no debe ser extrapolado. Se recomienda estudiar niveles por debajo de la unidad por presentarse en este punto un minimo de valor similar al de No/Ni=0, lo cual lleva a pensar que el microorganismo tiene un comportamiento diferente al presentado por el modelo en esta zona.
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