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Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc Catodo (^) Catodo
ML MET(TEM) MEB (SEM)
Bobinas electromagnéticas = lentes electromagnéticas
MET = Dispersión de los electrones y MEB = haz de electrones muy estrecho (10 nm de diámetro)
Poder de resolución del aparato (MET) = 0.2 nm (polvo metálico)
Poder de resolución de la muestra con MET = 2.0 nm (tejidos biológicos, etc)
MET aumentos = aprox. 150 000 - 500 000 veces
Limitantes principales de la microscopia electrónica:
1. Escaso poder de penetración del haz de electrones: por lo tanto cortes muy delgados (50 nm)
2. Escasa movilidad de los electrones en el aire: al “alto vacio” (no investigación en células vivas)
ME de alto voltaje con un haz de electrones con 10 veces más rico en energía (más de 60 000 voltios)
MEB = No cortes ultrafinos
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes métodos. Secciones más finas se obtienen endureciendo más el tejido. Esto se puede conseguir mediante la congelación o embebiendo el tejido en sustancias que solidifican como la parafina o resinas. Téngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y objetos del dibujo no están a escala. Una rejilla es mucho más pequeña que un portaobjetos. Las dimensiones en μm y nm se refieren al espesor de las secciones.
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc
Además, si queremos estudiar la ultraestructura celular hay que tener en cuenta
que el grosor de una membrana celular es de unos 70 nanometros.
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc
Todos los ultramicrotomos actuales tienen un panel de control externo al aparato desde donde se
controla electrónicamente el proceso de corte: inicio de corte, grosor de la sección, velocidad de corte,
ventana de corte, iluminación de la muestra, etcétera
Al realizar cortes muy
delgados cualquier
vibración o cambio de
temperatura afecta la
homogeneidad del grosor
del corte, por tanto el
ultramicrotomo debe
situarse en una habitación
donde no haya vibraciones
y mantenerla a temperatura
constante para evitar
dilataciones del brazo que
porta la muestra, dentro de
lo posible. Además, estos
aparatos se colocan sobre
mesas especiales para
disminuir las vibraciones.
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc
Fibrocito = Fibroblasto “no activo” con
escaso RER y un pequeño aparato de Golgi
ANALISIS MORFOLOGICOS.
MET
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc
Fotomicrografía del epitelio cilíndrico del
intestino delgado con ribete o borde en
cepillo (“chapa estriada”). H-E. x660.
Borde en cepillo
ANALISIS MORFOLOGICOS.
ML
Fotomicrografía electrónica del epitelio
cilíndrico del intestino delgado. Se
distinguen las microvellosidades
adyacentes paralelas que componen el
borde en cepillo. MET x70000.
MET
Dra. María Leticia Moreno Martínez
ANALISIS MORFOLOGICOS.^ Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc
MET
Dra. María Leticia Moreno Martínez
Inmunohistoquímica para tubulina - microtubulos^ Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc
ML
MET
L
O
N
G
T R A N S V
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MET
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc 1160 platos
Catalasa Fosfatasa Acida
Explantes
Grosor 1 mm
48 - 50 explantes
por plato de cultivo
INTEGRIDAD
MORFOLOGICA
Y
FUNCIONAL
* Morfológico
M.Luz (HE,
grasa y
glucógeno)
* Bioquímico
(TAT)
PERFUSION
CULTIVOCULTIVO DEDE ORGANOORGANO Sol’n. Hanks Heparina Fructosa y Suero ( 360 ) ( 320 ) Control PA 10 ug/ml 8 explantes de cada plato
ESTUDIOS
MORFOLOGICOS
42 explantes de cada plato
ESTUDIOS
BIOQUIMICOS
Peroxisomas Autolisosomas
Autofagosomas
Actividades enzimáticas:
Catalasa Catepsina D
Tiolasa Fosfatasa Acida
Homogenizado
MINUTOS
Análisis morfométrico
( MET;1568 micrografías):
Fracción de Volumen
( 240 ) ( 240 ) Inhibidor Inhibidor
(vía autofágica) + PA
Viabilidad del Cultivo: Bioquímico (LDH y TAT) y Morfológico (M.Luz). Inhibidores: Asn, Metilamina y 3-Metiladenina.
MINUTOS
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL: ANALISIS MORFOMETRICO
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc El metodo de Weibel para calcular la densidad de volumen es como sigue:
- Una rejilla cuadriculada se sobrepone en cada micrografía electrónica.
- Posteriormente se realiza el conteo de puntos que coinciden con las estructuras en análisis, por ejemplo el conteo de peroxisomas, autofagosomas y autolisosomas que contienen material de origen peroxisomal.
- Se determina la densidad de volumen por aplicar la fórmula:
Vvi = Pi / Pc
Donde Vvi = es la densidad de volumen del organelo en análisis
Pi = puntos que coinciden del organelo en análisis
Pc = puntos totales del citoplasma (esto es puntos totales de la plantilla)
ANALISIS MORFOMETRICO CON MET
Para el cálculo del perímetro celular se puede utilizar un analizador de imagen: Diámetro FERET (Sigma Scann Pro). Estudio morfométrico computarizado: MET y ML (MORPHON)
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ANALISIS MORFOLOGICOS.
ULTRAESTRUCTURA CON MET
Dra. María Leticia Moreno Martínez Escuela de Medicina, Univ Cuauhtémoc Efecto de PA 1 ( 10 g/ml) y de 3 - metiladenina ( 5 mM) sobre la fracción de volumen de autolisosomas fosfatasa ácida + (gráfica A), la fracción de volumen de peroxisomas, autofagosomas y autolisosomas catalasa + (gráfica B), a 120 minutos de cultivo. Los valores de cada barra representan la media desviación estándar de 64 micrografías electrónicas, correspondientes a 80 placas de cultivo. PA 1 = peroxisomicina A 1 y 3 - Mad. = 3 - metiladenina.
A
B
ESTUDIO
MORFOMETRICO
MET
