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Orientación Universidad
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practica 8_pruebas para la identificación de cepas y poblaciones bacterianas., Exámenes de Microbiología

practicas en la materia de microbiologia.

Tipo: Exámenes

2020/2021

A la venta desde 25/08/2021

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Universidad Tecnológica de
Morelia.
Módulo:
Microbiología.
Grupo:
Biotecnologa 3A
Actividad:
Actividad 13. Practica 8_ pruebas para la identificación de cepas y
poblaciones bacterianas.
Objetivo de la practica:
El alumno realizara pruebas bioquímicas y moleculares para
identificar un microorganismo.
Alumna:
Alexia Sainz Oseguera.
Docente:
Alma Teresa Miranda Quiroz.
Fecha de entrega: 12 de agosto de 21
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¡Descarga practica 8_pruebas para la identificación de cepas y poblaciones bacterianas. y más Exámenes en PDF de Microbiología solo en Docsity!

Universidad Tecnológica de

Morelia.

Módulo:

Microbiología.

Grupo:

Biotecnologí a 3A

Actividad:

Actividad 13. Practica 8 _ pruebas para la identificación de cepas y

poblaciones bacterianas.

Objetivo de la practica:

El alumno realizara pruebas bioquímicas y moleculares para

identificar un microorganismo.

Alumna:

Alexia Sainz Oseguera.

Docente :

Alma Teresa Miranda Quiroz.

Fecha de entrega: 12 de agosto de 21

1. PRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS Y POBLACIONES

BACTERIANAS.

1.1. Revisió n de conceptos previos a la actividad experimental.

Revisar las metodologias empleadas en la biologia molecular para la identificacion de los microorganismos escribirlo en forma de diagrama del proceso de identificació n molecular de un m.o.

Llevar una tabla con los posibles resultados asi como la interpretació n de los mismos. (pruebas bioquí micas McFadden).

  1. Un color amarillo muy ligero tambié n implica resultado positivo.
  2. La aparició n de un color naranja tras 24 a 48 horas de incubació n corresponde a un resultado negativo.
  3. Lectura en la c ú pula (zona aeró bia).
  4. La fermentaci ó n comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidaci ón empieza en la c ú pula. 5 Una ligera coloraci ó n rosa, que aparece tras 10 min, debe ser leí da como negativa.

1.2. Fundamento de la practica.

Los métodos más utilizados para la identificación de géneros y especies bacterianas se basan en análisis moleculares mediante la extracción y secuenciación de ADN y en pruebas bioquímicas, a través, de las cuales se detecta el metabolismo del microorganismo en las que intervienen una o más enzimas. (Organizació n Mundial de la Salud. (2004) Laboratory biosafety manual. 3a ed. Gé nova: Organizació n Mundial de la Salud). En estos ensayos enzimáticos se puede analizar la utilización de un determinado sustrato, la producción de uno o más intermediarios metabólicos o del compuesto terminal de una vía metabólica .(Cercenado E, 2010, Metodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiologia de Recomendaciones de la Sociedad Españ ola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologí a Clí nica). De gran importancia resulta la aplicación de pruebas bioquímicas que permiten identificar bacterias patógenas, particularmente, aquellas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Para diferenciar algunos géneros se necesitan principalmente cuatro pruebas que se denominan colectivamente IMViC (indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato). La prueba de Indol detecta la liberación de este en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del triptófano por la triptofanasa. La prueba de citrato determina si un microorganismo utiliza citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando un cambio de color de verde a azul en el medio. Entre las enterobacterias se dan estas características en: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y S. paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. ( Alexopulus, C. L985. Introducción A La Micología. Ediciones Omega S. A. Barcelona). La prueba de Rojo de metilo forma parte del IMVIC y permite la diferenciación de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes, mediante la Fermentación ácido mixta: en la cual los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) y puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. La prueba de Voges Proskauers forma parte del IMVIC y permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes, mediante la Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter. Los productos finales son compuestos como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico. Rámirez-Gama, R. M. (2003) Manual de prácticas de Microbiología General. Fac. Química, UNAM. México.

Mecheros: es un instrumento utilizado en laboratorios para calentar muestras y sustancias químicas. TSI: es un medio de diferenciación para organismos entéricos gram negativos basada en su capacidad para fermentar dextrosa, lactosa y sacarosa y para producir sulfuro. Campana de flujo laminar: es una mesa de trabajo o espacio cerrado similar, que crea un ambiente libre de partículas, tomando aire a través de un sistema de filtración y expulsándolo a través de la superficie de trabajo mediante una corriente de aire laminar o unidireccional. Asas bacterioló gicas: es un instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una base hecha de aluminio, y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno platino que termina punta. Citrato Simmons: es un medio diferencial utilizado para el estudio de bacilos Gram negativos, sobre la base de la utilización del Citrato como una fuente de carbono, y la utilización de sales de amonio inorgánico como única fuente de nitrógeno.

Pipetas 5ml: es similar a un cuentagotas, generalmente formada por un tubo de vidrio con borde cónico. Sirve para hacer la transferencia de pequeñas cantidades de líquidos. RM-VP: Determina la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa por dos vías metabólicas: por un lado, con producción de un producto final neutro (VP) o por otro lado, con producción de un producto final ácido (RM). Probetas: es un instrumento volumétrico que consiste en un cilindro graduado, es decir, lleva grabada una escala por la parte exterior que permite medir un determinado volumen. Fenilalanina: es un aminoácido esencial que absorbemos a partir de las proteínas que ingerimos. Los humanos necesitamos la fenilalanina para metabolizar las proteínas, crecimiento.

Probetas 100 ml: suelen ser graduadas, es decir, llevan grabada una escala por la parte exterior que permite medir un determinado volumen, aunque sin mucha exactitud. Rojo de metilo: se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica. Micropipetas: es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Cloruro de Fierro: se utiliza como coagulante en el tratamiento de aguas y para potabilizar agua. También se usa para fabricar circuitos electrónicos para atacar el cobre de las placas.

Puntas para micropipetas: se utilizan para tomar una pequeña muestra de líquido o solución, utilizadas principalmente en investigación. -naftol (5%): La estructura del naftol es usada como ligando en la catalisis transición-metal para síntesis, particularmente de binalftol. Perillas: es un aparato que se utiliza en los laboratorios con el fin de succionar un líquido. Se suele utilizar para las pipetas y para los cuentagotas. Etanol: es un alcohol, lo que lo convierte en un producto químico inorgánico. El etanol (punto de ebullición en torno a los 78ºC) es el alcohol que contienen las bebidas alcohólicas.

1.4. Metodología. Secuencia experimental

  • Producción de Indol (MIO).
  1. Se inocula un tubo del medio MIO con el asa de punta.

2. transfiriere una porción del cultivo puro.

  1. se añaden 0,5 mL del reactivo de Kovac.
  2. se incuba a 37°C por 40 a 48 horas.
  3. se agita suavemente.
  4. Una reacción positiva es indicada por la aparición de un anillo rojo en la superficie del medio (capa alcohólica). Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.
  • Prueba de citrato.
  1. Inocular tubos de agar citrato de Simmons con un asa bacteriológica tratando de sembrar un inoculo pequeño.
  2. Si se usa agar inclinado sembrar por picadura.
  3. Incubar a 35-37°C durante 48 hrs.
  4. Color Azul prueba + Crecimiento visible prueba +.
  • Voges Proskauer.
  1. Inocular el caldo R.M.V.P. con el asa bacteriológica una asada de un cultivo puro.
  2. Incube a 37°C por 24 a 48 horas.
  3. A 1 mL de cultivo añada 12 gotas (± 0,6 mL) de a- naftol al 5% en etanol y 4 gotas (± 0,2 mL) de KOH al 40%
  4. agite y deje reposar por 5 a 10 minutos.
  5. La aparición de un color rosado constituye una reacción positiva indicadora de la presencia de acetoína, producto de la fermentación de la glucosa.
  • Pruebas con agar triple azúcar hierro (T.S.I) Inoculación.
  1. Con una asa bacteriológica se toma una colonia aislada.
  2. se siembra por picadura hasta unos 0,6 cm del fondo.
  3. Se retira la aguja siguiendo el mismo camino de entrada y sin volver a cargar el asa.
  4. se siembra en estría la superficie.
  5. Incubar a 35-37° C/18-24h. Resultados.
  6. Producción de ácido a partir de la glucosa: En la parte inferior del medio se produce un cambio de color rojo-naranja a amarillo (ácido).

2. Producción de gas a partir de la glucosa: Los gases producidos son el C02 y el H2, que se

aprecia por la aparición de burbujas en la parte inferior del medio, por una producción de grietas en su interior o incluso por una elevación del medio que se separa del fondo.

3. Producción de ácido a partir de la lactosa y/o sacarosa: hay un cambio de color a amarillo en

la parte superficial del medio, pero es imposible saber si el azúcar utilizado.

  1. Producción de sulfhídrico: Se manifiesta por un ennegrecimiento del medio en la línea de inoculación o sobre la capa superficial. En cultivos de bacterias altamente productoras de SH a veces llega a ennegrecer todo el medio.
  • Urea.
  1. Inocular en el caldo Urea con el asa bacteriológica con una asada de un cultivo puro.
  2. Incube a 37°C por 24 a 48 horas.
  3. Una reacción positiva (hidrólisis de la urea) es indicada por un cambio de color del amarillo (pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o más alcalino).

1.5. Cuestionario.

¿Qué valor tiene la interpretació n de las reacciones del I.M.Vi.C.? Como se dijo en el fundamento El IMViC es una prueba utilizada en biología para la identificación bacterias. Se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges- Proskauer y Citrato. El resultado de este test se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o - ) según el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método. Así por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es - +-+. Para E.coli es ++-- y para Klebsiella y Enterobacter es --++. ¿Qué implicaciones tienen las pruebas bioquímicas en la identificación de microorganismos? Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. ¿En qué consiste la identificación de los microorganismos en base a análisis moleculares? En contraste con las características fisiológicas y bioquímicas, la identificación molecular se basa en la composición constitutiva de los ácidos nucleicos más que en los productos de su expresión. Estos métodos moleculares se utilizan a menudo en asociación con la identificación microbiológica convencional.