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Producción de dextrano a escala laboratorio mediante microorganismos
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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Universidad Politécnica de Tlaxcala Ingeniería en Biotecnología Biotecnología Industrial Producción de dextrano a partir de Leuconostoc mesenteroides Fase l “Aislamiento de Leuconostoc mesenteroides a partir del kéfir de leche” Integrantes:
Grado y grupo: 9° “C” 10 de Julio de 2019 Introducción 4
- Objetivo general - Objetivos específicos - Revisión bibliográfica (Boldrini, 2009). Estos microorganismos simbióticos están constituidos principalmente por bifidobacterias, bacterias ácido lácticas (BAL) y acéticas (BAA), además de levaduras (Rodríguez et al., 2017). Dentro de las bacterias ácido lácticas registradas en el kéfir de leche, se encuentran bacterias del género Leuconostoc, y una de las más representativas dentro de este género es Leuconostoc mesenteroides. Leuconostoc mesenteroides es una bacteria Gram positiva perteneciente al grupo de las BAL (Cuervo et al., (2010), catalasa negativa, anaerobia facultativa, pueden ser alargados o elípticos y dispuestos en parejas o cadenas, heterofermentativas con una temperatura óptima de crecimiento de 20 a 30 °C, la cual puede aislarse de plantas, ensilados y leche (Escartin, 2017). Esta bacteria puede diferenciarse por diversas pruebas bioquímicas, entre las que se encuentra oxidasa, catalasa, utilización de citratos y prueba de hidróxido de potasio (Vega, 2012). Su crecimiento debe ser en medios con concentraciones altas de sacarosa, por lo que no crece en agar nutritivo y su medio de crecimiento por excelencia es Mayeux (Escartin, 2017). Esta bacteria es en particular de gran interés en industria láctea (en la manufactura del suero de la leche, mantequilla y queso) como cultivos iniciadores, ya que producen compuestos responsables del sabor como diacetilo o acetona (productos de la ruptura metabólica del citrato), en la fermentación de verduras como las coles (chucrut) y pepinillos en vinagre (Escartin, 2017). Por otra parte esta bacteria produce un polisacárido llamado dextrano, el cuales es utilizados en la industria de alimentos su propiedad de formar soluciones altamente viscosas como agente espesante o gelificante, texturizante y estabilizante en emulsiones como el helado, jarabes, mermeladas, jugos etc., (Vega, 2012).
Aislar a partir de una muestra de kéfir de leche a Leuconostoc mesenteroides para la producción del exopolisacárido dextrano para su posible uso en la elaboración de productos alimenticios.
✔ Identificar mediante tinción de Gram y pruebas bioquímicas a Leuconostoc mesenteroides. ✔ Realizar una cinética de crecimiento de L. mesenteroides. ✔ Conservar a L. mesenteroides por el método de congelación.
Kéfir Historia El Kéfir es la leche fermentada más antigua que existe. Su origen se sitúa en las montañas del Cáucaso, donde sus pueblos lo vienen consumiendo de forma habitual durante miles de año. Su historia se remonta a la antigüedad, al “ayrag”, bebida que preparaban los campesinos de las montañas del Norte del Cáucaso, dejando remansar la leche de sus animales en odres fabricados a partir de pieles de cabras que nunca se lavaban o limpiaban y que colgaban cerca de la puerta de la casa en el exterior o el interior, según la estación. Según se iba desarrollando la fermentación se iba añadiendo leche fresca para reemplazar al “ayrag” que se iba consumiendo. En cierto momento se observó que la corteza esponjosa y blanquecina de la pared interior de la piel era capaz, si se le añadía leche, de dar una bebida similar (sino mejor), al ayrag original. Esta bebida fermentada se denominó Kéfir (Zittlau, 2003). Definición El kéfir ha sido considerado tradicionalmente como una bebida láctea fermentada, refrescante y promotora de buena salud. Los granos de kéfir están constituidos por un consorcio de microorganismos, embebidos en una matriz de exopolisacáridos, proteínas y lípidos formando pequeños gránulos irregulares, semiduros y de color blanco-amarillento. (Rodríguez et al., 2017). Los nódulos están compuestos por una asociación benéfica de bacterias lácticas homo y heterofermentativas, levaduras fermentadoras y no fermentadoras de lactosa y bacterias ácido acética (Boldrini, 2009). Figura 1. Granos de kéfir de leche Fuente: Boldrini (2009)
Generalidades Desde el comienzo de la humanidad las BAL han sido empleadas para la fabricación y conservación de alimentos. Algunas BAL tienen la capacidad de sintetizar polisacáridos extracelulares EPS. Estás forman parte de la microbiota natural de muchos alimentos y no existe ninguna indicación de que representen un riesgo para la salud del consumidor, por lo tanto las BAL como alguno de sus metabolitos son considerados como GRAS. Características generales de las BAL Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos representadas por varios géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas en común. En general las BAL son cocos y bacilos Gram positivos, no esporulados, inmóviles, anaerobios, microaerofílicos o aerotolerantes; oxidasa, catalasa y bencidina negativas y producen ácido láctico como el único o principal producto de la fermentación de carbohidratos (Ramírez et al., 2011). La mayoría de las BAL son mesofílicas, aunque algunas son capaces de crecer a temperaturas de 5°C y otras a 45°C. Toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de pH más bajos que el resto de las bacterias (algunas pueden crecer a pH 3, otras entre 6 y 9, pero la mayoría crece a un pH entre 4 y 4.5) por lo que pueden desplazarlas de los hábitats que colonizan (Escartin, 2017). Clasificación y géneros representativos de las BAL El grupo de las BAL está comprendido por aproximadamente 20 géneros, de los cuales 12 géneros son los más representativos de este grupo. Aunque 14 el grupo está definido con poca exactitud, todos los representantes comparten las propiedades de producir ácido láctico a partir de las hexosas (Davidson y col., 1995; Jay. 2000; Axelsson, 2004). Tabla 2. Principales géneros representativos de las bacterias ácido lácticas Género Leuconostoc
El género Leuconostoc, son cocos Gram positivos, catalasa negativos, anaerobios facultativos, pueden ser alargados o elípticos y dispuestos en parejas o cadenas, heterofermentativos, temperatura óptima de crecimiento de 20 a 30 °C. Pueden aislarse de plantas, ensilados y leche. Muy utilizados en la industria láctea (en la manufactura del suero de la leche, mantequilla y queso) como cultivos iniciadores, ya que producen compuestos responsables del sabor como diacetilo o acetona (productos de la ruptura metabólica del citrato), en la fermentación de verduras como las coles (chucrut) y pepinillos en vinagre. Los Leuconostoc están implicados en el deterioro de los alimentos y toleran concentraciones elevadas de azúcar, lo que facilita su multiplicación en el jarabe, constituyendo un importante problema en las refinerías de azúcar (Prescott y col., 1999; Jay, 2000; Madigan y col., 2004). Las principales características metabólicas del género Leuconostoc son: ❖ Producir diacetilo y otras sustancias aromáticas. ❖ Su capacidad de iniciar la fermentación en productos vegetales con más rapidez que otras bacterias lácticas u otros organismos y de producir suficiente ácido como para inhibir el crecimiento de las bacterias no lácticas. ❖ La gran tolerancia de Leuconostoc. mesenteroides para concentraciones azucaradas de hasta 55 a 60%, lo que permite crecer en jarabes, caramelo líquido, crema de helados, etc. ❖ Producción de cantidades considerables de dióxido de carbono a partir de los azúcares, produciendo ojos en ciertos casos, la alteración de alimentos de gran contenido azucarado (jarabes, cremas, etc.) y la fermentación de algunas clases de pan. ❖ Producción de gran cantidad de EPS en medios que contienen sacarosa, lo que es deseable en la producción de dextrano. Figura 2. Leuconostoc mesenteroides creciendo en agar Mayeux. Fuente: Cuervo et al., (2010). Cinética de crecimiento microbiano
pared celular tiene una composición química diferente (micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólicos). Las muestras útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las bacterias Gram positivas se observan de color azul oscuro a morado, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo. Prueba de catalasa La catalasa es una enzima hemoproteica, que se caracteriza por poseer una estructura tetramétrica, en la cual cada subunidad contiene un grupo Hem (Fe+3). Está presente en la mayoría de las bacterias aerobias estrictas, facultativas y anaerobias aerotolerantes. La catalasa manifiesta actividad de peroxidasa, cataliza la oxidación de sustratos acoplada a la reducción de peróxido de hidrógeno, para formar agua y oxígeno molecular. En la prueba de catalasa la reacción se efectúa con dos moléculas de peróxido de hidrógeno, una de las cuales actúa como sustrato reducido y la otra como donador de átomos de hidrógeno. El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrógeno al 30%. Hay diferentes técnicas para realizar la prueba la más común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reacción positiva débil aunque son las menos.
Material y reactivos
Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de agar inclinado con Citrato de Simmons, haciendo uso de la técnica de siembra en lengüeta. Incubar a 37ºC de 48 a 72 horas con los tubos destapados totalmente. Visualizar y anotar el resultado. Resultado e interpretación: Si el medio de cultivo aparece de color azul se dice que es citrato positivo, y si aparece de color verde, original del medio, es negativo.
Aislamiento de Leuconostoc mesenteroides
Identificación de L. mesenteroides Figura 3. Vista a 100x de L. mesenteroides aislada del kéfir de leche. Tal como se muestra en la figura 4, L. mesenteroides es una bacteria Gram positiva, inmóvil en forma de cocos, la cual se encuentra en cadenas cortas, según Escartin (2017). La prueba de catalasa y oxidasa fueron negativas, tal como lo muestra la tabla…. Este resultado es comparado con el descrito por Cuervo et al. (2010), en el cual registra resultados negativos estas pruebas bioquímicas en sus datos experimentales para tres subespecies de Leuconostoc mesenteroides crecidas en medio Mayeux_._ De acuerdo con Escartin (2017), la catalasa es un enzima que degrada el peróxido de hidrógeno (H2O2) para realizar esta función las BAL necesitan de un grupo porfirinico (citocromos), el cual las BAL son incapaces de sintetizar y, por tanto, este tipo de bacterias no posee dicha enzima, lo que permite la identificación del grupo catalasa negativa. Cinética de crecimiento En la figura 4 se muestran los resultados de la cinética de crecimiento celular de L. mesenteroides contra el tiempo, para un medio de cultivo en lote.
Figura 4. Crecimiento de L. mesenteroides en un cultivo por lote Se observó una fase de adaptación de 3 horas. Transcurrida las 3 horas de adaptación, se inició un crecimiento exponencial de la hora 3 hasta las 15 horas, este resultado es comparable con los descritos en el trabajo de Escartin (2017), quien encontró un crecimiento similar utilizando un tiempo de residencia de 36 horas, donde la fase de adaptación fue de 3 horas en. Posterior a estas 15 horas L. mesenteroides comenzó a entrar en fase estacionaria. En la figura 2 se observa la cinética de crecimiento de L. mesenteroides, de acuerdo con Escartin (2017), la cinética de crecimiento de L. mesenteroides comprende un lapso de tiempo de 36 horas, alcanzando la finalización de la fase exponencial e inicio de la fase estacionaria en la hora 15.
Se realizó el aislamiento de L. mesenteroides a partir de una muestra de kéfir de leche, identificando la cepa por tinción de Gram y diferentes pruebas bioquímicas. Se conservó por el método de congelación y se realizó su cinética de crecimiento mediante la técnica de espectrofotometría.
Muñoz Argüelles Brithany El uso de consorcios microbianos en la industria genera un menor costo de producción. En el caso del kéfir por ser derivado de la leche contiene bastantes microorganismos del tipo bacterias ácido-
✔ Bergmaier D., C. Champagne P., C. Lacroix, C.
✔ Boldrini, G. (2009). Consumo de kéfir y frecuencia evacuatoria (Tesis de pregrado). Universidad FASTA, Buenos Aires, Argentina. ✔ Cuervo, R., (05 de noviembre de 2010). Aislamiento y control microbiológico de Leuconostoc mesenteroides. Scielo, (8-2), pp. 31-40. ✔ Davidson B.E., R.M Llanos., M.R. Cancilla., N.CRedman., A.J Hillier. 1995. Current research on the genetics of latica cid production in latica cid bacteria. Int Dairy Journal. 5:763-784. ✔ De Vuyst. L., F. Vanderveken., S. Van de Ven., B. Degeest. 1998. Production by and isolation of exopolysaccharides from Streptococcus thermophilus grown in a milk médium and evidence for their growth associated biosynthesis. J. Appl. microbial. 84: 1059- ✔ Degeest, B., De Vuyst, L. 1999. Indication that the nitrogen source influences both amount and size of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus LY03 and modelling of the bacterial growth and exopolysaccharide production in a complex medium. Applied and Environmental Microbiology 65, 28632870. ✔ Escartin, A. (2017). Producción de un exopolisacárido por la cepa de Leuconostoc ssp mesenteroides BL-UV04 en un medio de cultivo enriquecido con piloncillo mediante un sistema en lote y lote alimentado (Tesis de posgrado). Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz. ✔ Jay J.M. 2000. Microobiologia moderna de los alimentos. 4 Ed. Acribia. Zaragoza, España. Pp. 19-27, 106-108, 441-475. ✔ Mandingan M.T., J.M Martinko., J. Parker. 2004. Brock. Biologia de los microorganismos. 10 ed. Prentice Hall. Madrid, España. Pp. 122, 352, 400-402,991. ✔ Prescoot L.M., J.P Harley., D.A. Klein. 1999. Microbiologia. 4 ed., McGraw-Hill Interamericana Zaragoza, España. Pp 515-518.
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