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PRODUCCIÓN DE INSULINA EN MEDIO DE CULTIVO CON E. COLI
GRUPO N 2
1.INTRODUCCIÓN
Insulina: Es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y secretada por las células beta de los islotes de Langerhans de la glándula denominada páncreas. La insulina ayuda a que los azúcares obtenidos a partir del alimento que ingerimos lleguen a las células del organismo para suministrar energía. Su déficit provoca diabetes mellitus y su exceso provoca hiperinsulinismo con hipoglucemia. La insulina es una hormona "anabólica" por excelencia: permite disponer a las células del aporte necesario de glucosa para los procesos de síntesis con gasto de energía. De esta manera, mediante glucólisis y respiración celular se obtendrá la energía necesaria en forma de ATP. Su función es la de favorecer la incorporación de glucosa de la sangre hacia las células.
Escherichia Coli: La Escherichia coli (E. coli) es un bacilo gramnegativo de la familia de las enterobacterias que se encuentra en el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente.
- ELECCIÓN DE MEDIO DE CULTIVO Escherichia coli es la especie más empleada y estudiada tanto genética como fisiológicamente. Entre las ventajas que brinda este microorganismo como hospedero están: rápida generación de biomasa (elevada velocidad de crecimiento), fácil manipulación genética, no posee requerimientos costosos asociados a medios de cultivo o equipamiento, alta eficiencia en la incorporación de material genético foráneo, gran variedad de vectores de expresión y variantes mutantes. El cultivo se hizo con cepas de Escherichia coli BL21(DE3). Medio LB (Caldo de Lisogenia ) , con 20 g/l de polvo de medio LB , fue usado para la preparación del primer cultivo de siembra. La segunda siembra y el cultivo principal usaron un medio químicamente definido (Riesenberg et Al. 1991) (con 10 g/l de glucosa para el segundo cultivo de siembra y 30 g/l de glucosa para el cultivo principal). El medio de cultivo fue autoclavado.(The stock solutions for 14 l of the feeding solution (glucose, MgSO4 and trace elements plus EDTA) were sterilized separately before mixing. The stock solution of glucose was sterilized for 60 min at 121°C and the stock solutions of MgSO4 and trace elements plus EDTA were sterilized each for 30 min at 121°C.) La glucosa fue agregada por separado, después autoclavada, como una solución stock. Durante el cultivo una solución de alimentación fue suministrada para prolongar la fase de crecimiento con 770 g/l de glucosa y 19,7 g/l de MgSO4 · 7H2O. LB contiene: 10 g de Triptona/L, 5 g de Extracto de levadura/L y 10 g de Cloruro de Sodio/L Etapas de cultivo Como un primer paso, alícuotas de un Banco de Células de Trabajo fueron distribuidas en placas de Petri con LB-Agar e incubadas por 24 h a 37°C. El primer cultivo de siembra fue preparado en un frasco Erlenmeyer de 100 ml, lleno con 20 ml de medio LB
Esquema de producción de la insulina Para realizar los marcadores de forma radiactiva o con un marcador fluorescente en el ADN desnaturalizado de las bacterias se puede efectuar con variaciones de temperatura o con productos químicos. El plásmido bacteriano más ampliamente usado es el pBR322. Éste posee un origen de replicación en E. coli multicopiativo o relajado, un tamaño pequeño y posee 20 sitios de corte únicos para enzimas de restricción de los cuales 6 se encuentran dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, otros dos dentro de su promotor y tres dentro del gen de resistencia a la ampicilina. De modo que las células de E. Coli que porten este plásmido serán resistentes a ambos antibióticos, mientras que las que porten un plásmido recombinante serán sensibles a aquel antibiótico en cuyo gen se ha producido la inserción de DNA exógeno y resistentes al otro. Así resulta sencilla la selección de bacterias transformadas con el plásmido recombinante.
- DISEÑO DEL BIORREACTOR. El BIOSTAT® A es un biorreactor/fermentador de nivel básico diseñado para un control sencillo del crecimiento celular y la fermentación. Presenta los siguientes accesorios: ● para control de temperatura unidad de refrigeración, dedo de refrigeración y manta de calentamiento ● para agitación – láminas de disco 2 × 6 (turbina rushton) ● para gaseificación – una inserción de anillo ● una caja deflectora El recipiente se llenó con 3,5 L de medio definido químicamente y la densidad celular inicial era de 0,25. Durante la fase de sistema cerrado y fed batch la densidad celular aumentó de modo exponencial. La tendencia de la proliferación fue inferior en la fase fed batch debido al μ controlado. En el fin de la fase batch una OD600 de 35 (peso celular seco = 13,6 g/l) fue medida. Esto corresponde a una YX/S de 0,45 gDCW/gglucosa, e indica un consumo de sustrato esperado y, por consiguiente, óptimas condiciones de crecimiento. Una densidad celular final de OD600 = 191 (DCW = 72 g/l) fue alcanzada. La tasa de crecimiento específica fue controlada para μ = 0,15 h-1 durante la fase fed batch. Además, problemas de refrigeración debido al aumento de la generación de calor pueden ocurrir, especialmente en mayores escalas de cultivo. Durante el cultivo el pH fue controlado a 6,8 a través de la adición de solución de amoníaco 20%. Los niveles de oxígeno disuelto fueron controlados automáticamente para un 20% manteniendo la
velocidad del agitador constante a 800 rpm (velocidad de punta = 2,7 m/s) y enriqueciendo el gas aspergido con oxígeno puro.
Las bioseparaciones para la producción de insulina por el método de la proin-sulina intracelular, constan de las etapas de recuperación, concentración, purificación y acabado. Recuperación Cosecha celular: El primer paso de la ruta de bioseparación consiste en la recuperación de las células por centrifugación. El caldo concentrado se envía a un tanque de almacenamiento que es la interfase entre las operaciones previas y las bioseparaciones. Este paso se realiza por medio de 3 centrífugas de disco operando en paralelo. El lodo recuperado se diluye con una solución de EDTA en buffer TRIS en el tanque de mezclado para facilitar la separación de los CI de los restos celulares. Rompimiento celular y recuperación de CI: En este caso, el producto es intracelular y se requiere el rompimiento de las células por medio de homogeneizadores de alta presión HG-101 para liberar los CI. El homogeneizado obtenido es centrifugado para recuperar los CI. Los CI se recuperan en la fase pesada y la mayoría de los restos celulares quedan en la fase ligera, debido a la mayor densidad y tamaño de los CI. La fase pesada es mezclada con una solución del detergente Triton-X100 y recentrifugada en las centrífugas DS-101. Este lavado facilita la separación de los CI de proteínas solubles y restos celulares. Solubilización de CI: La suspensión que contiene los CI se transfiere a un reactor recubierto de vidrio V-103, donde se hace reaccionar con urea y 2-mercaptoetanol. La urea es un agente caotrópico que disuelve las proteínas desnaturalizadas de los CI y el 2- mercaptoetanol es un agente que reduce los enlaces disulfuro. Al final de la reacción de solubilización, se reemplaza la urea y el 2-mercaptoetanol por agua para inyección (API) y se concentra la solución en la unidad de diafiltración DF-101. Las partículas finas remanentes se eliminan en el filtro DE-101 para evitar problemas en los equipos de cromatografía. Rompimiento con CNBr: La proteína quimérica Trp-LE’-Met-proinsuli-na es fragmentada utilizando bromuro de cianógeno (CNBr) en una solución de ácido fórmico en el reactor V-103, obteniéndose la proinsulina desnaturalizada y la secuencia Trp-LE’-Met. La proinsulina se obtiene intacta ya que no contiene residuos de metionina ni triptófano que son los sitios donde hidroliza el CNBr. Al final de esta reacción, el ácido fórmico, el CNBr que no reaccionó y el gas cianuro producido se eliminan en un evaporador rotatorio al vacío. El gas cianuro es tóxico y es necesario eliminarlo en un adsorbedor con una solución de hipoclorito. Sulfitolisis de la proinsulina desnaturalizada: se efectúa en el reactor V-105, adicionando hidrocloruro de guanidina (GuHCl), bicarbona-to de amonio (NH4HCO3), sulfito de sodio (Na2SO3) y tetrationato de sodio(Na2S4O6). Esta operación se utiliza para desdoblar la proinsulina, romper los enlaces disulfuros y adicionar grupos sulfito (SO−23) a los residuos de azufre de las cisteínas. Este paso es necesario debido a que la proinsulina puede no estar correctamente plegada desde su síntesis o porque el tratamiento con CNBr rompe enlaces disulfuro existentes. El GuHCl previene el replegamiento de la molécula y el entreplegamiento entre distintas moléculas. Al final de la sulfitolisis la solución es diafiltrada con API en la unidad DF-101. Concentración Cromatografía de intercambio iónico: La proinsulina (S-SO3) obtenida en el paso anterior, se hace pasar por tres columnas de intercambio catiónico de S-sefarosa
(sulfopropil) C-101operando en paralelo. En la elución de la columna se utiliza una solución de urea para prevenir el replegamiento. La operación permite concentrar la solución y eliminar proteínas contaminantes. Replegamiento: Esta operación permite la remoción de los grupos sulfito (SO−23), la formación de los enlaces disulfuro y el plegamiento correcto de la proinsulina en su forma nativa. Se realiza en el reactor V-107 e involucra una reducción con una solución diluida mercaptoetanol (MrEtOH) que facilita la formación de los enlaces disulfuro y evita entre- plegamiento. Al final del paso de replegamiento el MrEtOH se sustituye por API y se concentra la solución en la unidad de diafiltración DF-102. La solución de proinsulina obtenida se hace pasar por una columna de cromatografía de interacción hidrofófica C- 102 (HIC de sus siglas en inglés), para eliminar gran parte de las proteínas contaminantes. Conversión enzimática: La remoción de la cadena C de la proinsulina que conecta las cadenas A y B, se realiza enzimáticamente utilizando tripsina y carboxipeptidasa B en el reactor V-108. La tripsina rompe en el extremo carboxi entre residuos lisina y arginina. La carboxipeptidasa B remueve grupos aminoácidos terminales. La solución obtenida se lava con API y se concentra 4 veces en la unidad de diafiltración DF-102. Purificación Cromatografía de intercambio iónico: La insulina se purifica mediante una secuencia cromatográfica multimodal basada en diferencias de carga, hidro-fobicidad y tamaño entre la insulina y sus contaminantes. El primer paso de purificación de la solución que contiene la insulina se realiza en una columnas de intercambio catiónico de S-sefarosa C-103. En este paso se elimina gran parte de la proinsulina no convertida y de las proteínas contaminantes. Al final de la operación se lava la solución para eliminar el buffer de elución con API y se concentra la solución dos veces en la unidad de diafiltración DF-103. Cromatografía de fase reversa: La purificación continúa utilizando la columna C- 104 de cromatografía de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC) de ácido fenil borónico (PBA). Mediante la operación se logra eliminar las diver-sas proinsulinas y el resto de las proteínas contaminantes. La solución obtenida se lava con API y se concentra 2 veces en la unidad de diafiltración DF-103. Cromatografía de filtración en gel: La purificación se completa en una columna de filtración en gel C-105 en donde la insulina se obtiene prácticamente pura. Al final de la operación la solución se lava con API y se concentra 10 veces en la unidad de diafiltración DF-104. Acabado Cristalización: La solución obtenida se alimenta a un cristalizador en- chaquetado V-111, donde se mezcla con acetato de amonio (CH3-COO-NH4) y cloruro de cinc (ZnCl2). La insulina cristaliza como Zn2-Insulina6. Al final de la cristalización, los cristales son recuperados en una centrífuga de canasta BCF-101. Secado: Finalmente, los cristales se secan en el liofilizador FDR-101. El rendimiento global del bioproceso es del 32 % y la pureza de la insulina obtenida varía entre 99.
