Complemento de introducción a la Biotecnología
Integrantes: Barcos Eliana, Romero Eduardo, Ponce Carolina,
Marco Federico, Rodriguez Tamara
Materia: Intriducción a la Biotecnogía (año 2016)
Tema: Producción de proteína recombinante
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produccion de proteina recombinante mediante tecnicas de secuenciado de ADN, cromatografia, centrifugacion, Exámenes de Biotecnología
obtención de una proteína recombinante como posible terapia contra afecciones autoinmunes, donde se realizará un procedimiento para producir la proteína de interes, utilazando bacterias como la E. coli para su producción y posteriormente purificarla y asi poder hacer estudios in vivo en ratones BALBA/C. Por ello se implementaran diversas tecnica para obtención de la misma, para obtener la secuencia de ADN requerido utilizamos cromatografía líquida o centrifugación, luego utilizamos un vector
Tipo: Exámenes
2019/2020
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Complemento de introducción a la Biotecnología
Integrantes: Barcos Eliana, Romero Eduardo, Ponce Carolina,
Marco Federico, Rodriguez Tamara
Materia: Intriducción a la Biotecnogía (año 2016)
Tema: Producción de proteína recombinante
Resumen: En este informe hablaremos sobre la obtención de una proteína recombinante como posible terapia contra afecciones autoinmunes, donde se realizará un procedimiento para producir la proteína de interes, utilazando bacterias como la E. coli para su producción y posteriormente purificarla y asi poder hacer estudios in vivo en ratones BALBA/C. Por ello se implementaran diversas tecnica para obtención de la misma, para obtener la secuencia de ADN requerido utilizamos cromatografía líquida o centrifugación, luego utilizamos un vector para portar el ADN de la proteína y clonarlo, luego del clonado purificamos la proteína obtenida de las bacterias con un metodo de cromatografía, la que utilizamos fué una electroforsis en gel de agarosa. Introducción: Se sabe desde hace años de una proteína capaz de matar linfositos T, entonces se propone la utilización de dicha proteína como posible terapia contra afecciones autoinmunes. Para ello realizamos la producción de la proteína para poder hacer estudios in vivo en modelos de ratones BALB/C. Se diseña todo el proceso desde el clonado molecular hasta la purificación de la proteína para ahorrar en costos de producción y optimizar los tiempos. Esto se da en un marco de investigación doctoral, como investigadores sabemos que la producción de proteínas recombinates es un procedimiento muy utilizado ya que permite clonar por medio de bacterias en este caso E.coli a través de un vector plamidico como el pETBlue-1, que para nuestra investigación es un vector que nos permite hibridizarlo con el ADN de la proteína recombinate y asi poder clonarla. Metodología: Antes de realizar la producción de nuestra proteína, se realizó una lista con las caracteristicas de la misma, las cueles son: Peso molecular 19,8kDa. Forma trímeros de 59,4kDa mediante la unión por puentes disulfuro. Interaccionan con receptores del sistema inmune a través de galactosa presente en las ramificaciones de glicanos presentes en los mismos. Es muy sensible a la oxidación, por lo que se la debe manipular en ambientes reductores y pH fisiológico. No es una glicoproteína La secuencia nucleotídica tiene 540pb y un dominio altamente conservado de reconocimiento de galactosa. En base a todos estos datos fué que desarrollamos un procedimiento para la obtención de una protenía recombinada capaz de ser utilizada como posible terapia contra afecciones autoinmunes. Como primer paso elegimos el sistema biológico adecuado para el clonado de la proteína de interes. El sistema biológico utilizado para la producción de la proteína de interés son bacterias. En este caso, escogimos la especie Escherichia Coli debido a que es fácil de cultivar y de modificar genéticamente. A su vez, a nivel de síntesis de proteínas, es un trabajador
separandolo de los demas restos celulares. Concentramos la muestra de ADN plasmidico realizando precipitaciones alcoholicas, en este caso el agregado de alcohol causa un cambio en la polaridad del medio y si se mantiene a baja temperatura la muestra el ADN plasmidico se hace insoluble, de esta manera es posible recuperlo y concentrarlo realizando centrifucaciones a alta velocidad. Por ultimo vamos a resupender el ADN plasmidico en buffer adecuado y asi lo temos listo para ser usado siguendo los protocolos de biología molecular. Para la purificación de la proteína utilizo la técnica de cromatografía en columna que por medio de un colorante podremos obtener un volumen adecuado con concentraciones ideales de proteínas para poder trabajar con ella. Durante el monitoreo de la elución de la proteína medido por la técnica de Bradford detectamos en una de las tres columnas un cambio de color que no corresponde a la proteína de interés, sabemos que el color de nuestra proteína será azul sin embargo durante este procedimiento vemos un color amarillo en una de las columnas los cual nos indica que un hidrocarburo clivado por la enzima absorbe luz UV a 420nm podemos deducir entonces que esa columna no posee la proteína de interés y las otras dos sí. Luego de medir la absorbancia podemos calcular la concentración de la proteína obtenida. Resultados y discusión: Conclusiones: Gracias a los métodos aplicados pudimos obtener nuestra proteína recombinante en cantidad necesaria para llevar a acabo nuestras pruebas y así poder implantar los protocolos de biología molecular correspondiente, es decir para realizar las primeras pruebas en ratones BALB/C. A pesar de detectar una muestra que no correspondía con la proteína los ensayos se pudieron ajustar y así obtener mejores resultados sin generar costos.