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TEMA 3: Métodos para el análisis de proteínas
3.1. Cuantificación de proteínas totales. 3.2. Técnicas de separación de proteínas. Análisis de proteínas específicas.
INTRODUCCIÓN
A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas técnicas que nos permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido proteico de las muestras biológicas haciendo especial hincapié en el estudio de las proteínas plasmáticas. Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL). Si nos centramos en las proteínas plasmáticas, podemos diferenciar:
- Proteínas plasma-específicas: componentes habituales del plasma.
- Proteínas no plasma-específicas: aquellas que aparecen en el plasma por rotura de otras células.
Las proteínas plasma-específicas (albúmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hígado, pero también en: células plasmáticas, ganglios linfáticos, bazo y médula ósea.
En caso de enfermedad, tanto la concentración total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. Así, la determinación de las proteínas totales sirve para el diagnóstico de:
- Afecciones hepáticas
- Afecciones de la médula ósea
- Otras afecciones del metabolismo o nutricionales
3.1. Cuantificación de proteínas totales
Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes:
- Método del Biuret En solución alcalina el Cu+2^ reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución de albúmina.
Proteína + Cu+2^ Complejo Cu-Proteína (púrpura)
Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coágulo o el plasma de las células antes de 3h. Si el paciente está acostado durante la extracción el resultado será menor.
- Método de Lowry Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en dos reacciones:
- Reacción de Biuret
- Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2^ , reducen el reactivo de Folin generando un color azul. Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina.
- Turbidimetría Medición de la turbidez resultante de la precipitación de proteínas
- Absorción en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromáticos de triptófano y tirosina.
- Métodos de unión a colorantes
NOTA: para semicuantificar la concentración de proteínas en orina se utilizan tiras reactivas.
3.2. Técnicas de separación y análisis de las proteínas
La proporción de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran número de enfermedades lo que conlleva que, la cuantificación de las mismas sea de valor considerable en el diagnóstico clínico.
Los procedimientos más utilizados actualmente en el laboratorio clínico para el estudio de las proteínas son los siguientes:
- Turbidimetría y nefelometría
- Inmunodifusión
- Electroforesis
- Inmunoelectroforesis
- Inmunoelectroforesis en cohete
- Inmunofijación
- Cromatografía
1.- TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe.
La dispersión de la luz depende de: la longitud de onda de la luz (?), del tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea.
La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.
- Epítopo o determinante antigénico: lugar del antígeno que reconoce y se une al anticuerpo.
- Anticuerpo (Ac): grupo de proteínas llamadas inmunoglobulinas, producidas por linfocitos B y su progenie (células plasmáticas) que se combinan específicamente con los antígenos.
Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese antígeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rápidamente pero, existe una segunda fase de crecimiento de complejos más lenta y, es precisamente en ésta fase en la que aparece la dispersión de la luz. Así, en la inmunoturbidimetría e inmunonefelometría se mide la dispersión de la luz provocada por los compeljos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de látex para aumentar el tamaño de los complejos (inmunoanálisis potenciados).
2.- INMUNODIFUSIÓN
La inmunodifusión se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios semisólidos (generalmente de agarosa). La formación de inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH, temperatura, fuerza iónica del medio, características propias del Ac como afinidad y avidez y, la más importante, la concentración relativa de Ag y Ac. La zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. La inmunodifusión puede ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac). Para visualizar el resultado de la inmunodifusión, una vez terminada la difusión se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (ej. negro amido o azul brillante de Coomassie). La inmunodifusión se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. Entre otras modalidades podemos hablar de:
a) Inmunodifusión radial : en este caso se añade un antisuero específico a la agarosa que, a su vez , se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de proteínas y problemas (antígenos). El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. Em la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación
a) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony : se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de la banda se determinan según la concentración del antígeno y del anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente.
Inconvenientes de la inmunodifusión:
- Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag.
- Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez que las de gran tamaño y conforme la migración continúa el precipitado puede redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de concentración de Ag o Ac en el gel.
- Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es más grueso o espeso.
3. ELECTROFORESIS
Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico).
Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas, las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (cátodo).
Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa) constituyentes de la proteínas, y por tanto las proteínas, son compuestos anfóteros que se comportan como ácidos
- Separación electroforética mediante un campo eléctrico
- Fijación de las proteínas sobre el soporte
- Revelado de las proteínas para identificar su presencia y separación. Se realiza mediante colorantes ácidos, negro amido, rojo Ponceau... que se fijan sobre las funciones básicas de las proteínas. El exceso de colorante se arrastra con mezclas acético -agua, o metanol-acético, según el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elución del colorante fijado a las proteínas.
- Cuantificación de las fracciones electroforéticas mediante fotómetros especiales (densitómetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a diferentes distancias del punto de aplicación, y con ello la representación gráfica de la separación (proteinograma: gráfica que representa las fracciones proteícas del suero sanguíneo).
Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo electroforético es de “acetato de celulosa” las principales fracciones proteícas son
- La fracción de albúmina (aprox. 64.5%): la que más migra respecto al punto de aplicación de la muestra (cátodo)
- Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1 (a-1 globulinas, aprox. 3.6%), alfa 2 (a-2 globulinas, aprox. 6.5%), beta (ß-globulinas, aprox. 12.6%), y gamma (? globulinas, inmunoglobulinas o anticuerpos, aprox. 7.9%, es la banda que menos se desplaza y en sueros no patológicos es la banda más ancha).
El fibrinógeno aparece entre las ß y? globulinas cuando la muestra utilizada es plasma no así en el suero (se ha co nsumido en la coagulación).
Cuando el soporte es gel de agarosa las ß-globulinas, se dividen en: ß-1 y ß-2.
Es muy importante tener en cuenta que cada fracción está formada por un conjunto de proteínas con una movilidad electroforética semejante aunque muy distintas en cuanto a su estructura y función. Además, excepto la albúmina, el resto de las fracciones corresponden a grupos de proteínas, por ello , aunque el resultado de la fracción sea normal, puede existir variación porcentual en sus componentes. Conviene corroborar los resultados del proteinograma con ensayos inmunológicos más específicos como la inmunodifusión radial o la inmunoelectroforesis.
4. INMUNOELECTROFORESIS
La inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente eléctrica para separar las proteínas de la muestra. Esta técnica se realiza en dos fases:
- Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de su carga.
- Aplicación de un antisuero, mono o poliespecífico, en un surco paralelo a la dirección del campo eléctrico. El o los anticuerpos
6. INMUNOFIJACIÓN
La inmunofijación consiste en la separación electroforética de las proteínas de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero. La unión Ag-Ac da lugar a la formación de bandas de precipitación visulalizadas tras lavar y teñir. Es una técnica muy rápida que se utiliza especialmente en le detección de bandas oligoclonales en líquido cefalorraquídeo.
Preguntas de revisión
- Si pretendiera cuantificar la concentración de proteínas en una muestra de suero ¿Qué método emplearía?
- Describa el fundamento del método anterior
- ¿Sabría idear un protocolo experimental para llevar a cabo dicho método?
- ¿Sería necesario preparar algún blanco? Razone su respuesta
- Un paciente con un mieloma: a) ¿Tendría hiper o hipoproteinemia? b) Si quisiera identificar la inmunoglobulina que aparece alterada ¿qué técnica podría utilizar? c) ¿Y si quisiera cuantificarla?
- ¿Podría utilizar la espectrofotometría con luz U.V. para cuantificar proteínas? Conteste razonadamente.
- La nefelometría difiere de la turbidimetría en: a) Mide el índice de refracción b) Ángulo de medida de la luz dispersa c) Tiene menor sensibilidad d) Se pueden medir partículas de bajo peso molecular e) La solución no necesita ser homogénea
- La nefelometría mide: a) La luz dispersada b) La luz transmitida c) La disminución de la luz transmitida d) La disminución de la luz dispersada e) La luz reflejada
- La turbidimetría mide a) La luz dispersada b) La luz transmitida c) La disminución de la luz transmitida d) La disminución de la luz dispersada e) La luz reflejada
- Conteste razonadamente verdadero o falso a las siguientes afirmaciones de las medidas nefelométricas a) Su principal aplicación es en la medida de reacciones Ag-Ac b) Trabajan con medidas en distintas zonas del espectro. c) Se hacen en ángulos de 15 a 90º respecto a la luz incidente.
- La turbidimetría se puede medir: a) En turbidímetros especiales. b) En aparatos con un monocromador de turbidez. c) En aparatos con un detector especial para la luz dispersa. d) En cualquier espectrofotómetro o analizador de química clínica. e) En aparatos con cubetas especiales
- El ángulo de medida de la luz dispersa en turbidimetría es: a) 0 o b) 10 o c) 15 a 90o d) 90 o e) Cualquiera
- El ángulo de medida de la luz dispersa en nefelometría es: a) 0º b) 10º c) 15 a 90º d) 90º e) Cualquiera
- La longitud de onda que se emplea en las medidas de luz dispersa: a) Debe ser tal que no se absorba luz por los componentes del suero. b) Debe ser lo menor posible c) Deber ser lo mayor posible
- La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa ¿Por qué?
16 ¿Cuál cree que es el principal inconveniente de las técnicas inmunológicas? a) Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac se encuentren dentro de la zona de equivalencia b) Son téc nicas poco sensibles c) Son técnicas poco específicas
- La inmunodifusión doble es una técnica cualitativa o semicuantitativa ¿por qué?
- En un campo eléctrico, una molécula cargada negativamente migra hacia el: a) Ánodo b) Cátodo c) Polo negativo d) Polo positivo e) a y d
- ¿Qué factores afectan a la movilidad de una partícula en el seno de un campo eléctrico) a) pH del tampón b) Fuerza iónica del tampón. a) Tamaño y forma de la partícula. b) Potencial del campo. c) Todos
- El punto isoeléctrico es: a) El pH al cual una partícula no se mueve b) El pH al cual una partícula migra al ánodo c) El pH al que la carga neta de la partícula es cero. d) a y c
