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METODOS DE SEPARACiÓN Y PURiFiCACiÓN DE PROTEÍNAS. tipos: Según su superficie. Incluye características como la distribución de la carga y de la superficie de las cadenas laterales de aminoácidos hidrófobos. Métodos utilizados: Dependen de la diferencia de solubilidad, principalmente precipitación o solubilización mediante manipulación del disolvente. El solvente es principalmete agua+buffer. Cromatografía hidrófoba, cromatografía de inmunoafinidad. Según tamaño y forma. Métodos utilizados: Cromatografía de filtración en gel donde se utilizan proteínas nativas y electroforéticos que involucran la separación de polipéptidos disociados y desnaturalizados. Según su carga neta. La carga neta depende del pH, positiva a un pH muy bajo, negativa a un pH alto y cero en pI. Rango de la mayoría de proteínas en pH de 6.0-9.0 donde esta el estado más cargado. Métodos utilizados: Los intercambiados de iones (aniones y cationes) consiste en grupos inmóviles cargados que atraen proteínas con carga opuesta, es el método con más alta resolución. Cromatografía de intercambio iónico (intercambiadores de aniones con carga+, ya que las proteínas a pH neutro tienen carga negativa) y la electroforesis. Según sus biopropiedades. Afinidad. Métodos utilizados: Se basa en la propiedad de unión especifica a un ligando (factores, cofactores) Cromatografía de inmunoafinidad Según sus biopropiedades. Afinidad. Métodos utilizados: Se basa en la propiedad de unión especifica a un ligando (factores, cofactores) Cromatografía de inmunoafinidad PROCEDIMIENTO GENERAL Mezclas crudas Generar producto homogéneo (Centrifugar) Pulido, eliminación de contaminantes
PROCEDIMIENTO GENERAL SEGÚN EL TiPO DE PROTEÍNA Proteínas recombinantes solubles. Solubles en el citoplasma, insolubles como cuerpo de inclusión, excretadas de las células (al cultivo, al espacio periplásmico), asociada con orgánulos. Procedimiento: a. células con proteína soluble en citoplasma
- Romper las células; centrífuga o ultrafiltro para eliminar los insolubles.
- Tratamiento para eliminar los ácidos nucleicos, la estreptomicina se usa para precipitar material ribosómico, y los polímeros catiónicos como la protamina y la polietilenimina formarán complejos insolubles con los ácidos nucleicos. *3. Una vez que se tiene el material de partida, la fracción soluble que contiene la proteína, se pueden realizar los pasos de purificación. 3.1 Utilice fraccionamiento de sal, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y pseudoafinidad o filtración en gel (no electroforesis preparativa). 3.2 Para la proteína de fusión etiquetada, use cromatografía en columna de afinidad y pasos de pulido.
- Obtención de la proteína purificada b. células con proteína excretada al medio
- Centrifugar o filtrar para eliminar las células. 2.Seguir los pasos 3 (3.1-3.2) y 4 del punto a.* c. células con proteína en el espacio periplásmico 1.Tratar suavemente con lisozima para minimizar la lisis celular. 2.Eliminar protoplastos y restos celulares. 3.Seguir los pasos 3 (3.1-3.2) y 4 del punto a.* d. Células con proteínas asociadas a orgánulos 1.Organelos separados; realizar centrifugación diferencial. 2.Extracto para solubilizar proteínas, eliminar insolubles. 3.Seguir los pasos 3 (3.1-3.2) y 4 del punto a.*
5.Realice fraccionamiento secundario: use cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, métodos de afinidad, otros adsorbentes y / o filtración en gel 6.Realice el paso de pulido: utilice HPLC - fase reversa, HPLC - intercambio iónico o enfoque isoeléctrico 7.Obtención de la proteína purificada. b. plantas: 1.Romper las células, usando una prensa francesa o moliendo con arena usando un tampón de 1-2 vol. 2.Tratar para eliminar los fenoles. 3.Seguir los pasos del 4-7 del punto a.* b. animales: 1.Homogeneizar con tampón de 2-5 vol o picar y revolver con buffer. 2.Seguir los pasos del 4-7 del punto a.* Proteínas insolubles no recombinantes y asociadas a membranas. Se pueden obtener después de extraer y eliminar las proteínas solubles. Generalmente se utilizan detergentes para solubilizarlas. Procedimiento:
- Con todo el tejido podemos homogeneizar sin detergente y centrifugar o romper las células y aislar suavemente los orgánulos.
- Homogeneizar con detergente (Triton, ácido cólico) y centrifugar (podemos pasar directamente sin el paso 1).
- Podemos obtener un sobrenadante que contenga proteínas asociadas a la membrana o un residuo que contenga proteínas insolubles. 3.1 Sobrenadante con proteína 3.1.1 Realizar fraccionamiento primario: utilizar cromatografía hidrófoba, precipitación con disolventes orgánicos, cromatografía de intercambio iónico y / o reparto de fases. 3.1.2 Realizar fraccionamiento secundario: utilizar cromatografía de intercambio iónico, métodos de afinidad y / o filtración en gel. 3.1.2 Realice el paso de pulido: utilice HPLC o enfoque isoeléctrico.
3.1.3 Obtener la proteína purificada. 3.2 Residuos 3.2.1 Suspenda y extraiga con otros disolventes (etanol, urea o SDS). 3.2.2 Obtener la proteína purificada o el residuo insoluble.
Durante la lisis celular al producir el extracto crudo, las proteasas son liberadas y degradan proteínas. Solución de lisis: Inhibidores de proteasas, como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) o péptidos bioactivos. Temperatura Disminuyen la velocidad de procesos químicos, estabilizan a las proteínas, inhiben a las proteasas. En el extracto crudo se realizan los pasos de purificación de las proteínas bajo temperaturas bajas (4-0 ° C). Compuestos fenólicos Estos compuestos se unen a proteínas y al ADN a través de enlaces de hidrógeno después de la lisis de las células vegetales y afectan sus propiedades y una extracción exitosa. Solución de lisis: PVP es utilizado para eliminar compuestos fenólicos.
PROTOCOLO DE AiSLAMiENTO DE PROTEÍNAS A PARTiR DE LAS HOJAS DE ALOE VERA L. Procedimiento: BUFFER: De extracción: De lisis: COMPUESTO APLICACIÓN Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) pH Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) 10 mM Iones metálicos Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM Proteasas Triton X-100 al 1% Desnaturalizar membranas/ Detergente β-mercaptoetanol al 2% Oxidación COMPUESTO APLICACIÓN Urea 8 M Desnaturalizante proteico NP-40 al 4% Detergente Anfolina al 2% (pH3-10) pH Ditiotreitol (DTT) al 1% Oxidación Para cada muestra se utilizó 2g de hojas de la planta de Aloe Vera, las hojas se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C. Se realizó un lavado con acetona (que contiene 0,2% DTT) dos veces. Para cada paso de lavado se utilizó un agitador Vortex (1min),y posteriormente la centrífuga (15 000 rpm,20 min, 4 ° C) El tejido en polvo se homogeneizo en un baño de hielo, en 4 ml de tampón de extracción helado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5),Sacarosa 250 mM, ácido etilenglicol tetraacético 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, Triton X-100 al 1%, β- mercaptoetanol al 2%). La proteína precipitada se disolvió en tampón de lisis (urea 8 M, NP-40 al 4%, anfolina al 2% (pH3-10), ditiotreitol (DTT) al 1%). Cong-Fen, H., & Yang-Meng, W. (2008). Protein Extraction From Leaves of Aloe vera L., A Succulent and Recalcitrant Plant, for Proteomic Analysis. Springer-Verlag. https:// doi.org/10.1007/s11105-008-0040-
