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MORELIA, MICHOACÁN 17 de octubre de 2023
TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
Práctica 4 : “DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR
CUENTA EN PLACA”
Práctica 6: “MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS
EN ALIMENTOS”
PRESENTA (n): LESLY ADRIANA CALDERÓN FLORES (20120830) ASHLEY LIZETH LUNA GARDUÑO (20120874) CARMEN ESTEFANIA SOLORIO AVALOS (20120923) TITULAR DE LA ASIGNATURA: M.C. ELVA AVALOS FLORES
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PROFESIONALES
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA INGENIERÍA BIOQUÍMICA
ÍNDICE
- CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
- 1.1 Coliformes………………………………………………………………………………………………………………………………………….
- 1.1.1. Coliformes como indicador higiénico………………………………………………………………………………………………
- 1.1.2 Efectos de las coliformes sobre la salud humana …………………………………………………………………………….
- 1.2. Mohos y levaduras ……………………………………………………………………………………………………………………………
- 1.2.1 Levaduras ……………………………………………………………………………………………………………………………………….
- 1.2.2 Mohos …………………………………………………………………………………………………………………………………………….
- 1.2.3 Mohos y levaduras en alimentos …………………………………………………………………………………………………….
- 1.3. Medios de cultivo ………………………………………………………………………………………………………………………..…...
- 1.3.1 Medio de cultivo Agar de Dextrosa y Papa……………………………………………………………………………………….
- 1.3.2 Medio de cultivo Rojo Bilis Violeta ………………………………………………………………………………………………….
- CAPÍTULO 2. OBJETIVOS
- CAPÍTULO 3. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
- CAPÍTULO 4. METODOLOGÍA
- CAPÍTULO 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES
- CAPÍTULO 7. RECOMENDACIONES
- CAPÍTULO 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Imagen 1 : Medio de cultivo BRV control……………………………………………………… ÍNDICE DE FIGURAS
- Imagen 2: Medio de cultivo BRV con dilución 10^- 3 ………………………………………….
- Imagen 3 : Medio de cultivo BRV con dilución 10^- 4 ……………………………………………
- Imagen 4: Medio de cultivo PDA control ………………………………………………………
- Imagen 5 : Medio de cultivo PDA con dilución 10^- 3 ………………………………………….
- Imagen 6: Medio de cultivo PDA con dilución 10^- 4 ………………………………………….
RESUMEN
La determinación de coliformes totales mediante la técnica de recuento en placa y el método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos son procedimientos fundamentales en el análisis microbiológico de muestras alimenticias. En la práctica de laboratorio para la determinación de coliformes totales por cuenta en placa, se inicia con la preparación de diluciones seriadas de la muestra en un medio de cultivo específico, seguido de la inoculación de las diluciones en placas de Petri conteniendo un medio de cultivo selectivo para coliformes. Posteriormente, se incuba a una temperatura y tiempo predeterminados para permitir el crecimiento de las colonias. Finalmente, se procede a realizar el recuento de colonias presentes en las placas, que posteriormente se utiliza para calcular la concentración de coliformes totales en la muestra original. En el método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos, se lleva a cabo la preparación de diluciones de la muestra en un medio de cultivo específico, seguido de la siembra de las diluciones en placas de Petri con un medio de cultivo selectivo para mohos y levaduras. Después, se procede a incubar las placas a una temperatura y tiempo óptimos para el crecimiento de los hongos presentes. Finalmente, se realiza el recuento de las colonias presentes en las placas, que se utiliza para determinar la concentración de mohos y levaduras en la muestra original. Ambos métodos requieren meticulosidad en la manipulación de las muestras y reactivos, el control estricto de condiciones de incubación, por lo que, ambas técnicas se realizaron bajo condiciones asépticas para garantizar la precisión y fiabilidad de los resultados. Los resultados analizados indicaron un crecimiento mínimo de microrganismos tanto en las placas destinadas para coliformes como para mohos y levaduras.
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
1.1 Coliformes. Coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 ºC fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares (Environment Agency, 2002). Las bacterias coliformes conforman un gran grupo de bacterias que se encuentran en todo el medio ambiente, principalmente en el suelo y el agua superficial e incluso en la piel. La mayoría de los tipos de bacterias coliformes son inofensivas para los humanos, pero algunas pueden causar enfermedades leves y algunas, transmitidas por el agua, pueden provocar enfermedades graves. 1.1.1 Coliformes como indicador higiénico. El grupo de los microorganismos coliformes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. Se pueden analizar tipos específicos de bacterias coliformes. Estos subgrupos de bacterias coliformes incluyen coliformes fecales y Escherichia coli. Las bacterias coliformes fecales son específicas del tracto intestinal de los animales de sangre caliente, incluidos los humanos, y por lo tanto se requiere una prueba más específica para detectar la contaminación por aguas residuales o desechos animales. E. coli es un tipo de bacteria coliforme fecal que se encuentra compuesta en los intestinos de animales y humanos. 1.1.2 Efectos de las bacterias coliformes sobre la salud Consumir alimentos contaminados con bacterias coliformes no siempre causa enfermedades, la mayoría de estas bacterias son inofensivas para los humanos. Los síntomas más comunes son malestar gastrointestinal y síntomas generales similares a los de la gripe, como fiebre, calambres abdominales y diarrea. 1.2 Mohos y Levaduras. 1.2.1 Levaduras
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que, al establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia prima inadecuada. 1.3 Medios de cultivo. 1.3.1 Medio de cultivo Agar de Dextrosa y Papa. Conocido como PDA por sus siglas en inglés, tiene la infusión de papa como fuente de almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. El bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las bacterias. Cuando se va a usar para el recuento de hongos y levaduras, se agrega al medio de cultivo una vez esterilizado y enfriado aproximadamente a 45ºC, 14 ml de una solución estéril de ácido tartárico al 10% para obtener un pH aproximado de 3.5. 1.3.2 Medio de cultivo Rojo Bilis Violeta. Este medio es utilizado para la detección, enumeración e identificación presuntiva de microorganismos coliformes. En este medio las colonias de coliformes presentan una morfología típica que permite su identificación presuntiva y que debe ser confirmada mediante reacciones bioquímicas. Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en este medio, el ácido producido por la fermentación de lactosa ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares, por lo que las colonias son color rojo obscuro y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas de color rojo claro a rosa, y la posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación. En este medio, la peptona provee la fuente de carbono y nitrógeno necesaria para el desarrollo de los microorganismos. El extracto de levadura provee vitaminas del complejo B para estimular el crecimiento bacteriano. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores de microorganismos Gram positivos. La lactosa es la fuente de carbohidratos y el rojo neutro actúa como indicador para evidenciar el cambio de pH como consecuencia de la fermentación de la lactosa. Es usado para la enumeración de coliformes en productos alimenticios y en lácteos.
CAPÍTULO 2. OBJETIVOS
Práctica No 4 2.1 Objetivo general Explicar el fundamento de la determinación de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placa. Realizar adecuadamente la determinación de coliformes totales en un alimento mediante la cuenta en placa. Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables. Práctica No 6 2.3 Objetivo general Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano. Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar contaminando con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM- 111 - SSA1-1994. Explicar el fundamento del método de detección y cuantificación de mohos y levaduras en alimentos. CAPÍTULO 3. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS Práctica No. 4 3.1 Equipos
- Vaso de licuadora estéril
- Motor para licuadora
- Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1.0 °C
- Balanza granataria
- Contador de colonias de campo oscuro
- Microscopio óptico
- Registrador mecánico o electrónico
- Utensilios estériles para la manipulación de muestras
- Baño de agua con control de temperatura
- Asa bacteriológica y asa micológica
- 1 matraz Erlenmeyer
- 4 tubos de ensaye 3.6 Reactivos
- Solución salina de peptona
- Agar papa dextrosa
CAPÍTULO 4. METODOLOGÍA
Práctica No 4 4.1 Estrategia experimental Diagramas de flujo de los integrantes del equipo: Calderón Flores:
Solorio Avalos: 4.2 Procedimiento El material se preparó para su esterilización. Para ello, se envolvieron las cajas de Petri y pipetas con papel; a los tubos de ensaye se les agregó 9 mL de solución salina, colocándolos en una lata de aluminio con un fondo de algodón y tapándolos con papel aluminio; a un matraz Erlenmeyer se le agrego 100 ml y al baso y empaque de la licuadora se le tapo con papel aluminio. Todos estos materiales, junto con los medios de cultivo preparados con los otros equipos, se metieron al esterilizar en la autoclave a 15 Ib por 20 min. Pasado el proceso, se esperó a que los materiales y el medio tuvieran una temperatura adecuada para su manejo. Primeramente, se pesó 10 g de la muestra, en nuestro caso utilizamos lechuga y se llevó a licuar con 90 mL de solución salina, hasta obtener una mezcla homogénea. Posteriormente, las diluciones se realizaron, por lo que con una pipita se tomó 1 mL de este licuado y se agregó en el tubo de ensaye rotulado con 10-^1 , se agitó y con otra pipeta se tomó 1 mL de esta solución y se agregó al tubo rotulado con 10-^2 , así se realizó lo mismo hasta llegar al tubo 10-^4. Para la inoculación, con la pipeta respectiva a la disolución, se tomó 1 mL de la disolución y se colocó en la caja de Petri, posterior se agregó el medio de cultivo, hasta el volumen medio de la caja y se esperó hasta que se solidificada. Pasado esto, se volvió agregar medio de cultivo, hasta tapar toda la superficie; se esperó a que se solidificara. Se realizo una caja de control con el mismo
procedimiento. Después, se llevaron a incubar a 37°C por 40 h, debido que, al cumplir 24 h, no se notó crecimiento ni gas. Finalmente, se hizo el conteo de las colonias que crecieron. Práctica No 6: 4.3 Estrategia experimental Diagramas de flujo de los integrantes del equipo: Calderón Flores:
4.4 Procedimiento Se realizó igual procedimiento que en la práctica No 4, exceptuando la doble capa de agar PDA. CAPÍTULO 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN PRÁCTICA 4 En la Imagen 1 se muestra el control para el medio de cultivo BRV, el cual, como se puede observar en la imagen, no se contamino ni hubo crecimiento de microorganismos en el medio. Imagen 1 : Medio de cultivo BRV control
En la Imagen 2, se puede observar el medio de cultivo BRV que contiene la dilución preparada 10^-3, la cual estaba destinada para el crecimiento de coliformes. Como se puede observar en la imagen, no hubo crecimiento de microorganismos en el medio de cultivo, lo que nos indica que, en el alimento analizado (lechuga) no habia presencia de coliformes. Imagen 2: Medio de cultivo BRV con dilución 10^- 3 En la Imagen 3, se puede observar que, al igual que el medio de cultivo con la dilución 10^-3, hubo crecimiento de microorganismos, solo se alcanza a apreciar una pequeña colonia en una de las orillas de la placa. Este resultado nos indica que en el alimento analizado había presencia de coliformes, pero en una concentración muy baja, casi nula. Imagen 3 : Medio de cultivo BRV con dilución 10^- 4 El casi nulo crecimiento de coliformes en las placas que contenían las diluciones decimales preparadas con lechuga en el medio de cultivo BRV plantea varias posibles explicaciones. Una posible razón podría ser la calidad y la frescura de la lechuga utilizada en el análisis. Si la lechuga estaba fresca y se manipuló adecuadamente, es probable que el bajo contenido microbiano inicial o la carga microbiana muy baja en la lechuga haya contribuido a la falta de crecimiento de coliformes en el medio de cultivo. Además, es importante considerar si el método de muestreo y manipulación de la lechuga se realizó con las prácticas de higiene adecuadas para evitar la contaminación. La presencia de residuos de desinfectantes o agentes antimicrobianos utilizados durante el cultivo y la distribución de la lechuga también puede haber inhibido el crecimiento de los coliformes en el medio de cultivo. Otra explicación potencial puede ser la presencia de sustancias antimicrobianas naturales en la lechuga, como aceites esenciales o compuestos fenólicos, que podrían haber inhibido el crecimiento de los coliformes. Además, factores
En la Imagen 6, se puede observar el medio de cultivo PDA que contiene la dilución preparada 10^-4, la cual estaba destinada para el crecimiento de hongos y levaduras. Como se puede observar en la imagen, sí hubo crecimiento de microorganismos en el medio de cultivo, lo que nos indica que en el alimento analizado (en este caso una lechuga), sí había presencia de hongos. Imagen 6: Medio de cultivo PDA con dilución 10^- 4 Para estos cultivos de hongos y levaduras se realizó una tinción con azul de lactofenol y posteriormente se observó al microscopio para hacer una observación más detallada del microorganismo. Imagen 7 Imagen 8 Imagen 9 En las imágenes 7, 8 y 9 se muestra la tinción con azul de lactofenol de las colonias que crecieron en los medios de cultivo de PDA. Como se puede observar y al ver las estructuras coloreadas, podemos decir que el microorganismo presente es un Hongo, ya que se pueden ver las estructuras filamentosas características de las hifas de los hongos. Tras realizar la determinación de hongos y levaduras en una muestra de lechuga fresca utilizando el medio de cultivo PDA, se observó un crecimiento limitado de microorganismos. En concreto, se
detectaron solo dos colonias en la placa correspondiente a la dilución de 10^-3 y dos colonias en la placa relacionada con la dilución de 10^-4. Además, el control no exhibió ningún signo de crecimiento de hongos o levaduras. Este resultado podría ser el reflejo de varios factores que potencialmente influenciaron el escaso crecimiento de colonias. En primer lugar, es posible que la lechuga fresca estuviera inicialmente poco contaminada con hongos y levaduras, lo que se tradujo en un número limitado de colonias visibles en las placas de cultivo. Asimismo, es importante considerar las condiciones de almacenamiento adecuadas que podrían haber ralentizado la proliferación de hongos y levaduras, en caso de que la lechuga se haya conservado en condiciones óptimas de refrigeración y humedad. Además, el procesamiento previo de la lechuga antes de la toma de muestra, incluido el lavado y otros tratamientos, posiblemente haya reducido la carga de hongos y levaduras presentes en la superficie de la lechuga. Se debe tener en cuenta que las características del medio de cultivo PDA también podrían haber influido en los resultados, ya que algunos hongos y levaduras pueden desarrollarse mejor en otros tipos de medios de cultivo. Posibles errores durante la preparación de diluciones o la siembra de las placas también podrían haber afectado la precisión de los resultados obtenidos. Cuestionario. Práctica 4:
1. ¿Para qué se utiliza el grupo de organismos coliformes como indicador en la industria alimentaria? Los coliformes son útiles como componentes de criterios microbiológicos para indicar contaminación postproceso térmico. Los coliformes fecales se consideran el indicador más adecuado de contaminación con heces de animales y humanos. Escherichia coli es el indicador clásico de la posible presencia de patógenos entéricos. El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
- La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos.
