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BIOTECNOLOGIA VEGETAL
METODOS DE PROPAGACIÓN “IN VITRO” EN PLANTAS
Dr. Sergio González Suárez Dpto. Biología Vegetal Facultad de Biología
Tema 1: Biotecnología Vegetal: Conceptos generales.
1.1 Morfogénesis y diferenciación.
Morfogénesis: podemos definirla como el conjunto de los fenómenos relativos a la diferenciación celular y el desarrollo de los tejidos y órganos de la planta.
Diferenciación: comprende los cambios morfológicos y fisiológicos que conllevan a la especialización de las células y a la formación de los diferentes tejidos y órganos de la planta. En todas las plantas se presentan las células embrionarias indiferenciadas y es a partir de ellas que ocurre la diferenciación de los tejidos permanentes primarios de la planta. (Figura 1) esto ocurre de forma normal durante la formación de los órganos de las plantas.
MERISTEMOS APICALES TEJIDOS PERMANENTES
PRIMARIOS
Protodermis Epidérmico
Meristemo fundamental Parénquimas Colénquima Esclerénquima
Procambium Xilema primario Floema primario
Figura 1. Diferenciación de tejidos permanentes primarios.
En las raíces y tallos de las plantas dicotiledóneas y en las plantas con semillas desnudas (geminospermas, por ejemplo los pinos) se presenta un crecimiento secundario en mayor o menor cantidad según la actividad del cambium y del felógeno. Esos son meristemos secundarios que se van a originar a partir de la
Células embrionarias indiferenciadas
Células diferenciadas
desdiferenciación (B) de las células de parénquima. Estos meristemos secundarios, al entrar en actividad producirán por rediferenciación (C) los tejidos permanentes secundarios y las plantas crecen en grosor.
PARENQUIMA CAMBIUM FELOGENO
SECUNDARIO
Xilema secundario Suberoso Floema secundario Parénquima
Figura 2. Formación de tejidos permanentes secundarios. A: diferenciación; B: desdiferenciación; C: rediferenciación.
Sin embargo en condiciones de laboratorio “in vitro”, mediante ese mecanismo se puede obtener el cultivo de tejido, de cualquier planta y de cualquier órgano de la planta, la única condición es que se parta de células vivas. O sea, se puede obtener el cultivo de meristemos y la diferenciación de brotes y raíces, siempre que se parta de un pedazo de la planta (explante) que tenga células vivas. Este es el fundamento fisiológico de la obtención de los cultivos de tejidos vegetales “in vitro”, tanto de plantas dicotiledóneas ( tabaco, papa, tomate, etc.) como de plantas monocotiledóneas ( arroz, maíz, caña de azúcar, etc.). esto se logró por primera vez a partir de la década de los años 30 del siglo pasado y es una metodología básica imprescindible que se aplica en la Biotecnología Vegetal actual para regenerar las plantas. (Figura 3).
Tejido Meristemático primario
Tejido Permanente primario
Tejido Meristemático secundario
A B
Tejidos permanentes
secundarios
C
DESDIFERENCIACIÓN
diferenciación de raíces, como se muestra en la Figura 4. Para ello, tomaron el tejido de la médula del tallo del tabaco, formado por un parénquima de relleno, poco diferenciado debido a que este tejido no presenta citoquininas naturales. Hoy en la actualidad este bioensayo de la médula de tabaco se utiliza para evaluar la presencia de citoquininas naturales en extractos naturales de plantas.
En el caso del tabaco se plantea que para obtener los callos la relación entre auxinas y citoquininas debe ser alrededor 10:1, mientras que para inducir la formación de brotes es de 4:1 y para inducir la formación de raíces 100:1.
El medio utilizado para estas investigaciones es normalmente conocido como medio MS y es ampliamente utilizado en la actualidad en los métodos de propagación “in vitro” de muchos materiales vegetales.
Tabla 1. Productos sintetizados utilizando cultivos celulares.
Industria Producto Planta Empleo Farmacéutica (^) • Ajmalicina
- Berberina
- Quinina
- Codeína
- Digoxina
- Catharanthus roseus
- Coptis japónica
- Cinchona ledgeriana
- Papaver somniferum
- Digitalis lanata
- Problemas circulatorios
- Antimicrobiano
- Antimalaria
- Sedante
- Cardiotónico Alimentaria (^) • Quinina
- Menta
- Cinchona ledgeriana
- Mentha sp.
- Bebidas
- Saborizante Agricultura (^) • Piretrina • Chrysanthemum sp. • Insecticida cosméticos (^) • Jasmine • Jasminum sp. • Perfumería
Tabla 5. Características del callo y contenido de alcaloides en especies de Solanaceas.
Especie Características del callo Contenido Alcaloides mg/g peso seco Datura clorantha (^) • Friable, incoloro, con activo crecimiento.
- Compacto, verde, poco crecimiento
Datura innoxia (^) • Friable, incoloro, con activo crecimiento.
- Compacto, verde, poco crecimiento
Datura stramonium (^) • Verde pálido, activo crecimiento
- Pardo-verdoso, poco crecimiento
Solanum dulcamara (^) • Friable, incoloro, con activo crecimiento.
- Compacto, verde , estructuralmente diferenciado, muy poco crecimiento
Solanum nigrum (^) • Friable, incoloro, con activo crecimiento.
- Compacto, verde, poco crecimiento
Figura 4. Obtención de cultivo de tejidos de la médula de tabaco según Murashige y Skoog (1962)
1.4 Control hormonal de la morfogénesis:
Tema 2: Métodos de propagación “in vitro”.
2.1 Introducción:
El desarrollo alcanzado en la propagación “in vitro” de plantas ha sido sorprendente en las últimas décadas. Sin embargo hay resultados que han marcado pautas en este sentido, ente las que se destacan los trabajos de algunos investigadores (Figura 5 y Tabla 4)
2.1.1 Cultivo de tejidos
- Nobecourt (1937): obtuvo cultivo de callos a partir de la raíz de la zanahoria ( Daucus carata) en un medio de cultivo con auxinas. A partir de estos resultados, diferentes grupos de investigación comenzaron a obtener cultivos de tejidos (callos) y células de numerosos materiales vegetales, sobre todo de plantas dicotiledóneas: tabaco, escorsonera, zanahoria, papa, boniato, plantas medicinales, cítricos, etc. Con plantas monocotiledóneas la obtención y puesta a punto de los métodos de obtención de cultivo “in vitro” de tejidos fue más lenta, hasta que se lograron iguales resultados en arroz, caña de azúcar, maíz, cereales, orquídeas, etc. Murashige y Skoog (1962) publicaron sus resultados sobre la morfogénesis “in vitro” de callos obtenidos a partir de la médula de tabaco. Su medio mineral propuesto es de una amplia utilización en la actualidad.
2.1.2 Cultivo de embrioides
- Steward (1958): obtuvo plantas de zanahoria normales, cuando transfirió agregados celulares de un medio líquido a un medio sólido. Esto demostró la formación de embrioides a partir de células somáticas. Estos embrioides también se han obtenido en muchas otras especies, entre ellas en Atropa belladona, Ranunculus sceleratus, Asparagus officinalis, Cichorium endivia, Petroselinum hartense, etc.
- Pero se debe a Vasil y Hildebrandt (1965) la demostración más precisa de que a partir de una célula somática aislada se puede diferenciar una planta completa, utilizando callo obtenido del parénquima de la médula del tallo de tabaco.
2.1.3 Androgénesis
- De forma paralela se estudió la androgénesis que es la capacidad de desarrollo de una planta a partir de un grano de polen (microspora). Esto puede ocurrir por un mecanismo directo (microspora – embrioide) o indirecto (microspora – callo – embrioide). En todos los casos se obtiene plantas haploides, aunque en el caso indirecto también se puede obtener plantas diploides. (Nitsch y Nitsch (1965) obtuvieron buenos resultados con tabaco.)
Figura 5. Schematic diagram illustrating the pathways of regeneration in plant tissue cultures.
Trabajar con plantas haploides es importante porque al inducir la duplicación del material genético, puede obtener la planta 2n pero homocigótica, lo que es de gran utilidad para los genetistas.
2.1.4. Protoplastos.
El aislamiento y cultivo de protoplastos se logró a principio de la década del 60, destacándose los trabajos de Cocking (1962 – 65).
Generalmente de obtienen a partir de las hojas, aunque han sido aislados de casi todas las partes de la planta: raíces, tallos, nódulos radicales, coleoptilos, frutos, pétalos, endospermo, polen, cultivo de tallos o de células, etc. Para obtener cultivos celulares, las células se pueden desagregar por métodos mecánicos o por medio de pectinasas que degradan los pectatos de calcio y de magnesio que se encuentran en las sustancias cementantes que unen las células. Además se degradan las pectinas que se encuentran en las paredes celulares.
Organ & tissue explants Main shoot Axillary shoot
Meristem tip (virus elimination)
Protoplasts Cell suspension
Callus Adventilious shoots
Shoot culture
Proliferating shoot culture
Somatic embryo Root induction
PLANTLET
posición y constitución interna. No se trasmite hereditariamente a las células cultivadas.
El crecimiento desordenado, a veces isodiamétrico que se produce en la zona dañada, se explica por una alteración de los niveles endógenos de auxinas, lo que provoca la división celular en las mismas y una tendencia a aislar las zonas dañadas.
¾ El tumor de crecimiento ilimitado:
La agalla de corona es un tipo de cáncer vegetal o tumor de crecimiento ilimitado cuyo agente inductor es el Agrobacterium tumefaciens.
Originalmente, por formarse en el cuello de la raíz (límite raíz – tallo) se les llamó “Crown gall” o agalla de corona.
Se ha descrito que más de 90 familias de plantas dicotiledóneas y gemnospermas son susceptibles a la transformación por el Agrobacterium. En la actualidad, también se ha logrado la transformación en plantas monocotiledóneas por esta vía. Los primeros trabajos fueron en arroz y caña de azúcar.
En este último caso, fue en Cuba donde se logró la transformación de caña de azúcar empleando el Agrobacterium tumefaciens y se obtuvo plantas resistentes al herbicida Basta (Enriquez, 1999)
2.1.7. Transformación de plantas.
En la actualidad este es una de los métodos más empleados para la transformación de plantas.
La infección penetra por una herida, la bacteria produce un principio inductor de tumores (PIT) responsable de la transformación de la célula normal a tumoral.
Por la transformación de una célula normal se obtiene una célula tumoral cambiada estable que transfiere sus propiedades a las células hijas por cambios en el DNA nuclear (Ti plásmido). Estos cambios pueden ser:
- Producción de fitohormonas (auxinas y citoquininas)
- Producción de metabolitos secundarios no presentes en células normales (octopina y nopalina) por fallos en el sistema de la arginasa.
Otras especies de Agrobacterium también producen tumores A. rhizogenes (plásmido Ri, raíz pilosa) ; A. rubi (agallas en plantas aéreas)
Basado en este principio, en la actualidad este es uno de los métodos más empleados para la transformación de células vegetales, ya que permite introducir en la célula fragmentos de ADN para que se expresen en la misma.
La transformación de plantas se realiza con distintas finalidades, como incrementar rendimientos, mejor calidad de los frutos, incrementar la resistencia a las enfermedades, incrementar la resistencia al ataque de herbívoros por la producción de mayores cantidades de fitoalexinas, la resistencia a herbicidas, etc.
Los primeros trabajos de transformación en plantas se lograron como tomates.
Todo ello ha traído una nueva problemática en la Biotecnología Vegetal, que son los problemas éticos que se han creado y el rechazo al consumo de plantas o productos de plantas transgénicas.
A partir de los años 80 la transformación de plantas se ha logrado mediante la transferencia directa de DNA plasmídico mediante el Agrobacterium o vía directa por transferencia del DNA mediante electroporación, microinyección o el sistema de bombardeo de partículas. También se han desarrollado otros métodos como la tecnología del DNA recombinante; la inactivación génica a través del DNA anti
- sense y la inserción de mRNA (Figura 7).
2.1.8 Perspectivas y aplicaciones de los métodos de propagación “in vitro”
Las perspectivas y utilización de los métodos de propagación “in vitro” son numerosos, veamos solo algunos ejemplos:
- Micropropagación acelerada de material vegetal seleccionado o transformado.
- Mantenimiento de bancos de germoplasmas.
- Evaluación de plantas resistentes o tolerantes a estrés abiótico como alta salinidad, estrés hídrico, bajas temperaturas, etc.
- Resistencia a herbicidas.
- Resistencia a herbívoros.
- Resistencia a enfermedades.
- Producción de metabolitos secundarios.
- Germinación “in vitro”.
ETAPA 1: Iniciación de cultivos. El objetivo es obtener un comienzo estable.
ETAPA 2: Multiplicación de brotes. La única función de esta etapa es incrementar y mantener las cepas o material: los centros meristemáticos se inducen y desarrollan en yemas y/o brotes.
ETAPA 3: Alargamiento de los brotes, inducción de raíces y desarrollo de raíces.
ETAPA 4: Transferencia a condiciones de invernadero o casa de condiciones controladas. Muchas especies requieren aclimatación con vistas a asegurar su sobrevivencia ex vitro.
ETAPA 0: ETAPA DE PREPARACIÓN.
Condiciones higiénicas:
Estandarizar las condiciones de crecimiento para producir, explantes sanos, locual necesita una esterilización menos agresiva. En consecuencia las plantas reaccionan de forma más estándar. Algunos consejos:
¾ Cultivar las plantas en invernaderos. ¾ Irrigar por goteo o cama de arena irrigada, no regar las plantas por encima. ¾ Mantener las plantas en una temperatura alta (25ª C y con una humedad relativa baja ( 70 %) ¾ Temoterapia para erradicar virus.
Nota: El tiempo en esta etapa es variable para cada especie y debe ser determinado; por ejemplo 3 meses para Cordyline, Dracarna spp., Ficus spp, Araceae.
Condiciones fisiológicas normales de las plantas
¾ Tratamiento con reguladores del crecimiento para mejorar las condiciones fisiológicas de las plantas que servirán para tomar los explantes. ¾ Aspersión, inyección en el tallo o aplicar durante el desarrollo de la flor. ¾ Fotoperíodo constante para controlar la floración. ¾ Rejuvenecer la planta por la poda, injertos, etc.
Medio de iniciación:
Sales – MS ¾ Medio de plantas maderables. ¾ Lepoivre
VIT – Tiamina – HCl, 0.4 mg/L
Inositol – 100 mg/L.
Sacarosa – 2 %.
Agente gelificador – Agar 0.6 %
- Gelrite 0.12 %
- Medio líquido con papel
- Agitación o rotación 1 rpm
pH - 5,
Fitohormonas – citoquininas (0 – 10 mg/L) 2 IP, BAP, Kin, Zea o TDZ (Thidrazuron) Auxinas (0 – 1 mg/L)
- yemas axilares; AIA
- yemas adventicias; ANA, AIB AG ( 0 – 1 mg/L) (esterilizado por filtro) Cultivo de meristemos.
Esterilización del explante:
- tomar callos con 3 a 6 yemas
- lavar con agua corriente.
- Etanol 95 % - alugos segundos.
- 0,1 – 1 % de HgCl 2 con detergente ( 2 gotas/ 100 mL) 3 – 5 min.
- Lavar con agua estéril.
- Hipoclorito 7 – 15 % con detergente ( 2 gotas / 100 mL)
- Lavar 3 veces con agua estéril
- Eliminar extremos
Condiciones ambientales en los cuartos de cultivo.
Temp. – 18 – 28 o^ C, (23 o^ C), temperatura nocturna 1 ó 2 o^ C menor.
Luz – Fotoperiodo: oscuridad primeros días en cultivo de meristemos 16 h en otros casos.
Cantidad de luz = radiación fotosintética 30 μE.m-2, s-1.
Tabla 4. The evolution of gene transfer technology in crop plants in the 20 th century.
Before 1960
After 1980
Gene transfer by sexual methods
Gene Transfer by non sexual methods
Phase I: Since 1900Producion of hybrids by sexual crossesEarly, and Mid 20 th century 1900
-^
Mendel´s
laws
of
inheritance
rediscovered 1900
-^
De
Vries
studies
mulation
in
plants beginning of plant breeding 1919
-^
Intraspecific
and
interspecific
hybrids1929 – Intergeneric gene transfer1940 – 70 – development of superiorcommercial
hybrids
in
Maize,
Wheal,
Barley,
Rice,
Sugarbeet,
Potato,
Brassica, Tomato, Cotton, etc…
Phase II: Since 1960Somatic hybrids by cell fusion^ -^
in vitro techniques
-^
Totipotency
of
single
cell
demonstrated-^
Plant
culture
media,
growth
hormones-^
Protoplast,
organ,
embryo,
meristem, anther, ovary cultures.-^
Plant
regeneration
via
direct
organogenesis
and
somatic
embryogenesis- Haploidy- Protoplast fusion- In vitro multiplication
Phase III: Since 1980Prokaryote-Eukaryote
hybrids
ortrans
Kingdom hybrids:Obtained
by
Bacteria
plant
conjugal
matingUse of recombinant DNA technologyTransfer of plasmid DNA to plants viaAgrobacterium or via direct DNA transfer:
-^
Electroporation
-^
Microinjectión
-^
Particle
bombardment
system
-^
gene
inactivation
through
anti-sense
DNA and m RNA insertion
