Stanhopea tigrina incomplet, Apuntes de Microbiología

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UNIVERSIDAD

TECNOLÓGICA DEL

CENTRO DE

VERACRUZ

Efecto del tipo de iluminación y reguladores del crecimiento

en dos sistemas de micropropagación para el cultivo in vitro

de Stanhopea tigrina

R E P O R T E F I N A L D E E S T A D Í A S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE INGENIERO EN

AGRICULTURA SUSTENTABLE Y PROTEGIDA

P R E S E N TA

LORENA CORREA HERNÁNDEZ

Asesor de tesina

Dr. Martín Mata Rosas

Instituto de Ecología A. C.

Asesor académico

M.C. Jaime Negrín Ruiz

Xalapa, Ver., Abril 2018

Efecto del tipo de iluminación y reguladoresdel crecimiento en dos sistemas de Lorena Correa Hernández

micropropagación para el cultivo in vitro de Stanhopea tigrina

Reporte Final de Estadía

RESUMEN

Con el propósito de averiguar las condiciones óptimas para su desarrollo explantes de la orquídea mexicana Stanhopea tigrina fueron micropropagados bajo la influencia de seis condiciones de luz (Luz fluorescente, LED blanca, LED rojo- azul(7:1), LED azul, LED rojo, luz natural) y cuatro reguladores de crecimiento (Benciladenina (BA) 8.8 μM/ ANA 2.68 μM, Kinetina (KIN) 8.8 μM/ ANA 2.68 μM, Tidiazuron (TDZ) 8.8 μM/ ANA 2.68 μM y Metatopolina (mT) 8.8 μM/ ANA 2.68 μM) más un control en dos sistemas de micropropagación in vitro siendo medio semisólido y Sistemas de Inmersión Temporal RITA los elegidos. Los resultados arrojaron que las mejores condiciones para producir brotes estuvieron bajo la influencia de luz fluorescente y tidiazuron en sistemas RITA; Los mejores resultados para elongar se obtuvieron bajo condiciones de LED roja y kinetina en medio semisólido. El proyecto se llevó a cabo en el Instituto de Ecología A. C. (INECOL) en el periodo de enero-abril del 2018.

ABSTRACT

In order to find out the optimal conditions for their development, explants of the Mexican orchid Stanhopea tigrina were micropropagated under the influence of six light conditions (fluorescent light, white LED, red-blue LED (7: 1), blue LED, red LED , natural light) and four growth regulators (Benzyladenine (BA) 8.8 μM / ANA 2.68 μM, Kinetin (KIN) 8.8 μM / ANA 2.68 μM, Tidiazuron (TDZ) 8.8 μM / ANA 2. μM and Metatopoline (mT) 8.8 μM / ANA 2.68 μM) plus a control in two in vitro micropropagation systems: semi-solid medium and RITA Temporary Immersion Systems. The results showed that the best conditions to produce shoots were under the influence of fluorescent light and thidiazuron in RITA systems; The best results to elongate were obtained under red LED, kinetin and semi-solid médium conditions. The project was realized in the Institute of Ecology A. C. (INECOL) in the period of January-April of 2018.

1. INTRODUCCIÓN

México como país megadiverso alberga una gran cantidad de especies florales, de las más importantes comercialmente encontramos a las orquídeas, una de las familias más grandes de plantas vasculares conformada por aproximadamente 30, 000-35, 000 especies distribuidas por casi todos los lugares del planeta (Dressler,

1993. dentro de todas estas especies México tiene un 40% de orquídeas endémicas (Dressler, 2005).

Uno de los grandes problemas que enfrentan las orquídeas actualmente es la pérdida su hábitat causado por el incremento de la urbanización además del tráfico de especies silvestres. La mayor parte de las especies encontradas en México están protegidas por la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES) esto gracias a que el comercio ilegal de orquídeas en el país es la fuente principal de ingresos para las poblaciones marginadas (Suárez, 2004), así como también ha contribuido el saqueo de especies silvestres por aficionados de otros países. (Tejeda-Sartorius,

La disminución de la biodiversidad ha estimulado el desarrollo de diferentes estrategias de conservación como la protección del hábitat. (Tsiftsis et al ., 2009). Gracias al avance tecnológico, se ha encontrado en el Cultivo de Tejidos Vegetales una solución que permite no sólo producir plantas de forma masiva sino también libre de enfermedades, hongos y bacterias. Esta técnica se llama micropropagación in vitro. Las técnicas de micropropagación permiten la propagación clonal o sexual en ambientes asépticos donde se obtienen plantas libres de virus. Una ventaja de esta técnica es que se reduce los requerimientos de espacio y los costos de mantenimiento en los bancos de germoplasma; sin embargo, durante la preservación de germoplasma in vitro se deben establecer metodologías que garanticen la estabilidad genética del material cultivado. (Damon, 2017)

en el tallo debajo de las hojas y se forman yemas axilares, sus hojas suelen ser más gruesas ya que cumplen funciones de fotosíntesis y reserva. Los géneros más representativos son Vanda y Phalaenopsis. (J., 2008)

Simpodiales: Presentan crecimiento “horizontal”. Tienen varios meristemas que se van diferenciando a partir del rizonma o yemas que aseguran la supervivencia de la planta pues originan pseudobulbos que tienen la función de reserva, por esta razón las hojas suelen ser más delgadas, las raíces se originan en rizomas y pseudobulbos que portan las hojas y la yema floral. Los géneros representativos son Cattleya y Oncidium. (J., 2008)

Alrededor del 70% de las orquídeas son epfitias, aproximadamente dos tercios de toda la flora epifítica del mundo (Gravendeel et al., 2004; Hsu et al., 2011). Por otra parte, el 25% de las orquídeas son terrestres y el 5% que resta pueden encontrarse en diferentes soportes como piedras (litofitias) (Atwood, 1986). La mayoría de las orquídeas de clima templado son terrestres mientras que se encuentran en climas tropicales son epifitias o litófitas.

La palabra epífita (del griego epi sobre y phyton planta), se refiere a las plantas que crecen sobre otro organismo vegetal, llamado forofito, organismo vegetal que utilizan solamente como soporte; las raíces de la epífita se adhieren al forofito pero no obtienen ningún tipo de nutrimentos de él. Los nutrimentos son provenientes de fuentes como el polvo y la lluvia (que los recoge del aíre, donde están en suspensión); además, las epifitas aprovechan la descomposición de hojas, y otros organismos enteros o fragmentarios muertos; de la misma manera, captan el agua que escurre por el tronco cuando llueve, arrastrando minerales y materia orgánica proveniente de la copa del árbol. Las plantas epifitas han sido resultado de la evolución para que ciertos organismos puedan sobrevivir en ecosistemas muy diversos como los bosques y selvas tropicales húmedos. (Escamilla, 2013)

Las orquídeas terrestres crecen a nivel del suelo, de donde toman parte de los nutrientes que necesitan, los cuales también obtienen del agua y del aire. Su

hábitat son praderas, sotobosques y pastizales e incluso matorrales (Ministerio del ambiente ,

Las orquídeas litófitas crecen sobre las rocas que les dan el soporte para su desarrollo. Representan un estado intermedio entre una planta terrestre y una epífita. Se nutren de los musgos de la piedra, de los nutrientes disueltos en el agua de lluvia, así como de los desechos de las rocas e incluso de sus propios tejidos muertos (Ministerio del ambiente , 2015)

Morfología

Flor: Tiene simetría bilateral, lo que quiere decir que si trazamos una línea justo por el centro de la flor quedan dos partes iguales. Presenta dos ciclos florales externo e interno, de tres piezas cada uno. En el externo está el cáliz, formado por los sépalos mientras que la parte interna está conformada por los pétalos donde encontramos al labelo; Es un pétalo modificado y es el encargado de atraer a los insectos. (J., 2008)

Hojas: Son paralelinervias (característica de las monocotiledóneas), las nervaduras transportan nutrientes y agua de forma paralela al eje longitudinal. Pueden presentarse de diferentes formas y su disposición puede ser alterna u opuesta. (Ministerio del ambiente , 2015)

Rizomas y pseudobulbos: Las plantas simpodiales tienen un tallo modificado denominado rizoma, suele ser leñoso, contiene nudos y entrenudos de los cuales salen los pseudobulbos; Los rizomas pueden ser subterráneos o aéreos. Por otra parte los pseudobulbos son órganos de reserva que la planta utiliza en épocas de sequía o reposo. (J., 2008)

Raíces: Son fasciculadas, pueden salir del rizoma, pseudobulbo o tallo y se encuentran cubiertas por un tejido llamado velamen el cual actúa como esponja, es el encargado de tomar agua y nutrientes que la planta necesite. (Fischer, 2007)

Inflorescencias: Flores desnudas con un periantio reducido, son poco vistosas y sin olor, contienen estambres con filamentos largos. Sirven para polinizar a la planta cuando no hay insectos que se encarguen de ello. (Océano, 1996)

Fruto: Son cápsulas que contienen miles de semillas. El número se semillas y la forma del fruto varía según la especie. (Ministerio del ambiente , 2015)

Reproducción

Las orquídeas pueden tener dos tipos de reproducción, la sexual mediante un intercambio de gametos (masculino y femenino) que lleva a cabo la polinización y la asexual por medio de yemas o tejido de crecimiento de una plata madre (Océano, 1996)

Algunos de los métodos de reproducción asexual son: Dividir la planta por pseudobulbos, separando las raíces con un método adecuado, por pulso hormonal consistente en levantar una pequeña parte del tallo que esté cerca de una yema a la cual posteriormente se le agrega lanolina con hormona vegetal, por medio de cultivo de tejidos, etc. (CONAFOR, 2011)

La reproducción sexual se lleva a cabo por la autopolinización y polinización mediante insectos, viento o aves. La disposición del labelo y la columna hacen que el visitante deje el polen en el rostelo y al irse lleve consigo polineas hacia otra flor. Al entrar el polen al óvulo se lleva a cabo la fecundación de gametos lo cual dará paso a la producción de un fruto con semillas. El porcentaje de germinación de semillas en el medio natural es muy bajo pues tienen que encontrar las condiciones perfectas, así como el hongo con el que hará simbiosis. (J., 2008)

Comercio mundial

A pesar de ser una familia tan diversa pocas orquídeas son cultivadas con otros fines que no sean ornamentales, su comercio ha evolucionado de un pasatiempo a una explotación desmedida, esto ha hecho que se ubiquen entre las plantas más vulnerables debido a la sobreexplotación del medio silvestre, tráfico ilegal, pérdida de hábitat y cambio climático (Tejeda-Sartorius, 2017)

Comercio legal

El cultivo de la orquídea se ha desarrollado mejor como flor de corte o maceta (Hew y Yong, 2004) Los principales países productores son: Tailandia, Japón, Holanda, China, Taiwan e India. Los principales destinos de dichas producciones son Estados Unidos, Europa, Asia (Japón, Taiwan, Corea, China y Tailandia), seguidos por Sudamérica, Canadá y México. (Zepeda Pineda Consultores S.C., 2011). En Alemania el género Phalaenopsis es el más popular y representa 75% de las ventas de orquídeas en maceta (Griesbach, 2002).

Comercio ilegal

Según el CITES (Convention International Trade in Endangered Species) aproximadamente 30, 000 especies están protegidas ante la sobreexplotación por comercio. Hay tres apéndices según el grado de amenaza y algunos contienen a grupos completos como orquídeas y cactáceas (CITES, 2013).

La mayor parte del comercio ilegal proviene de países en desarrollo a países desarrollados, tal es el caso de Norte América, Europa y China. (Haken, 2011).

S tanhopea tigrina

Información taxonómica:

REINO: Plantae

DIVISIÓN: Magnoliophyta

CLASE: Liliopsida

ORDEN: orchidales

FAMILIA: Orchidaceae

NOMBRE CIENTÍFICO: Stanhopea tigrina Bateman ex lindl.

Descripción

Planta mediana epífita o litófita, de unos 50 cm de alto, con pseudobulbos pequeños y globosos, con una sola hoja terminal erecta y ensanchada, tiene marcadas nervaduras longitudinales verde obscuro. Con el tiempo produce grandes plantas y masas de raíces. Entre éstas surgen hacia abajo las inflorescencias, de una a dos flores color marfil con grandes manchas color vino de hasta 18 cm de diámetro y son de corta duración. Su hábitat natural son los bosques mesófilos. (Pérez, 2015)

Situación del hábitat

Los bósques mesófilos de montaña (BMM) cuenta con una de las riquezas más grandes de plantas epifitias donde las orquídeas son protagonistas con 443 especies (Villaseñor y Gual-Díaz, 2014). Lamentablemente los BMM se ven amenazados por la pérdida de biodiversidad, influida por la deforestación, el cambio de uso de suelo y el avance poblacional. (Thomé-Ortiz, 2017)

Un ejemplo de ello son Puebla y el centro de Veracruz ya que los bosques de neblina donde habita la S. tigrina están sujetos a fuertes presiones por las actividades agropecuarias y han sido destruidos o están muy fragmentados. Hacia

Ilustración SEQ Ilustración * ARABIC 5 Flor de Stanhopea tigrina

el sur, en Oaxaca, los bosques están bien conservados pero S. tigrina es mucho más escasa (CONABIO, 2007).

Relevancia de la especie

Stanhopea tigrina es una de las orquídeas más espectaculares de México. Las flores tienen un aroma fuerte y son realmente grandes que pueden llegar hasta los 18 cm de diámetro y numerosas inflorescencias. (Pérez, 2015)

Es ampliamente colectada y cultivada ocasionalmente por la población local. Cerca de Xicotepec de Juárez, Puebla ha sido colectada por décadas para suplir la demanda de especímenes de la Cd. de México y muchas plantas se comercializaban en los viveros de Coyoacán. Es también muy apreciada y colectada en el centro de Veracruz, Orizaba y Xalapa. (CONABIO, 2007). Según las normas de conservación NOM-059-SEMARNAT-2001 y NOM-059- SEMARNAT-2010 es una de las tantas especies amenazadas a pesar de tener grandes poblaciones en Querétaro e Hidalgo (CONABIO, 2007).

2.2. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

El Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) es un conjunto de técnicas que permiten el establecimiento y desarrollo de cualquier parte de una planta bajo condiciones axénicas y controladas. Es una buena herramienta para solución de problemas relacionados con la biología vegetal además de que permite la investigación fisiológica, bioquímica, genética y estructural de materia vegetal así como su clonación, conservación y manipulación in vitro. (E. Pérez Molphe, 1999)

A principios del siglo XX investigadores como Haberlandt (1902), Hanning (1904), Küster (1909) entre otros se encargaron de definir las bases del CTV sin embargo hasta mediados de este siglo se desarrollaron las bases de los métodos actuales por White (1943,1963) y Gautheret (1934,1942). (Hurtado y Merino 1987, Endress 1994)

Los primeros experimentos no tuvieron mucho éxito ya que se desconocían tres factores importantes. El primero fue el desconocimiento de los requerimientos

Nutrición in vitro de los tejidos vegetales

Las plantas cultivas in vitro no son autótrofas pues al estar en un ambiente cerrado su tasa fotosintética se ve disminuida, para compensar se debe agregar una fuente de carbono. (Stephan-Sarkissian 1990). Las plantas normalmente obtienen sus nutrientes por la raíz, en el caso de las cultivadas in vitro son las células especializadas las encargadas de este proceso, claro que el área de absorción es mucho menor a la de una planta con raíz (Leifert y col. 1995).

A lo largo de los años se han desarrollado medios de cultivo diferentes algunos especializados para cierto tipo de plantas pero a gran parte se les puede dar un uso general. La mayoría de los medios se han creado a base de ensayo y error debido a que aún se desconoce los requerimientos nutricionales precisos para las células vegetales cultivadas in vitro además de que estas pueden variar de acuerdo a la especie vegetal y estado de desarrollo (Leifert y col. 1995)

Medio de cultivo

Todos los medios de cultivo están conformados por los siguientes grupos de sustancias:

Macronutrientes: Se trata de los mismos compuestos inorgánicos utilizados normalmente por las plantas que sirven para el crecimiento, síntesis de ácidos nucleicos y clorifa, división celular, etc., en esta categoría se encuentran N, P, K, Ca, Mg y S. (E. Pérez Molphe, 1999)

Micronutrientes: Tanto en plantas ex vitro como in vitro los micronutrientes son necesarios en cantidades menores, estos actúan como cofactores enzimáticos y para el transporte de electrones. Los micronutrientes empleados son: Fe, Mn, B, Cu, Mo y I. De estos se debe tener cuidado con el hierro pues suele precipitar los medios para esto se suministra con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de forma quelada. (E. Pérez Molphe, 1999)

Otro factor que se debe tener en cuenta es el empleo de un gelificante que permita la correcta absorción de los nutrientes, por otra parte la toma insuficiente de los

mismos puede estar dada por una traslocación causada por la planta. (Leifert y col. 1995)

Además de los nutrientes se necesita suministrar vitaminas que las plantas in vitro no pueden sintetizar, todas las células in vitro requieren de tiamina y otros ácidos orgánicos. Como fuente de nitrógeno orgánico (a parte del ya suministrado inórganicamente) se emplean los aminoácidos como la caseína y como fuente de carbono la glicina y glutamina, entre otros. (Pérez Molphe, 1999)

Fuente de carbono

Normalmente las plantas utilizan en CO2 como fuente de carbono para los cultivos in vitro se necesita suministrar una, la más utilizada es la sacarosa pues ha obtenido los mejores resultados en comparación a otras como glucosa, almidón, etc., en concentraciones del 2 al 3% aunque puede variar para algunas especies de plantas. La sacarosa tiene un papel importante como regulador del potencial osmótico del medio de cultivo. (E. Pérez Molphe, 1999)

Reguladores del crecimiento vegetal (RCV)

También conocidos como fitohormonas son de los elementos más importantes en el CTV pues determinan en gran parte la respuesta de tejidos, se dividen en cinco grupos dependiendo su estructura química: Auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico y etileno (Davis 1995).

Se debe tener en cuenta que al utilizar RCV cada tejido puede responder de manera diferente a una misma concentración de reguladores por la presencia de fitohormonas endógenas o la cantidad de receptores que tiene la planta para el tipo de RCV utilizado. Las fitohormonas más utilizadas son las auxinas y citocininas.

Auxinas

Están relacionadas con el crecimiento y diferenciación celular. Usualmente la concentración en el medio de los RCV son más grandes que las normales, en el caso de las auxinas disminuye

MICROPROPAGACIÓN

Es una propagación asexual de plantas utilizando las técnicas de CTV i n vitro. Las principales ventajas son: Se puede obtener plantas clones, el espacio de producción es mínimo, no dependen de factores externos como el clima, el número de plantas a obtener es prácticamente ilimitado, plantas libres de enfermedades y plagas. (Pérez Molphe, 1999)

La micropropagación de todas las especies consta de 5 etapas:

Etapa 0: Selección de planta madre

En esta etapa se elige la planta con las características deseadas.

Etapa 1: Establecimiento

Una vez elegido el material vegetal este debe de tener un proceso de desinfección. Va a depender del tipo de explante la elección del proceso de desinfección a utilizar.

Etapa 2: Multiplicación

Etapa donde empieza la micropropagación, aquí se genera una gran cantidad de brotes del explante inicial. Se puede presentar de tres formas: Organogénesis, embriogénesis somática y multiplicación por yemas, ápices, etc.

Etapa 3: Elongación y enraizamiento

Aquí se pretende hacer crecer a los brotes de la etapa 2, se puede esperar a que los brotes den sus propias raíces o sacarlos prematuramente y aplicar un enraizador.

Etapa 4: Aclimatización

Las plantas obtenidas en el cultivo in vitro se pasan a un invernadero. En esta etapa se debe tener sumo cuidado pues hay un gran porcentaje de mortandad debido a un estrés hídrico que presentan las plantas por lo que hay que brindarles un gran grado de humedad e ir disminuyéndolo paulatinamente.

Una de las desventajas de la micropropagación in vitro es el alto costo de producción, el uso de medio líquido disminuye el costo de producción y tiempo de siembra (Aitken-Christie 1991). El uso del medio de cultivo líquido para el cultivo in vitro tiene varias ventajas y es considerado una técnica ideal para la producción a gran escala porque reduce las manipulaciones y simplifica los cambios de medios de cultivo (Etienne y Berthouly, 2002). Se han desarrollado nuevos sistemas llamados Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) que emplean medio líquido. Uno de los más sofisticados es el sistema RITA.

El sistema RITA fue desarrollado en el CIRAD Francia. Contiene unidades de filtración comercial Nalgene modificadas que conectan el compartimiento inferior (reservorio de medio) con el superior (reservorio de los explantes), mediante un tubo de silicona. Este último diseño es el más difundido a nivel mundial pero los costos de importación y mantenimiento son muy elevados, lo que ha limitado su aplicación en los países en desarrollo. (C. Giménez, 2004)

Este sistema tiene dos compartimentos, uno en la parte superior que contiene a las plantas y uno inferior con el medio líquido. La presión aplicada en el contenedor inferior “empuja” al medio hacia la parte superior. Las plantas quedan inmersas por el tiempo que la presión es aplicada. Durante la inmersión el aire agita el medio y se renueva la atmósfera en el contenedor. (H. Etienne, 2002)