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Vol. III. Número 30. Septiembre 2020 NPunto
88 Revista para profesionales de la salud
5. Técnicas de biología
molecular en el diagnóstico de
enfermedades infecciosas
Olga María Diz Mellado Graduada en Farmacia Residente en formación, especialidad Análisis Clínicos Hospital Universitario Puerta del Mar de Cádiz Fecha recepción: 21.07. Fecha aceptación: 27.08.
RESUMEN
La microbiología ha sido durante muchos años una discipli- na muy manual, basada en cultivos, realización de pruebas bioquímicas o en la observación de características físicas y de tinción. El diagnóstico de las enfermedades infecciosas ha ido cambiando de forma muy notable en los últimos años debido a los avances en técnicas de diagnóstico, basados en la biología molecular. Estas técnicas permiten establecer el diagnóstico de forma mucho más precoz y fiable, a la vez que permiten la monitorización de la enfermedad, estable- cer su pronóstico y aumentar la supervivencia. Entre las téc- nicas de biología molecular, existen muchas variantes para amplificar, detectar y secuenciar los ácidos nucleicos (ADN o ARN en función de la sospecha clínica). La técnica más bási- ca es la reacción en cadena de la polimerasa y sobre esta se han ido desarrollando diferentes modificaciones para mejo- rar el proceso de diagnóstico e interpretación, entre ellas, la PCR en tiempo real o cuantitativa, la RT-PCR, los microarrays y la secuenciación. A lo largo del trabajo, se detallan diferen- tes técnicas que permiten el análisis de diferentes muestras para uno o múltiples microorganismos (mediante la utiliza- ción de paneles).
Palabras clave: Diagnóstico, biología molecular, microorga- nismo, identificación.
ABSTRACT
Microbiology has been for many years a very manual discipline, based on cultures, performing biochemical tests, or observing physical and staining characteristics. The diagnosis of infec- tious diseases has changed dramatically in recent years due to advances in diagnostic techniques based on molecular biology. These techniques make it possible to establish the early and re- liable diagnosis, while allowing the monitoring of the disease, establishing its prognosis and increasing survival. Among mo- lecular biology techniques, there are many variants to amplify, detect and sequence nucleic acids (DNA or RNA based on clini- cal suspicion). The basic technique is the polymerase chain re- action and different modifications have been developed on this
to improve the diagnostic and interpretation process, inclu- ding real-time PCR or quantitative PCR, RT-PCR, microarrays and sequencing. Different techniques that allow the analy- sis of different samples for one or multiple microorganisms (through the use of panels) are detailed in this work.
Keywords: Diagnosis, molecular biology, microorganism, identification.
1. EVOLUCIÓN DE LA MICROBIOLOGÍA E
INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Tradicionalmente la microbiología ha sido una disciplina muy manual. Algunas de las razones son la gran diversidad de tipos de muestras que se reciben en el laboratorio de microbiología, el número de microorganismos existentes y el volumen de muestras (mucho menor que un examen bioquímico o hematológico).
Con los grandes avances en los últimos años la micro- biología clínica ha cambiado rápidamente. La identifica- ción de microorganismos hasta hace relativamente poco tiempo dependía de un cultivo, la realización de pruebas bioquímicas y la observación de características físicas (morfología de las colonias) y de tinción (tinción de Gram, Ziehl-Neelsen, tinta china…). Posteriormente surgió la es- pectrometría de masas y esta se aplicó a la identificación de microorganismos (MALDI-TOF). Esta tecnología permi- te la identificación de bacterias y hongos en minutos, es económica y fiable en la mayoría de los microorganismos^1.
La bacteriemia se define como la presencia de bacterias en sangre, y se confirma tras el hallazgo de estas en los he- mocultivos. Según las características clínicas del paciente, se puede establecer un origen de la infección que haya provocado la diseminación de las bacterias a la sangre. La fungemia se utiliza para designar la presencia de hongos en la sangre, uno de los más frecuentes son las levaduras del género Candida spp., cuya aparición es muy frecuente a partir de infecciones de catéteres. Por otro lado, la viremia se define como la presencia de virus en la sangre^2.
La microbiología clínica es una ciencia basada en la iden- tificación del agente etiológico de una infección y el es- tablecimiento de un tratamiento correcto contra el o los agentes patógenos. Es importante la relación entre el clí- nico y el laboratorio, por un lado el clínico debe confiar en los resultados obtenidos en el laboratorio y el laboratorio debe garantizar la entrega de resultados exactos y clínica- mente importantes lo antes posible.
La identificación precoz de los microorganismos causan- tes disminuye de forma importante la mortalidad asocia- da a estos procesos, que puede variar entre un 10% y un 30% según el tipo de paciente, el origen de la infección, el manejo del paciente durante la infección y la rapidez de la identificación e instauración de un tratamiento. La instau- ración del tratamiento correcto es difícil y dependerá de los síntomas clínicos del paciente y la epidemiología local para conocer posibles resistencias a antibióticos (microor- ganismos multirresistentes) 2.
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El diagnóstico es una etapa crítica en el manejo de los pa- cientes. La dificultad de detectar muchos patógenos me- diante la microbiología clásica ha hecho que se desarrollen nuevos métodos diagnósticos. La microbiología clásica está asociada a inconvenientes como largos periodos de creci- miento, condiciones muy especiales de cultivo, muestras mal recogidas que complican la interpretación de los resultados o incluso imposibilitan la obtención de un resultado^3. Todo esto, ha dado paso a nuevos métodos de diagnóstico, entre ellos los basados en biología molecular, que han avanzado mucho en la última década, dando lugar a técnicas muy sen- sibles y específicas, capaces de detectar y cuantificar peque- ñas cantidades de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) y proteínas de microorganismos que pueden aislarse de un cultivo o no ser cultivables in vitro.
El laboratorio de biología molecular es el área diagnóstica de mayor dinamismo y crecimiento en los laboratorios clínicos. Estas técnicas así como la automatización, la nanotecnolo- gía y la informática han permitido mejorar el diagnóstico de enfermedades infecciosas y con ello, la instauración tempra- na de un tratamiento que permita disminuir la morbimorta- lidad asociada a estas infecciones. Además, han permitido mejoras en la prevención de estas infecciones, por lo que las ventajas son muy importantes^4.
Una prueba diagnóstica ideal debería ser capaz de procesar un pequeño volumen de muestra, ser rápida, técnicamente simple o automatizada, de bajo costo y que no requiriese procesamiento por lotes, es decir, que no sea necesario es- perar a reunir varias muestras para su procesamiento. Esto último provocaría retrasos en la entrega de resultados^5.
El aumento de la tasa de infecciones graves causadas por bacterias resistentes a antibióticos ha sido otra de las causas por las que se han intentado encontrar nuevas tecnologías que permitan establecer de forma más rápida los tratamien- tos y disminuir los errores asociados a tratamientos empíri- cos 5. Los avances en estas técnicas también han hecho que aumenten los conocimientos sobre la resistencia bacteriana a antibióticos.
Por otro lado, la biología molecular ha permitido tipificar, entendiendo por esto el identificar y caracterizar microorga- nismos patógenos causantes de brotes infecciosos, la fuente de infección y el patrón de diseminación. La secuenciación de genomas completos de bacterias, virus o patógenos fún- gicos se está empleando para la detección de patógenos concretos en brotes epidemiológicos^4.
En cuanto a estas técnicas, existen muchas variantes para amplificar, detectar y secuenciar los ácidos nucleicos. La técnica más utilizada es la reacción en cadena de la polime- rasa (PCR). Esta técnica posteriormente se acompaña de la detección de la amplificación mediante gel de agarosa con un intercalante inespecífico fluorescente. La PCR en tiempo real se acompaña de la identificación inmediata de la am- plificación a través de hibridación con sondas marcadas con un fluorocromo y la medida de la fluorescencia emitida por la sonda. La ventaja de esta técnica es que es rápida y se ob- tienen resultados en un tiempo de 30 minutos a dos horas.
La secuenciación de los productos amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite identi-
ficar bacterias y otros microorganismos comparándolos con secuencias ya conocidas y que están incluidas en múl- tiples bases de datos. La secuenciación de ARN ribosomal 16S permite detectar e identificar microorganismos no cultivables o que presentan complicaciones en su creci- miento o cultivo. El ARN ribosomal 16S es muy específico de cada bacteria y esto hace que sea una buena diana para la identificación del microorganismo 6.
La introducción en la práctica diaria de nuevas tecnologías tiene ventajas entre las que destacan mejores cifras de sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos, mayor rapidez en la obtención de resultados, mayor automatización y por tanto, capacidad para asumir una mayor carga de trabajo y mejor gestión de la actividad en el laboratorio. En cuanto a las desventajas asociadas, los analizadores e instrumentos necesarios para esta nueva forma de trabajo son equipos muy costosos, que supon- drán una gran inversión inicial para el laboratorio (muchos de ellos no se lo podrán permitir). A pesar de todo, se han realizado diversos análisis de costo-efectividad que hacen que esta desventaja sea mínima comparada con las venta- jas asociadas a esta tecnología 4.
A la hora de la realización de las técnicas pueden tener dife- rentes enfoques, pueden ir dirigidas a un único agente pa- tógeno o pueden ir orientadas a varios patógenos a la vez, o incluso a la identificación de posibles patógenos causan- tes de una patología concreta. Por ejemplo, podemos en- contrar sistemas orientados únicamente a la detección de Clostridium difficile o paneles de patógenos bacterianos, parásitos o virus causantes de patología gastrointestinal o respiratoria, entre otras 4. Hay que tener en cuenta cuando se trabaja con paneles de microorganismos, que aunque el resultado sea negativo no se puede excluir la infección, por lo que los estudios de identificación deben continuar.
La utilización de paneles para la identificación del mi- croorganismo causante presenta diferentes ventajas e in- convenientes. Por un lado, destaca la rapidez con la que se obtienen los resultados (y la precoz instauración del tratamiento), la realización de estudios epidemiológicos y la identificación de brotes. Pero por el otro, destaca el alto coste asociado a la realización de estas pruebas, la realización de un panel dirigido a población general y no individualizado, la posible detección de portadores y no pacientes enfermos, posibilidad de obtención resultados falsos positivos y la necesidad en muchos casos de realizar pruebas tradicionales de forma paralela 7.
2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Las técnicas de biología molecular sirven para analizar ácidos nucleicos y para detectar, e identificar tanto mi- croorganismos, como diferentes genotipos dentro de una misma especie y genes de resistencia al tratamiento far- macológico. Todas estas técnicas necesitan un paso pre- vio de extracción de ADN o ARN. Una vez extraído debe purificarse de forma adecuada para evitar la presencia en la muestra de inhibidores o sustancias que contaminen y que impidan la correcta realización de la técnica posterior.
La extracción del ADN es el paso más crucial en todo el pro- ceso relacionado con la biología molecular. Se suelen utili-
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- Fase de apareamiento o annealing: en esta fase tiene lugar la unión de los primers a la secuencia concreta que ha quedado separada en la fase anterior. La temperatura en esta fase es mucho más baja y dependerá de los primers utilizados (45-55 ºC).
- Fase de extensión o elongación: una vez unido el primer a su cadena complementaria de ADN, la ADN polimerasa realiza su función, añadir nuevos nucleótidos comple- mentarios a la hebra molde obteniendo como resultado una molécula de ADN de doble cadena. En esta fase la temperatura está sobre 72 ºC, temperatura de actuación de la Taq polimerasa. La duración de esta fase depende- rá de la longitud del fragmento que se desea amplificar. Cada copia generada en un ciclo sirve de molde para los siguientes ciclos, por lo que la amplificación es exponen- cial, y el resultado es la obtención de millones de copias de un fragmento concreto.
Se trata de una técnica muy específica debido a que los pri- mers son específicos de una región concreta. Estos son com- plementarios a la región del ADN que nos interesa (región diana). Además de ser muy específica, presenta una alta sensibilidad, ya que la cantidad de ADN requerida para que se inicie la amplificación es muy baja. Esta técnica también presenta desventajas, es una técnica lenta y su realización requiere de un gran número de pasos, cada uno con riesgo de contaminación.
La PCR convencional se ha utilizado para la detección e iden- tificación de patógenos presentes en alimentos (por ejem- plo Arcobacter spp en carne aviar), para la identificación de los genes asociados a la virulencia de las diferentes especies y para identificar E. coli enterotoxigénica amplificando las enterotoxinas (LT y ST), entre otras aplicaciones^11.
Una vez amplificados los fragmentos de interés, estos se so- meten a un proceso de migración por polaridad a través de un gel de agarosa, influido por dos campos eléctricos. Los
ácidos nucleicos poseen carga negativa (aportada por el grupo fosfato), por lo que al realizar la electroforesis van a migrar en dirección al polo positivo. Tiene una gran ca- pacidad de separación de diferentes fragmentos (de 50Kb hasta 2Mb). Esta técnica complementaria a la PCR se utili- za en la detección de patógenos y genes de resistencia a antibióticos 11.
Dentro de la PCR podemos encontrar diferentes variantes, teniendo cada una de ellas diferentes características y apli- caciones que favorecen los diferentes diagnósticos. Todas ellas han permitido establecer avances en la tipificación, pudiendo determinar la relación clonal entre diferentes in- fecciones gracias a la amplificación de genes o secuencias de ADN polimórficas^12.
2.2. PCR en tiempo real o qPCR
Esta variante de la PCR añade marcadores fluorescentes con el objetivo de saber la cantidad de ADN inicial en todo momento y detectar la presencia de variaciones genéticas. La emisión de fluorescencia será proporcional al número de moléculas producidas, haciendo que la técnica sea cuantitativa.
Para la realización de esta técnica, además de los reactivos necesarios para la PCR convencional, se necesitan sondas marcadas con enzimas, sustratos antigénicos, radioisóto- pos, quimioluminiscencia o fluorescencia, con capacidad de unión a la cadena de ácido nucleico que se requiere amplificar. En función del marcado de la sonda, para su interpretación se utilizarán diferentes métodos. Se puede utilizar para la identificación de virus, bacterias y hongos. El fluoróforo marcador más utilizado es el SYBR Green, pre- senta carga positiva y no emite fluorescencia si está libre
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Figura 4. Fase de apareamiento o annealing. Adaptada de Bos- terBio®.
Figura 5. Fase de elongación. Adaptada de BosterBio®.
Figura 6. Amplificación del fragmento diana del ADN de for- ma exponencial. Adaptada de BosterBio®.
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pero sí lo hace al unirse al surco menor del ADN 9. Se utilizan además, sondas de hidrólisis (TaqMan) 11.
La velocidad de obtención de resultados y la sensibilidad en la PCR en tiempo real en el diagnóstico de enfermedades infecciosas son mayores que en la PCR convencional 13. Otra ventaja de esta técnica es que en la mayoría de los casos, no es necesario el paso posterior de evaluación de los pro- ductos obtenidos de la PCR mediante el gel de agarosa o poliacrilamida, pues según se está realizando la técnica ya se sabe si el funcionamiento y la obtención de amplificacio- nes ha sido correcta.
Se pueden utilizar diferentes sondas fluorescentes para mar- car genes de varios microorganismos distintos, de forma que se convierte en una PCR en tiempo real múltiple. En este senti- do, la qPCR múltiple se puede utilizar para detectar, identificar y cuantificar entre otros, la presencia de patógenos en alimen- tos (Campylobacter spp, Salmonella spp). Se considera una buena elección en el análisis de calidad de los alimentos^11.
Existen diferentes sistemas comerciales que se basan en la PCR en tiempo real y que se resumen a continuación:
a. Plataforma Light Cycler
Este sistema consta de unos capilares sobre los que se si- tuará la muestra de ADN junto con el resto de los reactivos necesarios para la realización de la PCR y un equipo que re- gistra la emisión de fluorescencia en tiempo real. Se identi-
fican aquí las curvas de fusión o de melting que permiten la cuantificación. Se caracteriza por ser un sistema muy rápido. A medida que se van amplificando las copias de ADN se va monitorizando el producto gracias a las sondas marcadas por fluorescencia 9. Este sistema permite realizar PCR múltiples y cuantificar ARN, para ello, es necesario lle- var a cabo previamente la conversión de ARN en ADNc. Entre los microorganismos que se pueden identificar con esta plataforma están:
- Bacterias: Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., Salmonella tiphy, Chlamydia pneumoniae, Mycoplas- ma pneumoniae, Bordetella pertussis y parapertussis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Listeria monocitogenes, Neisseria meningitidis, Haemophilus in- fluenzae y Streptococcus pneumoniae.
- Hongos: Aspergillus fumigatus, pan fungus, Pneumocitis jirovecii.
- Parásitos: Toxoplasma gondii, Plasmodium spp., Leish- mania spp. y patógenos protozoos en heces.
- Virus: herpes virus tipo I, herpes virus tipo II, varicela zoster, virus de Epstein Barr, citomegalovirus, parvovi- rus B19, JC virus y BK virus.
b. Plataforma Cobas TaqMan 48 2.
Este sistema se basa en la utilización de la sonda TaqMan, la cual posee un fluoróforo en el extremo terminal 5’ y un aceptor de energía (quencher), de tal forma que la energía se transfiere desde el fluoróforo hasta el aceptor. Una vez que la sonda TaqMan se une a la cadena de ADN comple- mentaria tiene lugar la liberación de esta energía desde el fluoróforo y esta será medida en fotodetectores presentes en el equipo Cobas 48 2.0.
Mediante esta plataforma se pueden detectar microorga- nismos como: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH- 1, utilizado en el seguimiento y la monitorización de la carga viral) y virus de las hepatitis B y C y sus cargas virales.
c. GeneXpert®
Esta tecnología utiliza cartuchos de un único uso, específi- co para cada PCR. En el interior del cartucho se encuentran los reactivos de PCR liofilizados, y en el momento del uso
Figura 7. En la imagen A se representan las curvas de melting de dos genes presentes en Acinetobacter baumanii (muestras control). En la imagen B se representan las dos muestras control y 3 muestras de pacientes para valorar la presencia o no de los genes en estudio. Tres de las muestras resultan ser positivas para VIM e IMP, mientras que una de ellas es positiva solo para VIM. Adaptada de (14).
Tabla 1. Comparación PCR convencional y PCR en tiempo real.
PCR convencional PCR en tiempo real Detecta un único segmento del ADN Detecta y cuantifica el ADN Amplificación y cuantificación del producto en dos fases
Amplificación y cuantificación en un solo paso
Menor sensibilidad Mayor sensibilidad Menor especificidad Mayor especificidad
Equipos menos costosos Equipos y reactivos más costosos(sondas fluorescentes más caras)
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h. Sistema Flow
Este sistema consta de diferentes etapas, entre las que se in- cluye el proceso de extracción del ADN, la purificación de
este y el proceso de amplificación y de detección de resul- tados. Procesa múltiples muestras a la vez y ofrece resul- tados en pocas horas. Trabaja también mediante paneles para detectar tanto microorganismos como genes de re- sistencia en estos microorganismos.
i. Sistema Versant
Permite el análisis de ARN y ADN para identificar diferentes microorganismos (VIH, VHB, VHC, Citomegalovirus, virus Epstein Barr, virus BK, virus varicela zoster, virus del herpes simple (1 y 2), adenovirus, parvovirus B19, C. trachomatis y N. gonorrhoeae.
2.3. Reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Es una variante de la PCR convencional en la que la hebra molde que se utiliza es ácido ribonucleico (ARN). A partir de esta hebra de ARN se sintetiza ADN complementario (cDNA) sobre el que posteriormente se realizará la PCR convencional. Se trata pues, de un método dividido en dos procesos, el primero de ellos, la transcripción inversa y el segundo, la PCR
Sobre esta prueba además existen diferentes variantes:
- RT-PCR en tiempo real: basada en la combinación de la RT-PCR con el marcaje fluorescente.
- RT-PCR multiplex: permite la amplificación simultánea de varios genes en una única reacción. Se utilizan en este caso más de una pareja de primers.
2.4. PCR digital
La PCR digital (dPCR) se trata de una técnica ultrasensible, por lo que en el diagnóstico de enfermedades infeccio- sas puede detectar la presencia de microorganismos en concentraciones muy bajas, incluso aquellas que están por debajo del límite de detección de la qPCR. La dPCR proporciona una cuantificación precisa y absoluta de los ácidos nucleicos sin una curva estándar y sin dependencia de la eficiencia de amplificación.
La PCR digital funciona dividiendo una muestra de ADN o ADNc en muchas reacciones de PCR paralelas individua- les, depositadas en múltiples pocillos. Aquellos pocillos en los que se amplifique la región diana concreta produ- cirán señal mediante un color, mientras que las negativas no (se utilizan sondas marcadas).
2.5. Microarrays
La técnica de microarrays o microarreglos de ADN se basa en la hibridación de sondas cortas que se unen a secuen- cias cortas de regiones concretas del ADN de la muestra colocadas sobre un soporte sólido. Estas sondas emitirán fluorescencia que será lo que se detecte en un analizador. La detección de ADN por microarrays permite analizar si- multáneamente un gran número de secuencias de ácidos nucleicos de múltiples patógenos de una única vez. Si el diseño del microarray es bueno, es posible identificar ge-
Figura 10. Esquema de los procesos que tienen lugar en la RT- PCR. Adaptada de Thermo Fischer®.
Tabla 2. Tipos de PCR, características y aplicaciones. Adapta- da de (3). Tipo de RPC Características Aplicaciones
RPC Estándar
Amplificación de un segmento de ADN utilizando dos partidores. La detección de la amplificación es mediante geles de agarosa.
Detección cualitativa de un segmento de ADN.
RPC Múltiple
Amplificación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en una sola reacción de amplificación. La detección de la amplificación es mediante geles de agarosa.
Detección cualitativa de varios segmentos de ADN en una sola reacción de RPC.
RPC-RFLP (Res- triction fragment length polymor- phisms)
RPC estándar con paso posterior de digestión con enzimas de restricción.
Detección de poli- morfismos genéticos (SNPs).
RT (Reverse trans- criptase)-RPC
Síntesis de cADN a partir de ARN mediante transcripción reversa, seguido de una RPC.
Expresión de genes. Detección de virus ARN.
RPC-TR (Real time) o qRPC
RPC estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoróforos para la detección de los fagmentos amplificados. Puede ser del tipo multiplex.
Detección cualitativa de uno o varios segmentos de ADN. Cuantificación de ADN en la muestra (cargas) o expresión de genes (asocia- da a una reacción de transcripción reversa).
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nes asociados a factores de virulencia y genes que confieren resistencia a tratamientos antibióticos. Las sondas deben tener una alta complementariedad para que se produzca la unión a la secuencia diana y poder detectar concentraciones muy bajas (aumentar la sensibilidad)^11.
Los microarrays de ADN se utilizan en la detección de pa- tógenos transmitidos por alimentos (Yersini pestis, Bacillus anthracis, Salmonella spp y Echerichia coli, entre otros), en el diagnóstico clínico, la microbiología clínica y la vigilancia epidemiológica. 11
2.6. Secuenciación del genoma
La secuenciación del genoma consiste en determinar la se- cuencia completa de ADN (orden de las bases Adenina, Ci- tosina, Guanina y Timina) en el genoma. La secuenciación es fundamental para determinar los aminoácidos que codifican un gen en concreto, para el diagnóstico de enfermedades y la detección de mutaciones y resistencias a tratamientos far- macológicos. Estos métodos de secuenciación se basan en la actividad de la enzima ADN polimerasa, que sintetiza ADN a partir de otro fragmento de ADN produciendo su hebra complementaria. Se pueden obtener secuencias de hasta 500 bases aproximadamente. Dentro de la secuenciación podemos encontrar diferentes métodos, entre los cuales en- contramos:
a. Secuenciación Sanger. b. Secuencia paralela, masiva o de nueva generación (NGS). c. Pirosecuencia. d. Hibridación de sondas de ADN. e. Polimorfismo amplificado aleatorio ADN (RAPD). f. Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP) 12.
a. Secuenciación Sanger
Fue uno de los primeros métodos desarrollados para se- cuenciar. Se pueden obtener secuencias de hasta 500 pares de bases aproximadamente. Se examinan genes específicos o incluso regiones concretas de un gen. La se- cuenciación Sanger aporta alta precisión y baja probabili- dad de falsos negativos, pero es un método laborioso.
Se basa en el empleo de didesoxinucleótidos (se diferen- cian de los dioxinucleótidos en que no presentan un grupo hidroxilo en el tercer carbono de la ribosa que forma parte de su estructura) que están marcados por una molécula fluorescente. La ADN polimerasa irá añadiendo de forma inespecífica didesoxinucleótidos o desoxinucleótidos e irá alargando los fragmentos. Cada vez que se añade un didesoxinucleótido la reacción se detiene y se emite una
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Figura 11. Esquema dPCR. Adaptada de Thermo Fisher®.
Figura 12. Microarrays de ADN. Adaptado de (19).
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Como desventaja, es necesario realizar un pre-enriqueci- miento de la muestra, para aumentar la concentración del patógeno y aumentar su sensibilidad y es una técnica de alto coste y compleja. Tiene muchas aplicaciones, entre las que destaca la microbiología, el análisis de agua y la detec- ción de patógenos en alimentos (leche, quesos…) 11.
d. Hibridación de sondas de ADN
La hibridación de sondas se basa en detectar la presencia de ácidos nucleicos (ADN o ARN), realizando una combina- ción con una molécula de doble cadena. Algunas se basan en la PCR y tienen utilidad en la identificación de microor- ganismos patógenos 12. La hibridación se produce con alta sensibilidad y especificidad, por lo que se pueden identi- ficar especies o cepas concretas del microorganismo que se encuentra produciendo la infección. Se pueden utilizar sondas marcadas con fluorescencia y la posterior visualiza- ción al microscopio (hibridación in situ o FISH) 9. La técnica FISH en poco tiempo puede permitir la identificación, visua- lización y cuantificación de microorganismos en muestras biológicas. 22
e. RAPD
Esta técnica se basa en la amplificación aleatoria de ADN polimórfico y es más conocida por el acrónimo inglés RA- PDs (Random Amplification of Polymorphic DNA). Emplea marcadores moleculares para amplificar por PCR secuen- cias cortas de ADN polimórfico, utilizando para ello un ce- bador de secuencia corta (10-12 pares de bases). En micro- biología se utiliza para establecer relación entre diferentes especies, por ejemplo entre bacterias y plantas, pero hasta ahora no se ha estudiado en el diagnóstico de enfermeda- des infecciosas^12.
f. RFLP
El análisis de fragmentos (Restriction Fragment Len- gth Polymorphisms) consiste en la obtención a partir de enzimas de restricción de secuencias cortas y con- cretas de ADN. Permite detectar especies bacterianas y su posterior identificación, gracias a variaciones en el RNA ribosomal 16S. Se trata de un método rápido y sensible. 12
g. LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)
Se trata de otra posible metodología utilizada en la iden- tificación de microorganismos basada en la amplificación del ADN a una única temperatura, usando una polimerasa muy activa y haciendo que sea una técnica muy rápida. Permite detectar genes relacionados con resistencia a an- timicrobianos en menos de media hora con una sensibili- dad y especificidad muy alta 23.
3. PATOLOGÍAS
3.1. Sepsis
La sepsis se define como un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica consecuencia de un estímulo infeccioso (presencia de bacterias en la sangre) y que está asociada a una elevada morbimortalidad. Según diversos estudios, se estima que la mortalidad asocia- da a sepsis en pacientes europeos y norteamericanos es de 400.000 pacientes cada año 23. La identificación e
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Figura 15. Esquema del procedimiento de FISH. Fuente: ela- boración propia.
Figura 16. Esquema del procedimiento de RFLP. Adaptada de Thermo Fisher®.
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instauración precoz de tratamiento empírico es funda- mental para disminuir las complicaciones asociadas a la sepsis.
Aunque el hemocultivo sigue siendo actualmente el méto- do de diagnóstico de la bacteriemia, su uso en la práctica tiene diversas desventajas:
- Retraso en la obtención de resultados.
- Contaminación por microorganismos pertenecientes a la microbiota normal de la piel.
- Falta de positividad en muchos casos, siendo aún menor en aquellos pacientes que han iniciado tratamiento an- tibiótico y en aquellos cuya infección está causada por hongos o por bacterias de crecimiento lento o necesida- des especiales.
- Factores asociados a la propia extracción de la muestra (momento de la extracción, volumen de la muestra, lo- calización anatómica de extracción de la muestra, entre otros) 2.
Las nuevas técnicas basadas en la biología molecular (de- tección de ADN del microorganismo causante de la infec- ción) ofrecen múltiples ventajas, la principal la rapidez con la que se obtiene el resultado 2. Un retraso en la instauración de un tratamiento antibiótico adecuado aumenta en gran medida el riesgo de mortalidad (7,6% por cada hora sin tra- tamiento antibiótico).
Con las pruebas de diagnóstico molecular se están consi- guiendo minimizar las limitaciones que hasta ahora existen con el hemocultivo, entre ellas, la posible identificación del microorganismo causante aun después de haber iniciado tratamiento antibiótico.
Con los nuevos avances se han conseguido detectar pató- genos que frecuentemente son responsables de sepsis y genes de resistencia (gen mecA y genes que codifican BLEEs y carbapenemasas, entre ellos). Una de las ventajas de la biología molecular en el diagnóstico de sepsis es la rapidez con la que es posible identificar al microorganismo respon- sable, ya que evitas el tiempo de espera de crecimiento en el hemocultivo 5. Pero también existen desventajas, entre las que encontramos:
- Presencia de ADN humano que puede interferir en los re- sultados.
- Persistencia de ADN de microorganismos muerto.
- Sustancias inhibidoras presentes en la sangre (hierro, he- moglobina, heparina, entre otras) que afectan a la efica- cia de extracción, detección e identificación del ADN del patógeno. A la hora de la extracción de muestra se debe evitar heparina de litio o sodio como anticoagulante y en su lugar se recomienda la utilización de EDTA.
- Bajo número de microorganismos circulantes en la san- gre.
- Estas técnicas no permiten aportar información sobre la sensibilidad microbiana 2.
Por estas razones, el hemocultivo sigue utilizándose has- ta la fecha y se considera la biología molecular como una prueba complementaria. La PCR cuantitativa (qPCR) se considera un marcador útil para la evaluación de la efica- cia del tratamiento y el pronóstico en pacientes con infec- ciones bacterianas agudas, ya que permite cuantificar la carga bacteriana 5.
Algunos de los sistemas que se han empleado en la de- tección e identificación de microorganismos en pacientes sépticos son: LigthCycler Septifast, Magicplex Sepsis Re- al-Time, SepsiTest y VYOO.
El sistema LightCycler Septifast consiste en la extracción directamente de la sangre de ADN, purificarlo y posterior- mente realizar 3 PCR múltiples (una para bacterias gram negativas, otra para gram positivas y otra para hongos). Para las bacterias utiliza las secuencias localizadas entre el 16S y el 23S del ADN ribosomal y para los hongos las secuencias entre el 18S y el 5,8S. Con este sistema, ade- más de poder identificar de una sola vez 25 patógenos diferentes (Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae/oxyto- ca), Serratia marcescens, Enterobacter (cloacae/aerogenes), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas maltophilia; cocos gram- positivos: Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativa, Streptococcus pneumoniae, otras especies de Streptococcus, Enterococcus faecalis, E. faecium, 5 especies de Candida y Aspergillus fumigatus), se puede detectar la presencia del gen mecA relacionado con la resistencia de algunos microorganismos a la meticilina. La cantidad de muestra necesaria es muy poca y el tiempo de obtención de resultados varía de 3,5 a 6 horas en función de los re- sultados obtenidos. La especificidad de la técnica es ele- vada y la sensibilidad es mayor en bacterias que en hon- gos (80% y 61%, respectivamente) 23.
El sistema Magicplex Sepsis Real-Time se basa en la reali- zación de una primera PCR convencional y una segunda PCR en la que los primers están marcados con una sustan- cia fluorescente y permite la detección a tiempo real. En cuanto a su utilidad en la práctica, permite detectar ma- yor cantidad de microorganismos (73 bacterias gram po- sitivas, 12 bacterias gram negativas y 6 hongos. Además, no sólo permite detectar el gen mecA, sino que también puede detectar la presencia de vanA y vanB (relacionados con la resistencia a Vancomicina). En cuanto a volumen de sangre necesario y tiempo de obtención de resultados es muy similar al sistema anterior 23.
El sistema SepsiTest utiliza primers dirigidos a dianas del ARN ribosomal de bacterias (16S) y hongos (18S) para la realización de un PCR. Se obtendrá como resultado de la PCR si hay o no presencia de bacterias u hongos y en el caso de que sea positivo, se secuencia para identificar fi- nalmente al microorganismo. Permite identificar 345 mi- croorganismos patógenos, tanto en sangre como en otros líquidos biológicos. La primera parte de la técnica, saber si hay presencia o no de microorganismo en la muestra re- quiere 4 horas, y la posterior identificación en casos positi- vos otras 4 horas, por tanto el tiempo total requerido para la identificación del microorganismo causante de la infec- ción es de 8 horas. Este test además, es capaz de detectar
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que en casos positivos se requiere métodos complementa- rios) y secuenciación (aportan mucha más información so- bre el virus, pero requieren más tiempo y procesos mucho más laboriosos) 28.
Los dos genes más importantes que codifican el virus de la gripe son la hemaglutinina y la neuraminidasa, y pueden ser analizados mediante estas pruebas, además de aportar información sobre la evolución del virus y el grado de rela- ción entre las diferentes áreas geográficas 9. Para la deter- minación de la infección por virus Influenza y virus respi- ratorio sincitial, existen diferentes sistemas de análisis. Uno ellos recibe el nombre de Enigma MiniLab influenza A/B & RSV, su uso está extendido en toda Europa, tiene una dura- ción de 90 minutos, es muy poco laborioso, por lo que no se necesita personal técnico muy cualificado y utiliza hisopos nasofaríngeos como muestra del paciente 29. En el caso de la gripe, se ha observado que los resultados son más sensibles y específicos cuando se emplean técnicas en las que sólo se analiza la presencia de virus Influenza A y B y no aquellos en los que se utilizan técnicas combinadas (múltiples virus y bacterias de forma simultánea) 30.
La neumonía asociada a la comunidad es otra de las enfer- medades respiratorias más frecuentes y con una mortalidad asociada muy elevada (2-14%). El desarrollo de las técnicas moleculares en el diagnóstico de enfermedades infecciosas permite analizar múltiples agentes patógenos posiblemen- te causantes de la neumonía del paciente. Entre los agen- tes causantes de neumonía destacan virus y bacterias, y los principales responsables de neumonía atípica son Legione- lla pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae y Bordetella pertussis. El principal inconvenien-
te en estos casos es la posible contaminación de la mues- tra extraída con bacterias propias del tracto nasofaríngeo. Este problema puede resolverse a partir del uso de PCR basadas en la cuantificación, basándose en datos cuanti- tativos para diferenciar contaminación de infección 31.
El diagnóstico de la tos ferina, enfermedad producida por Bordetella pertussis, se puede realizar mediante técnicas de cultivo microbiológico (pero es difícil y aporta baja sensibilidad), ensayos de inmunofluorescencia y diagnós- tico molecular. El diagnóstico molecular se realiza a partir de la PCR (lo que aporta una mayor sensibilidad y por tan- to mejores resultados en el diagnóstico 7. La mayoría de los sistemas comercializados para el diagnóstico de la in- fección por Bordetella no diferencian entre especies (Bor- detella pertussis y Bordetella holmessi), pero Martini et al. han realizado un estudio añadiendo más dianas al análisis para aportar especificidad y mejorar el diagnóstico de la infección por Bordetella pertussis^32.
Recientemente se ha estudiado una técnica basada en LAMP, que ofrece como ventajas el bajo coste del test, la rapidez con la que se puede obtener el resultado y la no utilización de instrumentos especializados para su reali- zación 33.
3.3. Infecciones gastrointestinales (gastroenteritis y enterocolitis)
Las infecciones gastrointestinales son una de las patolo- gías más frecuentes en atención primaria. Dentro de las infecciones del tracto gastrointestinal podemos diferen- ciar las infecciones producidas por Helicobacter pylori y
Tabla 3. Comparación de diferentes sistemas de análisis con paneles respiratorios. Adaptada de (7).
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las gastroenteritis y enterocolitis. Estas últimas pueden ser producidas por múltiples patógenos, los cuales producen síntomas muy similares, que con frecuencia no son graves y cesan de forma espontánea en poco tiempo 34. Pueden ser causadas por virus, bacterias y parásitos, por lo que estable- cer el agente causal supone un reto en muchos casos, siendo imposible de identificar en muchas ocasiones. Las razones por las cuales en muchas de las ocasiones no se detecta el agente patógeno, utilizando las técnicas microbiología clá- sica, pueden ser: no todos los patógenos se buscan de forma rutinaria (por ejemplo los poco frecuentes), la labilidad de al- gunos microorganismos (por ejemplo, Shigella spp.), la baja sensibilidad del método utilizado o que el microorganismo causante sea un enteropatógeno desconocido.
Tradicionalmente, el diagnóstico se ha basado en el cultivo bacteriano, pruebas microscópicas con el objetivo de iden- tificar huevos y parásitos responsables y técnicas rápidas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo o inmunofluo- rescencia, entre otras. Pero con el desarrollo de las técnicas moleculares, la identificación ha mejorado.
Las técnicas moleculares empleadas en el diagnóstico de infecciones a nivel gastrointestinal pueden realizarse bajo dos enfoques diferentes, el primero de ello, cuando se va buscando un microorganismo concreto y se detectan me- diante PCR uno o varios genes de un mismo microorganis- mo (ej: Clostridium difficile o detección de norovirus) y el segundo, cuando se desconoce el microorganismo causan- te y se busca mediante PCR múltiple al microorganismo o los microorganismos responsables (puede realizarse para la búsqueda de bacterias, virus y parásitos). En este último caso, puede orientarse hacia cada uno de estos grupos de forma independiente, o pueden combinarse. Hay dispo- nibles paneles que incluyen la extracción de la muestra, la amplificación de los fragmentos diana y la detección e identificación de los productos amplificados. Esto permite mayor velocidad en la obtención de resultados y una gran automatización. El problema de estas técnicas es que no pueden distinguir entre la infección y la colonización. Di- versos estudios han demostrado que 27%-33% de las mues- tras que resultan positivas en un panel contienen más de un agente patógeno 7. Además, pueden identificar una carga de patógeno muy pequeña pero esta puede no ser la res- ponsable del cuadro clínico del paciente. Algunos estudios, observan que la cuantificación de la carga genética de en- teropatógenos podría relacionar o no al patógeno encon- trado con el cuadro clínico. Pero para ello, es necesario un método más preciso que cuantifique a los microorganismos enteropatógenos en las heces. En el caso de que se trate de una bacteria, a pesar de los avances, es necesario procesar la muestra para aislarla y realizar pruebas de sensibilidad 5.
Uno de los paneles disponibles se llama FilmArray, está ba- sado en PCR en tiempo real y permite detectar múltiples microorganismos, virus, bacterias y parásitos, de forma si- multánea y con un tiempo de procesamiento de aproxima- damente 1 hora. En el panel de FilmArray se pueden detec- tar 22 patógenos de los cuales, 13 son bacterias, 5 virus y 4 parásitos (Tabla 4). En un estudio realizado por Beal et al. se identificó, mediante el uso de este panel, al menos un mi- croorganismo en un número de muestras mayor al número identificado por métodos convencionales. Además, en este
mismo estudio se observaron coinfecciones en un 28,3% de las muestras 35.
Otro panel ampliamente utilizado en el estudio de mues- tras digestivas para la identificación de agentes patóge- nos es el xTAG (Luminex Assay), cuyos resultados aportan una mayor sensibilidad que la PCR en tiempo real conven- cional (36). En este panel se pueden detectar 11 patóge- nos, 7 bacterias, 2 virus y 2 parásitos (Tabla 4). Para la rea- lización de este panel son necesarios 10μL de muestra de ADN ya purificados. Cuando en la muestra está presente el ADN del microorganismo se emitirá fluorescencia que podrá ser detectada e interpretada teniendo en cuenta la sospecha de la infección. El tiempo de procesamiento de este panel varía entre 5-6 horas incluyendo el tiempo de preparación de la muestra y pueden ser procesadas de forma simultánea 96 muestras 37.
Además, teniendo en cuenta que la muestra biológica más ampliamente utilizada en estos casos son las heces, es posible realizar la PCR digital, que minimiza los nive- les de inhibidores de PCR presentes de forma natural en las heces y que por tanto va a permitir obtener mejores resultados a la hora de identificar el agente causal de la infección 36.
Además de establecer el agente causal de la infección o realizar estudios de sensibilidad a tratamientos farmaco- lógicos, se han realizado estudios moleculares con otros fines. Entre ellos, valorar si el ciclo umbral (Ct) de la PCR en tiempo real pudiera estar relacionado con la grave- dad de la infección y permitiría establecer relación con la mortalidad producida por una infección. Tal es el caso del estudio realizado por Sante et al. en el que se estudia la relación entre el Ct en infecciones producidas por Clos- tridium difficile y la gravedad de la infección, y en el que no se encuentran diferencias significativas entre ambos grupos 38.
Entre los parásitos responsables de patología a nivel di- gestivo destacan diferentes especies de Entamoeba (En- tamoeba histolytica, E. dispar y E. moshkovskii) y de Cryp- tosporidium (Cryptosporidium hominis y Cryptosporidium parvum) y sólo pueden diferenciarse entre sí por métodos moleculares 34.
Los virus que con mayor frecuencia se asocian a patolo- gía digestiva son: rotavirus, astrovirus, adenovirus y no- rovirus. Para su diagnóstico también son importantes los métodos moleculares. Las técnicas moleculares se basan en la PCR o RT-PCR (en función de si el virus es de ADN o ARN, respectivamente) y permiten diferenciar serogrupos diferentes 34. Uno de los ensayos comercializados especí- fico para norovirus es Quantitative genogroup II (basado en RT-PCR) 39.
En el caso de las bacterias, las bacterias mayormente im- plicadas en cuadros digestivos son: Clostridium difficile, Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Vibrio, Yersinia, Cam- pylobacter spp. y Helicobacter pylori. Las cepas patógenas de Clostridium difficile producen dos toxinas, A y B, res- ponsables de la patogenicidad y pueden detectarse en muestras biológicas mediante PCR con alta especificidad y sensibilidad, aunque el coste económico es elevado 40.
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genos son responsables de cuadros gastrointestinales que pueden dar lugar a grandes complicaciones en la salud de los pacientes. Dentro de los patógenos que se transmiten por alimentos podemos encontrar dos grupos:
- Patógenos que se multiplican dentro del tracto gastroin- testinal (algunos ejemplos son: Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio parahemolycus, Yersinia enterocolitica, especies termófilas de Campylobacter spp., Escherichia coli entero- patógena y Streptococcus spp.).
- Patógenos causantes de la patología por producción de toxinas (algunos ejemplos son: Bacillus cereus, Staphylo- coccus aureus y Clostridium botulinum).
Los métodos moleculares pueden detectar la presencia de estos microorganismos directamente del alimento, sin utilizar medios selectivos para su aislamiento, por lo que el tiempo de obtención de resultado es corto. Si se quiere obtener una mayor concentración de ADN sería necesario realizar una etapa previa, de enriquecimiento con el que se conseguiría una mayor sensibilidad. Las técnicas utilizadas con más frecuencia son: PCR, qPCR, microarrays, secuencia- ción y electroforesis en gel. 11
3.4. Infecciones que afectan al Sistema Nervioso Central
Las principales patologías que afectan al sistema nervioso central (SNC) y resultan de interés a nivel microbiológico son la meningitis y la encefalitis de origen infeccioso. Se tra- ta de dos patologías muy importantes, con muchas compli- caciones y secuelas asociadas. Las infecciones del sistema nervioso central están asociadas a una gran morbimortali- dad, por eso, los diagnósticos clínico y microbiológico son de vital importancia, para instaurar un tratamiento precoz y eficaz. La muestra utilizada en estos casos es el líquido ce- falorraquídeo, donde además de las pruebas microbiológi- cas clásicas (tinciones de Gram, Ziehl-Neelsen, tinta china, detección de antígenos y diferentes cultivos) se realizan técnicas moleculares. El cultivo de estas muestras continúa siendo la prueba de referencia para el diagnóstico de bac- terias y hongos, mientras que la extracción de ADN con la posterior amplificación se utiliza de forma rutinaria para el diagnóstico de virus.
Las técnicas moleculares favorecen el diagnóstico y la mo- nitorización de la meningitis, aunque sigue siendo necesa- rio el cultivo para determinar la sensibilidad de los microor- ganismos a los antibióticos. Permiten dirigir el tratamiento en función del agente patógeno (ya sea bacteriano o vírico), aunque esta información ya puede orientarse con el análi- sis bioquímico y celular del líquido cefalorraquídeo. Actual- mente existen en el mercado paneles de detección múltiple de microorganismos responsables de infecciones a nivel del sistema nervioso central 5.
Uno de estos paneles (FilmArray panel de meningitis y en- cefalitis de BioFire Diagnostics) analiza la presencia de 16 agentes patógenos, entre los que se incluyen bacterias, virus y hongos. Para ello, necesita aproximadamente 200 microlitros de muestra de líquido cefalorraquídeo y emplea una hora para llegar al diagnóstico. Los microorganismos que incluye este panel son:
- Bacterias: Escherichia coli K1, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Strepto- coccus agalactiae y Streptococcus pneumoniae.
- Virus: Citomegalovirus, Enterovirus, Virus del Herpes Simplex tipo 1, Virus del Herpes Simplex tipo 2, Herpes virus tipo 6, Parechovirus, virus de Epstein-Barr y virus de la Varicela-Zoster.
- Hongos: Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii.
Aunque los datos recogidos hasta ahora sobre el uso de este panel reflejan buenos resultados (diagnóstico más precoz, mayor sensibilidad y mayor especificidad), no es posible aún dejar de realizar las pruebas rutinarias 45. El cultivo y la tinción de Gram se siguen realizando para de- tectar microorganismos no incluidos en el panel y para la realización de pruebas de sensibilidad a antibióticos. Por otro lado, la detección del antígeno criptocócico se sigue realizando para el diagnóstico de meningitis por Cryptococcus como método de referencia. Aun cuando el panel es negativo, si se tiene alta sospecha de meningitis bacteriana o encefalitis es necesario incluir tratamiento empírico 7,^.
3.5. Infecciones de transmisión sexual
Las infecciones de transmisión sexual (ITS) están asocia- das a una elevada morbilidad y mortalidad, comprome- ten la salud sexual y reproductiva y facilitan la aparición de otras enfermedades 47. La aparición de tratamientos an- tirretrovirales para el VIH hizo que la población abandona- se el uso de preservativos como método para prevenirlo. Además del VIH, el preservativo previene la infección de otras múltiples enfermedades infecciosas, por lo que su uso aún sigue siendo necesario. El desuso ha ocasionado un gran incremento en la incidencia de las ITS. Las pobla- ciones más susceptibles son los hombres que practican sexo con hombres, la prostitución (tanto masculina, como femenina) y los heterosexuales que mantienen relaciones sexuales con múltiples parejas.
El diagnóstico precoz de estas infecciones, además de evitar el avance de la enfermedad en el propio paciente afectado, también permitiría la prevención de la transmi- sión y diseminación de la infección de forma rápida, por lo que el diagnóstico se realiza con estos dos fines. Entre las técnicas clásicas de diagnóstico, muchas de las cuales todavía se usan, se incluyen la tinción de Gram del exu- dado uretral (para la uretritis gonocócica), del exudado vaginal (para la vaginosis bacteriana), el examen en fres- co del exudado vaginal (para el diagnóstico de infección por Trichomonas vaginalis o Candida spp.) o la microsco- pía en campo oscuro (para la sífilis primaria), entre otros 47. El diagnóstico por medios microbiológicos es complejo, debido a que muchos de los microorganismos causantes requieren condiciones muy especiales para el cultivo, al- gunos no son cultivables (como es el caso de Treponema pallidum), otros son muy sensibles a las condiciones am- bientales y producen falsos negativos (Neisseria gonorr- hoeae)… Además también se siguen utilizando muchas pruebas serológicas 48.
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En los últimos años, se han abierto paso las nuevas técnicas basadas en la biología molecular, en concreto en la reacción en cadena de la polimerasa. A partir de muestras genitouri- narias (orina, exudado uretral y exudado cervical) se ha con- seguido extraer ADN de los microorganismos responsables de la patología y esto supone una de las grandes ventajas de estas técnicas, el uso de muestras no invasivas, además de la posibilidad de detectar patógenos de difícil cultivo o genes de resistencia. La alta sensibilidad ha hecho que se mejoren los programas de cribado y se tenga un mayor con- trol de la población afectada 48. Según las recomendaciones del Centro de Control de Enfermedades (CDC) la muestra óptima en la mujer es el exudado vaginal y en el hombre es la orina.
Entre las técnicas que se pueden usar se encuentran la PCR convencional, la PCR a tiempo real, la PCR múltiple, la LAMP y la detección múltiple mediante microarrays. Se em- plean estas técnicas en el diagnóstico de infecciones pro- ducidas por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma spp, Trichomonas va- ginalis, Candida spp., Gardnerella vaginalis y Lactobacillus, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, virus del herpes simple 1 y 2, entre otros). Actualmente existen diferentes paneles, que pueden detectar la presencia de siete o más patógenos 5.
Clamidias
C. trachomatis es la bacteria más frecuente responsable de estas infecciones. Afecta principalmente a jóvenes y en muchos casos lo hace de forma asintomática, llegando a producir grandes complicaciones sin haber alcanzado un diagnóstico previo. El primer sistema basado en la detec- ción de ácidos nucleicos para la detección de C. trachomatis se desarrolló en 1993, y desde entonces se han ido desa- rrollando sistemas que aportan diferentes mejoras en el proceso de identificación del microorganismo. Entre ellas, la posibilidad de detección conjunta de C. trachomatis y N. gonorrhoeae, ya que se trata de dos microorganismos que producen coinfecciones en más del 50% de los jóvenes 49.
Gonococia
La detección de Neisseria mediante métodos moleculares es más sensible que el cultivo y se puede usar diferentes muestras para su detección, entre ellas muestras uretrales, orina, muestra endocervical o vaginal. La muestra de orina en la mujer es mucho menos sensible y no se considera ade- cuada para el diagnóstico 47. En el caso de N. gonorrhoeae cabe destacar el desarrollo de genes de resistencia al trata- miento antimicrobiano y las ventajas que la biología mole- cular aporta a este hecho. Con estas técnicas se están desa- rrollando métodos de detección de resistencia a penicilina, a ciprofloxacino, a azitromicina y a otros antibióticos 48.
Sífilis
Para el diagnóstico de la sífilis (producida por Treponema pallidum) hasta ahora se han utilizado técnicas como la mi- croscopia de campo oscuro y la inmunofluorescencia direc- ta, que se consideran métodos de baja sensibilidad y han
dado pie el desarrollo de nuevas técnicas, basadas en la biología molecular. Las nuevas técnicas para el diagnósti- co amplifican el ADN del microorganismo mediante PCR y utilizan como diana distintos genes que codifican lipopro- teínas (bmp, tpp47, tmpA o 4D) 48. Otros genes utilizados en el diagnóstico de la sífilis son el gen polA, TpN47 y el gen 16S ARNr, que tiene un gran número de copias por célula 50. Se pueden emplear diferentes muestras biológi- cas para su diagnóstico mediante métodos moleculares, como son muestras orales y muestras extragenitales y ge- nitales 47.
Virus del herpes simplex
El virus del herpes simplex 1 está asociado principalmente a infecciones orolabiales, mientras que el tipo 2 está más asociado a infecciones genitales. Las técnicas moleculares han permitir mejorar en gran medida la sensibilidad con respecto al cultivo. Para el diagnóstico de ambos virus se puede utilizar la PCR en tiempo real teniendo como dia- nas secuencias conservadas de genes que codifican pro- teínas para la ADN polimerasa y timidina-cinasa (comunes a VHS-1 y VHS-2) o glucoproteínas de superficie (gG, gD y gI), que ayudan a su identificación 48.
Tricomoniasis
En el diagnóstico de la tricomoniasis (producida por Tri- chomonas vaginalis) se pueden utilizar diferentes técni- cas: PCR convencional, PCR en tiempo real, PCR isotérmica dependiente de la helicasa, PCR múltiple, RAPD y MLST, entre otras. Con esta última técnica, se pueden analizar los diferentes genotipos y aunque no parecía haber relación entre el genotipo y el sexo y la edad, se ha encontrado que el genotipo II posiblemente circula en redes sexuales de alto riesgo 51. El sistema BD Affirm VP III permite detectar la presencia de Trichomonas vaginalis con una sensibilidad del 89,2% y especificidad que ronda el 100% 47.
Virus del papiloma humano
Otra de las enfermedades más frecuentes de transmisión sexual es el virus del papiloma humano, cuya gravedad puede variar desde ser asintomático hasta producir cán- cer de cuello de útero, vagina, ano, pene y cáncer orofarín- geo, por lo que la necesidad de establecer de forma precoz el diagnóstico es fundamental para evitar la progresión de la infección. Se han desarrollado diversos ensayos basa- dos en la amplificación del DNA o amplificación median- te sondas y de todos ellos, hay 5 aprobados por la FDA: Hybrid Capture 2® de Digene, Cervista HPV HR® y Cervista HPV16/18® de Hologic, que se basan en amplificación de la señal; Cobas HPV Test® de Roche Diagnostics y Aptima HPV Assay® de Hologic, basados en amplificación de la diana, y Aptima HPV, basada en la detección de ARNm de E6/E7 (48). El virus del papiloma humano tiene diferentes genotipos, considerados de bajo o alto riesgo en función de las complicaciones que pueden ir asociadas a la infec- ción. Se recomienda utilizar aquellos sistemas que sean capaces de diferenciar entre los genotipos, al menos 16 y 18 que son los mayormente asociados a neoplasias 9.
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el diagnóstico de infecciones fúngicas. Esta técnica aporta sensibilidad y especificidad suficiente para identificar este microorganismo en muestras clínicas 57.
Para el diagnóstico de algunas especies de hongos pueden utilizarse los sistemas Septifast de Roche®, Magicplex Sepsis Real Time, SeptiTest y VYOO. La mayoría de estos sistemas (ya comentados previamente en el diagnóstico de pacien- tes sépticos) utilizan para la identificación de hongos las se- cuencias entre el 18S y el 5,8 S. Con estos sistemas pueden identificarse 5 especies diferentes de Candida spp. y Asper- gillus fumigatus en un periodo de tiempo que varía de un sistema a otro pero que ronda las 5-8 horas 23.
Otros sistemas que pueden emplearse, aunque estos son más concretos y van dirigidos a especies concretas de hon- gos son: MycAssay Aspergillus (que permite identificar has- ta 15 especies diferentes del género Aspergillus, entre ellas A. fumigatus) 57 y MycAssay Pneumocystis (capaz de iden- tificar Pneumocystis jirovecii, patógeno capaz de producir neumonía de forma frecuente en pacientes con VIH o inmu- nodeprimidos) 58.
En el caso de Aspergillus, el ensayo comercial para su identi- ficación más utilizado es el MycAssay, útil para muestras de suero/plasma, tejido y lavado broncoalveolar, siendo esta última la muestra con mejores resultados de sensibilidad y especificidad 57.
Lewis White et al. comparan resultados de PCR en plasma y suero y obtienen resultados mucho más sensibles en plas- ma (94,7%) que en suero (68,4%) 59. La utilización del PCR cuantitativa mediante Light Cycler también permite a partir de las curvas de melting establecer el diagnóstico entre di- ferentes especies 60.
Además de la PCR convencional, en el diagnóstico de estos microorganismos se pueden utilizar otras técnicas como qPCR, LAMP, FISH o secuenciación del DNA (donde hay re- cogida en bases de datos información de hasta 5000 espe- cies fúngicas) y una técnica llamada Peptide Nucleic Acid Fluorescent In Situ Hybridation (PNA-FISH) 61. Esta última se ha visto que aporta buenos resultados de sensibilidad y es- pecificidad y permite identificar diferentes especies hongos. Los PNA son estructuras artificiales de poliamidas resisten- tes a la degradación por nucleasas y proteasas que se unen de forma compleja y estable a ADN o ARN complementario. Los PNA se marcan con fluorescencia y 2,5 horas después se puede identificar al microorganismo causante de la infec- ción a través de un microscopio de fluorescencia 38,^.
Las técnicas moleculares permiten tanto identificar como realizar estudios de sensibilidad a tratamientos farmacoló- gicos de los hongos causantes de infecciones, otra de las principales causas de mortalidad asociadas a este tipo de microorganismos 57.
3.7. Enfermedades producidas por parásitos
El diagnóstico rápido de una infección por parásitos puede jugar un papel crucial en el tratamiento y el pronóstico del paciente, sobre todo en aquellos casos en los que la pato- logía es grave y tiene asociada una alta mortalidad, como la malaria. El diagnóstico tradicional de la infección parasitaria
se ha realizado mediante observación al microscopio. A día de hoy, esto sigue siendo fundamental, pero se han abierto paso las técnicas basadas en la biología molecular en el diagnóstico de enfermedades parasitarias por su ele- vada sensibilidad y especificidad.
A la hora de realizar estas técnicas moleculares es necesa- rio tener en cuenta que hay muchos factores que dificul- tan el proceso, entre ellos:
- El proceso de extracción del ADN puede no ser fácil en algunos de los casos, especialmente en aquellos en los que la infección está producida por larvas con caracte- rísticas físicas que las hacen resistentes a la rotura (por ejemplo larvas de Strongyloides spp.).
- Las muestras de heces normalmente utilizadas contie- nen gran cantidad de restos que pueden inhibir el pro- ceso de amplificación del ADN.
- La eliminación de parásitos en las muestras es escasa e intermitente, por lo que se pueden obtener resultados falsos negativos 63.
La PCR en tiempo real asociada al análisis de alta resolu- ción de fusión (High Resolution Melting-HRM) es una téc- nica basada en las diferencias en los nucleótidos del frag- mento amplificado, que dará lugar a una temperatura de fusión diferente según la secuencia. Esta técnica se emplea en la detección y determinación del genotipo del parásito y de genes responsables de resistencia al tratamiento far- macológico 64. Con la PCR digital se pueden identificar en diferentes tipos de muestras infecciones producidas por diferentes parásitos, entre ellos: Ascaris lumbricoides, Cryp- tosporidium o Schistosoma, entre otros 65.
Malaria
La malaria puede ser producida por diferentes especies del género Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. knowlesi, P. ovale wallikeri y P. ovale curtisi). De todas ellas, la más grave y que causa una alta mortalidad es la producida por P. falciparum. Las técnicas básicas del diag- nóstico son la gota gruesa y la extensión final de sangre con tinción de Giemsa. Pero en este proceso diagnóstico también son importantes las técnicas moleculares (PCR convencional multiplex y PCR en tiempo real). La PCR mul- tiplex es la técnica más sensible y permite confirmar cual es la especie de Plasmodium responsable de la infección. Además, permite diagnosticar malarias que no podrían detectarse al microscopio, infecciones mixta y permite di- ferenciar la infección de P. knowlesi de P. falciparum (que morfológicamente son muy parecidas) 66. Además de la PCR se han probado diferentes kits comerciales para el diagnóstico de la malaria mediante FISH. Los diferentes ensayos son capaces de detectar al parásito en todos sus estadios, incluyendo el gametocito, a partir de una mues- tra de sangre total del paciente, sin previa extracción de ADN y en un tiempo aproximado de una hora. Esta técnica únicamente permite obtener información de los parásitos que se encuentran vivos en la muestra 67. La técnica más reciente es la PCR digital y esta es extremadamente sen- sible, capaz de detectar parasitemias muy bajas de Plas- modium^65.
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Toxoplasmosis
La infección por Toxoplasma gondii en el embarazo puede dar lugar a complicaciones graves como muerte intrauteri- na, hidrocefalia o retraso mental. Ante una sospecha de in- fección en la embarazada es necesario realizar estudios para confirmar el diagnóstico, para ello, además de las técnicas se- rológicas es necesario realizar un estudio basado en técnicas moleculares (PCR o PCR en tiempo real). Este análisis puede realizarse en la placenta, en sangre de cordón o en sangre del recién nacido en caso de haber finalizado la gestación^68.
Leishmaniasis
La leishmaniasis es otra enfermedad producida por pará- sitos del género Leishmania y que puede tener diferentes cuadros clínicos (leishmaniosis visceral, cutánea y muco- cutánea). Existen más de 20 especies de Leishmania que pueden ser responsables de la infección. El diagnóstico de rutina se basa en la observación al microscopio, pero la sen- sibilidad es baja. En cambio, las técnicas moleculares apor- tan alta sensibilidad y especificidad y se basan en la realiza- ción de PCR y PCR a tiempo real 69.
Enfermedad de Chagas
Trypanosoma cruzi es el parásito responsable de la enferme- dad de Chagas. Las técnicas moleculares son importantes, especialmente, en el diagnóstico de mujeres embarazadas para evitar la transmisión al feto y en pacientes con otras infecciones como el VIH. La PCR, PCR a tiempo real y LAMP son tres de las técnicas que permiten detectar al parásito en muestras de sangre de pacientes con elevada sensibilidad y especificidad, así como el seguimiento de la enfermedad en respuesta al tratamiento farmacológico 70. En este caso, la PCR digital no ofrece ninguna ventaja adicional sobre la PCR en tiempo real 65.
3.8. Enfermedades producidas por micobacterias
Las micobacterias son un grupo de microorganismos de gran importancia clínica, que incluyen múltiples especies causantes de patologías con alta morbilidad y mortalidad, entre ellas, la tuberculosis (producida por Mycobacterium tu- berculosis) y la lepra (producida por Mycobacterium leprae). Además, existe el complejo de micobacterias no tuberculo- sas (MNT), que pueden ser oportunistas o saprófitas (se han relacionado con infecciones pulmonares, dermatológicas e infecciones más severas en pacientes inmunodeprimidos) y que se ha visto que presentan una mayor resistencia a los antimicrobianos convencionales.
Para el diagnóstico de la tuberculosis se pueden utilizar muestras pulmonares, como el esputo, y extrapulmonares, como la orina y el líquido cefalorraquídeo. En el caso de este último, es importante que el recipiente utilizado para su re- colección no contenga heparina, que el líquido no sea he- mático o xantocrómico, pues la heparina, la hemoglobina y la bilirrubina son inhibidores de la PCR y favorecerían la aparición de resultados falsos negativos 71.
Además de las formas clásicas de identificación de estos microorganismos, se han desarrollado nuevas técnicas ba-
sadas en la amplificación de ácidos nucleicos. Estas se consideran actualmente un complemento a las técnicas convencionales (baciloscopia y cultivo) y pueden utilizar- se tanto para la identificación como para la determina- ción de resistencias a antimicrobianos.
El método Xpert MTB/RIF es un método molecular basado en PCR a tiempo real que permite la detección de tuber- culosis y la resistencia de la micobacteria a la rifampicina en menos de 2 horas, utilizando un cartucho de plástico desechable que contiene en su interior los reactivos ne- cesarios para la lisis de la micobacteria, la extracción de ADN, la amplificación de los genes diana y la detección de los resultados para su posterior interpretación 72. Se ha detectado cierta falta de sensibilidad en el caso de deter- minar resistencia a la rifampicina y esto ha hecho que se desarrollen nuevos métodos, entre ellos el Xpert MTB/RIF ultra. Este nuevo sistema, amplifica otras regiones dife- rentes y tiene una sensibilidad mucho mayor, pudiendo detectar 16 UFC/ml (114 UFC/ml en el método Xpert MTB/ RIF). A pesar de las mejoras en la sensibilidad, un estudio que compara ambos sistemas obtiene como resultados una mejora en la sensibilidad a expensas de una ligera disminución de la especificidad. La técnica ultra resulta importante en la detección de tuberculosis en pacientes infectados además por VIH, en pacientes pediátricos o en pacientes con tuberculosis extrapulmonar 73.
Los métodos moleculares utilizados hasta ahora no per- miten la cuantificación del patógeno. Para el seguimiento y monitorización del paciente se recomienda el uso de métodos que permitan cuantificar la carga bacteriana del agente patógeno, es por ello, por lo que se han realizado pruebas basadas en PCR digital, que permitirían la cuan- tificación 74.
4. CONCLUSIONES
Las enfermedades infecciosas son una causa muy fre- cuente de patología en la sociedad. La gran cantidad de agentes patógenos capaces de producir infección hace que el diagnóstico sea complicado, la clínica que pro- ducen muchos microorganismos es común y por eso, se necesitan técnicas diagnósticas para la identificación del agente infeccioso.
Las técnicas tradicionales basadas principalmente en el cultivo o en la detección de antígenos requieren en la ma- yoría de los casos condiciones específicas y mucho tiem- po para llegar a la identificación del microorganismo. Una de las alternativas que cumple con las características de proceso de identificación ideal es la biología molecular: proceso rápido, sensible y específico, utilizando un volu- men de muestra pequeño, sin condiciones especiales de extracción, transporte y conservación… Estas técnicas es- tán en continuo desarrollo, lo que permite disminuir sus desventajas y mejorar su uso.
Entre las técnicas diagnósticas destacan la PCR en tiem- po real o cuantitativa, la RT-PCR, los microarrays y la se- cuenciación. Estas técnicas permiten abordar el proceso diagnóstico de diferentes maneras, dirigido a un único agente patógeno o mediante la utilización de paneles
Técnicas de biología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas^ NPunto
