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Trabajo escrito sobre las tecnicas histologicas
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
1 / 23
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¡No te pierdas las partes importantes!
Participante: Valentina Pérez
C.I: 30.258.
Profesor: Ricardo Torres
Unidad curricular: Histología
Sección: 2
Valera, Julio 2021
1) Definición de la Técnica Histológica
Se denomina TÉCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios fotónicos, posibilitando la observación de estructuras no visibles al ojo humano, es la serie de pasos ordenados que permiten preparar al tejido para su observación a través del microscopio. El tejido se prepara para su observación de acuerdo con el tipo de microscopio que será utilizado.
En el caso de la microscopía de campo claro, la técnica más común para preparar las muestras es la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina. En este proceso, las muestras se infiltran en parafina, con el fin de que tengan la consistencia adecuada para obtener los bloques con las muestras o especímenes. Una vez que se tienen los bloques (inclusión), éstos se cortan en un equipo que se llama micrótomo y con el que se obtienen cortes muy delgados (micrómetros de espesor) lo que permite observar las estructuras celulares y tisulares. Un paso más allá que ofrece la información más detallada corresponde al momento de aplicar la tinción, que da colores a la muestra y gracias a ello es posible identificar diversas estructuras mediante la observación de estas preparaciones con el microscopio de campo claro.
Pasos de la técnica histológica:
a) Obtención del material: se efectúa mediante biopsia, necropsia o autopsia.
Biopsia: consiste en tomar un trozo de tejido de un ser vivo. Este procedimiento de uso frecuente en medicina requiere el mismo cuidado de asepsia, antisepsia, etc., que se utiliza en todo acto quirúrgico menor o mayor.
Necropsia: es el procedimiento en el cual se extrae material de un cadáver
Autopsia: consiste en el estudio analítico y sistemático completo. macroscópico y microscópico de los órganos, aparatos y sistemas de un cadáver. Se realiza para establecer causas de muerte.
b) Fijación: una vez obtenido el material que se desea estudiar por cualquiera de los procedimientos descriptos se procede a su fijación con lo que se evita la destrucción o lisis celular. Es un proceso físico químico complejo por el cual se mantiene a las estructuras orgánicas en el estado más parecido al que poseían en vida.
Los objetos de la fijación son:
Mantener las estructuras en el estado más parecido al que poseían in vivo. Evitar la lisis celular y la proliferación bacteriana Dar cierta solidez o dureza al tejido o material. La fijación detiene los procesos vitales pero en ciertas condiciones mantiene las actividades de algunos componentes moleculares, por ejemplo la actividad de algunas enzimas
Tipos de fijadores
- Físicos : Por ebullición. Por congelación: bajas temperaturas de – 190ºC a -70ºC (Nitrógeno líquido. dióxido de carbono) permiten excelentes fijaciones**.
c) Deshidratación: se coloca la muestra en alcoholes de concentración creciente para eliminar el agua que contenga ya que la parafina no es miscible con agua. Se utiliza etanol 70%, 80%, 96% y 100%. d) Aclaración: son solventes que producen transparencia en los tejidos, además de solubilizar la parafina. Entre ellos se encuentran. xilol. toluol. acetona, benceno. El más usado es el Xilol.
m) Aclaración: se utiliza xilol o benzol, y sirve para diluir la resina adhesiva utilizada para pegar el cubre objeto. n) Colocación de cubreobjeto: se cubre el corte con un delgado vidrio (el cubreobjeto) que se adhiere con resina (bálsamo de Canadá) y permite su uso prolongado.
2) Métodos de examen
a) Método de examen inmediato (in vivo): Animales microscópicos uni o multicelulares, células libres de animales superiores (descamadas naturalmente, por raspado o por extracción, por pincelamiento, etc.), componentes celulares que quedan libres por métodos que desintegran la célula (mitocondrias, núcleo, membrana plasmática), órganos muy delgados (mesenterio, o cortes finos directos de tejidos como el cartilaginoso), células obtenidas de cultivos de tejidos. En éstos casos, para evitar la desecación y prolongar las posibilidades de observación, se agregan líquidos como suero sanguíneo, suero fisiológico a temperatura semejante a la del animal, usando platinas calientes a 36º - 37º C
b) Examen mediato o de post mortem:
Exigen la muerte de las células y seguir una serie de pasos que constituyen la Técnica Histológica Universal, ya que se utiliza en todos los laboratorios y sus resultados se interpretan de la misma manera. A la hora del exámen post-mortem deben tomarse notas claras y si existe alguna razón para que se realice un juicio o algún tipo de litigio debido a la muerte del animal, las notas deben ser mucho más completas y deben indicar:
El lugar, la fecha y la hora del exámen post-mortem, así como el nombre completo y la dirección de la persona que autoriza dicho exámen. Una descripción de la muerte del animal y datos como la especie, la raza, el sexo, la edad y medios posibles para su identificación. Hora de la muerte ( si se conoce) El estado del cuerpo: rigor mortis, calor del cuerpo, timpanismo y protrusión del recto, signos de putrefacción. Anormalidades externas, incluyendo evidencias de parasitismo en la piel.
Para iniciar el exámen post-mortem se hace una inspección de todo el cuerpo del animal. Si es posible deben inspeccionarse también los alrededores del lugar donde apareció muerto y buscar cuidadosamente en él signos de lucha antes de la muerte, presencia de peligros como cables de alto voltaje y plantas venenosas. Debe tenerse también muy en cuenta la posición del cuerpo y su estado general de acuerdo al tiempo que se supone que lleva muerto.
Para comenzar la operación se practica una incisión en la piel, desde la sinfísis hasta la pelvis; en el caso de las vacas, la incisión debe continuar a ambos lados de las ubres, de manera que estas puedan ser liberadas de la piel.
Debe observarse bien el estado del tejido subcutáneo. Luego, en el caso de la hembra, se sacan las glándulas mamarias y se examina la región inglinal en ambos lados.
La pared abdominal se comienza a cortar desde el cartílago xifoide hasta la pelvis, haciendo un corte transversal en un flanco desde la incisión longitudinal ya practicada en la región lumbar, extrayendo los dos cachetes que allí se forman. Hay que observar bien si hay presencia de fluídos u otras sustancias anormales en la cavidad abdominal y siempre tomar muestras de ellos para su posterior análisis en el laboratorio.
Más adelante se extraen los órganos abdominales. Primero hay que hacer una ligadura en dos lugares del recto y en dos lugares del duodeno; luego se hace una incisión a cada uno entre las ligaduras. A continuación, se extraen los intestinos con su contenido.
En la hembra se extraen los ovarios, el útero y la vagina, junto con la vejiga. Todos esos órganos deben examinarse con sumo cuidado.
Otro paso es separar la lengua de la mandíbula y extraerla junto con la laringe, la traquea, los pulmones y el corazón. Cada uno de estos órganos debe ser examinado por separado, así como la región de las glándulas linfáticas.
En los rumiantes se practica una incisión en el rumen, se examina su contenido, se toman muestras y luego se vacía. Luego se examinan el retículo y el omaso. La curvatura grande del estómago se corta y se vacía su contenido en un recipiente.
El estómago se abre y se inspecciona la membrana mucosa; en los rumiantes se examina buscando evidencias de helminitis parasitaria e incluso se toman muestras para ulteriores exámenes microscópicos.
Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios ópticos que hemos mencionado anteriormente.
Tipos de colorantes:
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente, mientras que en los ácidos, el colorante es el ion cargado negativamente.
Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, va que la mayor parte de las células microbianas Poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Materiales:
Tubo con suspensión bacteriana. Tubo con suspensión de levaduras. Láminas portaobjetos. Láminas cubreobjetos. Colorante Azul de Metileno. Asa de platino, Aceite de Cedro, mechero, asa de siembra.
Procedimiento:
Con el asa, tome una pequeña porción de la suspensión bacteriana y realice un frotis que no debe ser ni muy grueso ni muy fino. Repita el procedimiento con la suspensión de levaduras. Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama muy suavemente, para obtener la fijación del frotis. Cubra, la preparación con dos o tres gotas de azul de metileno, dejando que el colorante actúe por un minuto, luego lave la preparación con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis.
Seque y observe al microscopio usando el lente de inmersión. Anotar en el protocolo
4) Examen con coloración vital:
Usando soluciones muy diluidas de colorantes no tóxicos, que se introducen por vía digestiva o por inyecciones, o que actúan sobre células libres.
a) Técnicas de coloración para proteínas: Se basan en el reconocimiento y localización de determinados aminoácidos o bien se utilizan anticuerpos específicos marcados para determinadas proteínas.
b) Técnicas de coloración para nucleoproteínas y ácidos nucleicos: Para identificar al ADN y ARN se cuenta con dos métodos:
Métodos comunes a ambos ácidos nucleicos: A través del uso de colorantes nucleares o básicos como la Hematoxilina, Azul de metileno o de Toluidina; a través la absorción de rayos ultravioletas de determinadas longitudes de onda; o bien, con el empleo de isótopos radioactivos, como timidina tritiada que pone en evidencia la Timina del ADN, o uridina tritiada para demostrar Uracilo en el ARN Métodos de identificación diferencial: REACCIÓN DE FEULGEN O DE FEULGEN – ROSEMBECK: Es específica para ADN, pues depende del azúcar Desoxirribosa. Tras una hidrólisis ligera por la acción breve sobre los cortes de ácido clorhídrico diluido, se logra la extracción del ARN y la desintegración de la unión desoxirribosa – purina, con liberación de grupos aldehídos, sobre los cuales actúa el reactivo de Schiff (fucsina básica decolorada con anhídrido sulfuroso), con el que se tratan los cortes. Se obtiene un color púrpura o violeta oscuro en las estructuras que contienen ADN, color tanto más marcado, cuanto mayor es su concentración. Se demuestra así la ubicación del ADN en la cromatina de núcleos interfásicos, en cromosomas durante la mitosis, y muy pequeña cantidad en mitocondrias y en los cloroplastos de las células vegetales
c) Técnicas de coloración para Hidratos de Carbono: Se utilizan los siguientes métodos:
Reacción de PAS (Peryodic acid Schiff): Se basa en la liberación de grupos aldehídos por la acción oxidante del ácido periódico y su evidencia ulterior por medio del reactivo de Schiff. Tiñe de rojo o rojo púrpura a las estructuras que han liberado los aldehídos.
Conservación de las muestras:
En general, puede decirse que si lo encontrado en el exámen post-mortem sugiere la existencia de bacterias o septicemia antes de la muerte, debe enviarse al laboratorio un hueso grande, intacto, como ya se explicó en este trabajo con anterioridad, para su exámen bacteriológico.
Si se sospecha de envenenamiento, el material debe incluir el contenido del estómago y porciones de este, del hígado y de los riñones.
En el caso de los rumiantes, deben enviarse además el contenido del rumen y el abomaso y porciones de estos. Cada órgano debe ir en recipiente aparte.
Los contenedores de los órganos deben ser de cristal, con tapas que cierren de forma hermética y luego deben introducirse en cajas lo suficientemente grandes que permitan rodear al contendor de los órganos con ciertos materiales aislantes y absorbentes.
El paquete debe tener una etiqueta bien clara explicando su contenido, el nombre y la dirección completa de quien lo envía, la naturaleza del exámen que debe practicársele.
Al laboratorio debe enviarse en un sobre aparte una carta con todos estos datos y otros que puedan ser de interés.
El material que va a ser químicamente analizado no debe llevar preservo de ningún tipo pues lo deteriora. Los tejidos que van a ser seccionados para exámen histológico deben envolverse en una tela bien limpia, humedecida con una solución de formalina al 5%.
Es fundamental que el material que se envíe para un exámen bacteriológico, llegue al laboratorio cuando aún esté fresco.
Debe utilizarse hielo cuando vayan a existir demoras en el traslado o cuando la temperatura sea cálida y pueda atentar contra su buena conservación.
6. Proceso de fijación:
Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es Detener la vida de las células e impedir las modificaciones post morten que pueda sufrir la célula (procesos autolíticos), manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos. Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles.
Esta acción garantiza la integridad de las células y tejidos; se efectúa por mediante agentes químicos denominados fijadores. Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos:
a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de potasio, ácido crómico, bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido acético.
b) Reductores: el formaldehído, el glutaraldehído, el alcohol etílico, el alcohol metílico
Condiciones de un buen fijador:
Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y adecuada sus funciones debe poseer las siguientes condiciones:
Matar inmediatamente a las células, impidiendo la aparición de los procesos autolíticos. Para tal fin el fijador debe poseer: Un buen poder de penetración, que en contados instantes se introduzca con rapidez en el espesor de la muestra Un buen poder de difusión, que no fije sólo la porción superficial de la muestra sino que alcance las porciones más profundas de la misma. Producir cierta dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retracción o hacerlos quebradizos y friables. Debe de ser de fácil manipulación. No debe disolver componentes celulares. Que sea fácil de conseguir y que sea barato.
Hay multitud de formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de éstos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qué tipo de tejido queremos fijar y qué queremos ver de dicho tejido. Junto con las sustancias fijadoras también se añaden a las mezclas otros componentes que afectan a otros parámetros como la osmolaridad o el pH de la solución. Fijaciones muy prolongadas endurecen el tejido y pueden provocar inestabilidad de los ácidos nucleicos. Parte del fijador del tejido se puede eliminar mediante lavados prolongados. Normalmente se usa en solución tamponada e isotónica.
7) Proceso de lavado de la muestra
Al concluir la fijación, el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal fin se procede al lavado de los tejidos mediante agua o alcohol. Se evita, así, que los tejidos se endurezcan demasiado o que ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan una adecuada obtención de secciones delgadas o la coloración correcta de sus componentes celulares
8) Proceso de inclusión de parafina o celoidina
Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio. Ello implica hacer secciones para teñirlas primero y posteriormente observarlas. Normalmente se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones. La regla general es que cuanto más delgada queramos una sección más consistente debe ser la muestra de la que se obtiene. La inclusión es el método más común de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las características del tejido.
La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos están formados principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica que para que la parafina líquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgánico.
Esto se consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes, normalmente etanol. La deshidratación debe ser completa porque de no ser así afectará a la infiltración posterior de la parafina.
Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el alcohol de 100° como con la parafina, denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el óxido de propileno, entre otros.
Por último se pasa el tejido a parafina previamente licuada en una estufa regulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina líquida para favorecer una completa sustitución del líquido intermediario por la parafina. Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parafina líquida en un molde, se introduce la muestra y se coloca según la orientación deseada de corte y se deja solidificar a temperatura ambiente.
9) Proceso de microtomía
Coloque el microtomo en un lugar estable, lejos de ráfagas de aire, puertas y puntos de paso. Cualquier movimiento del aire debido a los equipos de aire acondicionado u otras causas puede hacer que el tratamiento de la sección sea muy difícil. Es preferible utilizar un banco ajustable en altura y una silla ergonómica. Es muy importante que el personal no esté distraído al usar el microtomo por los riesgos de lesionarse con cuchillas extremadamente afiladas. Al colocar los microtomos en un laboratorio debería considerarse el potencial para interactuar con otros miembros del personal. Es preferible tener un suelo antideslizante en las inmediaciones de los microtomos porque, inevitablemente, los fragmentos de parafina caerán al suelo y pueden originar una superficie resbaladiza. Muchos laboratorios usan esterillas antideslizantes para que el entorno sea más seguro. El ángulo de la faceta es el ángulo creado entre las dos facetas que forman el filo. Para el uso rutinario, las cuchillas desechables están hechas con un ángulo de la faceta de 35° aproximadamente, pero este ángulo puede variar en función del tipo de cuchilla y su fabricante. •Por eso, hay que ajustar, de forma óptima, el ángulo de inclinacióna en función del tipo de cuchilla. Siga las instrucciones del fabricante del microtomo para el ajuste del ángulo recomendado. Para los portacuchillas Leica se recomienda1 un ajuste de entre 1° y 5°.
Se recomienda, para una misma cuchilla:
a) utilizar un solo afilador y si es posible la misma placa de vidrio despulido
b) marcarlas de tal manera que siempre deben sujetarse al mecanismo del afilador conservando una posición y orientación determinadas
10) Proceso de coloración:
El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante. Se considera que una estructura se ha coloreado o teñido cuando al ser lavada con el líquido que disuelve al colorante, no se decolora.
El proporcionar color a las estructuras que constituyen un tejido o un órgano se hace con la finalidad de distinguirlas entre sí y facilitar su observación. Si se examina al microscopio una sección de tejido sin colorear, ya adherida al portaobjetos, se podrá constatar que no es fácil discernir sus componentes, pues lo delgado de los cortes y la diafanización producida en los tejidos igualan sus índices de refracción. La coloración proporciona diferencias evidentes entre las estructuras y al observar los cortes será fácil reconocerlas. Se denomina sustancia colorante a aquella que puede transferir su color a otro cuerpo. De acuerdo a esta teoría los colorantes se unen (ligan) a los tejidos por enlaces iónicos, covalentes o de hidrógeno.
Clasificación de los colorantes:
Existen varios criterios para clasificar a los colorantes:
a) Por su origen: pueden ser naturales y artificiales (sintéticos).
Colorantes naturales, se extraen de:
1) Animales: Como el carmín, que se extrae de la cochinilla, artrópodo parásito de los tallos del nopal (tuna). El carmín (de color rojo intenso) es uno de los colorantes naturales más empleado en la industria alimentaria y cosmética. En técnica histológica se utiliza el carmín de Best para demostrar glucógeno, el carmín de Mayer para demostrar mucina; las células fagocíticas se evidencian con el carmín de litio (colorante vital).
2) Vegetales: Como la hematoxilina, obtenida de la corteza de un árbol, el “palo de campeche” (Haematoxilum campechanum), la safranina que se extrae de una liliacea ( pistilos de la flor de azafran) o la orceína que se obtiene de un liquen.
b) Colorantes artificiales o sintéticos : Son productos derivados de la destilación de la hulla o carbón. Genéricamente se les conoce como colorantes derivados de la anilina. Los colorantes artificiales son sales. Son compuestos orgánicos formados por las modificaciones que experimenta el anillo bencénico cuando se reemplazan dos átomos de hidrógeno por un átomo de oxígeno o con otro átomo o por un grupo químico que tenga enlaces de doble valencia en vez de uno, dando como resultado un compuesto coloreado.
Clasificación de las coloraciones.
Existen procesos a través de los cuales células y tejidos son coloreados por las sustancias colorantes. De acuerdo a ellos, las coloraciones se clasifican en:
a) Coloración directa o sustantiva: Se denomina así a la tinción que se ejerce sobre células y tejidos cuando éstos se ponen en contacto con la solución colorante, el resultado indica una verdadera afinidad entre el tejido y el colorante
b) Coloración indirecta o adjetiva : Para que lleve a efecto la coloración es indispensable recurrir al empleo de sustancias intermediarias que faciliten la adhesión del colorante en las estructuras tisulares. La sustancia intermediaria que se utiliza se denomina “mordiente”.
c) Coloración progresiva: Se refiere a la marcha misma de la coloración. Los tejidos se ponen en contacto con la solución colorante para que, conforme transcurre el tiempo de coloración, el tejido, de manera progresiva, alcance la intensidad de tinción deseada; en ese momento se detiene la coloración mediante lavado y la eliminación del colorante sobrante.
d) Coloración regresiva: En este caso los tejidos se sobrecolorean con el colorante para someterlos después a la acción de una sustancia denominada diferenciador, éste extrae parte del colorante y, mediante la observación al microscopio, se detiene el proceso de diferenciación cuando los componentes alcanzan la tinción deseada.
e) Coloración simple: Es el procedimiento en el que se utiliza un solo colorante para teñir algún componente celular o tisular. Por ejemplo, teñir los núcleos con tionina.
