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BIOLOGÍA MOLECULAR – TÉCNICAS
MOLECULARES: “ANÁLISIS DE LA
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y
SECUENCIACIÓN”.
LAS TECNICAS DE HIBRIDACION PERMITEN
DETECTAR FRAGMENTOS ESPECIFICOS DE
DNA O RNA MENSAJERO
“La hibridación depende de la capacidad de complementariedad de las moléculas de DNA y RNA para asociarse específicamente unas con otras por medio de los pares de bases”.
Como sabemos las moléculas de DNA de doble cadena pueden desnaturalizarse en cadenas sencillas por calentamiento en solución salina.
Si la temperatura baja las cadenas complementarias se reasociaran (HIBRIDACION).
Existen 2 métodos muy sensibles para detectar una secuencia de DNA o RNA dentro de una mezcla compleja. Esta técnica combina la electroforesis y la hibridación con una sonda de DNA que puede estar etiquetada con un fluoroforo, cromoforo o enzima, de manera radiactiva
TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN- SOUTHERN BLOT
Es un método desarrollado por Edwin M. Southern, al que debe su nombre (SOUTHERN BLOT) Es una técnica muy simple y fácil de realizar que detecta fragmentos de DNA, separados por tamaño mediante electroforesis en gel. Se realiza mediante una separación electroforética del DNA con su transferencia a un soporte solido o FILTRO (Nailon o Nitrocelulosa)
“Esta técnica ha contribuido de forma notable a aumentar el potencial de la hibridación como herramienta analítica, constituyendo hoy en día en BIOQUIMICA CLINICA un método habitual de análisis del DNA extraído de muestras de sangre, esputos, tejido y células”
La técnica es capaz de detectar un fragmento de restricción en una mezcla altamente compleja de fragmentos producidas por la escisión del genoma humano con enzimas de restricción Grandes moléculas de DNA de 200 pb a mas de 20kb pueden ser separadas por ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.
Moléculas mas Pequeñas de DNA de 10 a 1000pb pueden ser separadas en por ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Cuando el DNA es fragmentado por digestión con enzimas de restricción, la mezcla de DNA es muy compleja. No obstante “Es posible identificar un fragmento particular de DNA como una banda que es capaz de hibridar con una sonda especifica de DNA”. Los fragmentos de DNA que son complementarios a las sondas se hibridan y su localización en el filtro puede ser revelada por auto radiografía (para sondas radio etiquetadas) o por imagen fluorescente
ETAPAS DE LA TÉCNICA
- Separación electrofrética
- Desnaturalización
- Transferencia
- Hibridación
- Detección
APLICACIONES
DETECCIÓN DE INSENSIBILIDAD ANDROGÉNICA
Detección de insensibilidad androgénica por transferencia Southern de una deleción en el gen del receptor androgénico ligado al X. La insensibilidad androgénica se presenta en una persona que genéticamente tiene cromosomas XY, pero que por anomalías genéticas es resistente a los andrógenos (como la testosterona) Tiene una prevalencia de 5/10000. Trastorno Recesivo ligado al X (Mutación Xq11-12).
PRUEBAS GENÉTICAS BASADAS EN ANÁLISIS DE
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
DIAGNÓSTICO PRENATAL DE ANEMIA FALCIFORME
POLIMORFISMO DE UN SOLO NUCLEOTIDO O SNP:
Definición: “Variación en una única pareja de nucleótidos en una molécula de DNA detectada durante el análisis genómico, presente en al menos el 1%”.
Pueden estar asociados a diversas enfermedades, incluyendo la anemia falciforme.
TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN - NORTHERN BLOT
“Es el método estándar para determinar el tamaño y la abundancia de un mRNA derivado de un determinado gen en una muestra de RNA.”
El RNA no puede ser cortado con las enzimas de restricción A diferencia del DNA, el RNA no tiene sitios específicos de corte para las enzimas de restricción. Los transcritos de RNA varían en longitud dependiendo del número y tamaño de los exones en los genes correspondientes. El RNA celular total obtenido de un determinado tipo celular se separa según su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. Puede ser necesaria su desnaturalización (Por ejemplo: con Formaldehido) antes de la electroforesis. Permite comparar cantidades de un mRNA particular en células bajo diferentes condiciones
SECUENCIACION SANGER
La técnica más usada para el análisis de secuencias de DNA es la secuenciación SANGER
La secuenciación Sanger se utiliza para determinar el orden exacto de los nucleótidos (A, T, C, G) en una molécula de DNA.
La clave de la secuenciación Sanger es el uso de análogos químicos llamados dideoxinucleótidos ddNTP (ddA, ddC, ddG y ddT). Estos ddNTPs son similares a los desoxinucleótidos normales (dNTPs) pero carecen de un grupo hidroxilo (– OH) en el carbono 3' de la desoxirribosa. “La falta de este grupo hidroxilo significa que una vez que un ddNTP se incorpora en una cadena de DNA en crecimiento, los nucleótidos dideoxi no permiten que la enzima DNA polimerasa se una a la siguiente base complementaria al DNA molde original que está siendo secuenciada, interrumpiendo así la cadena de DNA en formación”
INGREDIENTES PARA LA SECUENCIACIÓN DE SANGER
La secuenciación de Sanger consiste en hacer muchas copias de una región blanco de ADN. Sus ingredientes son similares a los necesarios para la replicación del ADN en un organismo o para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que copia el ADN in vitro. Los ingredientes son:
- Una enzima ADN polimerasa
- Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que se une al molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.
- Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
- El molde de ADN que será secuenciado.
Sin embargo, una reacción de secuenciación de Sanger también contiene un ingrediente único:
- Versiones didesoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro nucleótidos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos de color diferente.
BIOLOGÍA MOLECULAR – “TECNOLOGÍA DEL
DNA RECOMBINANTE”
CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
Los estudios detallados de la estructura y clonación de un gen a nivel molecular requieren de grandes cantidades del gen individual puro La tecnología del DNA recombinante se usa para clonar DNA
“El DNA recombinante es simplemente cualquier molécula de DNA compuesta de secuencias derivadas de diferentes fuentes”. La clave para clonar un fragmento de DNA de interés, es ligarlo a un Vector.
Un vector en clonación es como un "vehículo" que transporta fragmentos de ADN que queremos estudiar o utilizar en experimentos. Los vectores más comunes son los plásmidos, que son pequeñas piezas de ADN circular que se encuentran en bacterias.
Este vector es una molécula de DNA que puede replicarse dentro de una célula huésped Ejemplo de vector: Vector plásmido de E. coli.
Enzimas de restricción y DNA ligasas permiten la inserción de fragmentos de DNA en vectores de clonaje.
El objetivo principal de la clonación de DNA es obtener genes especificos.
Solo moléculas de DNA relativamente pequeñas pueden ser insertadas en vectores disponibles. Existen 2 tipos de enzimas que facilitan la producción de moléculas de DNA recombinante : o ENZIMAS DE RESTRICCIÓN o LIGASAS
para diferentes enzimas de restricción. Facilita la inserción de fragmentos de ADN de interés
**- Sitio de unión del cebador secuenciación
- Gen regulador:** Regulan la expresión del gen insertado
Los fragmentos de DNA aislados pueden ser clonados en vectores plásmidos de E.coli
APLICACIONES DEL DNA RECOMBINANTE
1. Expresar proteínas y estudiar su estructura y funcionamiento en vivo aislar y purificar proteínas para estudiar la estructura de las proteínas y su funcionamiento In vitro 2. Estudiar la estructura de los genes su secuencia y su expresión en órganos tejidos y células individuales 3. Crear animales transgénicos y animales con genes anulados para estudiar su funcionamiento genético 4. Producción a gran escala aislamiento y purificación de proteínas terapéuticas (insulina, hormona de crecimiento) para su aplicación en seres humanos 5. Utilización en terapia génica humana 6. Diagnóstico de trastornos en la genética y enfermedades infecciosas 7. Utilización en aplicaciones forenses 8. Crear microorganismos animales y plantas mediante ingeniería genética 9. Forzar la mutación de los genes y estudiar el funcionamiento de la proteína alterada producida 10. Encontrar la ubicación cromosómica de los genes clonados determinar el número de copias de los genes y estudiar su estructura 11. Utilizar una proteína purificada para fabricar anticuerpos con fines médicos o fabricar vacunas y tratamiento
PRODUCCION DE INSULINA EN BACTERIAS
El primer producto génico humano manufacturado utilizando DNA recombinante y con licencia para usos terapéuticos fue la insulina humana, disponible desde 1982.
“La insulina es una hormona proteica que regula el metabolismo de la glucosa”
Las personas que no pueden producir insulina tienen diabetes, una enfermedad que en su forma más grave (Tipo I) afecta a más de dos millones de personas en Estados Unidos. Unos grupos de células pancreáticas sintetizan un péptido precursor conocido como PREPROINSULINA Esto produce la molécula de insulina madura, que contiene dos cadenas poli peptídicas ( Las cadenas A y B ) unidas por puentes disulfuro. La insulina regula la incorporación de glucosa.
PRODUCCION DE INSULINA EN BACTERIAS
PRODUCTOS BIOFARMACEUTICOS: Insulina
Hormona polipeptídica producida por las células beta del páncreas Inhibe la producción hepática de glucosa, mejora la síntesis de proteínas e inhibe la lipolisis y la proteólisis Para uso terapéutico: Obtenida por tecnología del DNA recombinante. Usada para el tratamiento de hiperglicemia Tipo I y Tipo II
PRODUCTOS BIOFARMACEUTICOS: Atryn
Antitrombina humanizada, anticoagulante utilizado para prevenir eventos tromboembólicos en venas y arterias Cabras genéticamente modificadas producen antitrombina humana
BIOLOGÍA MOLECULAR CAPÍTULO 13: IMPORTANCIA BIOMÉDICA-
XERODERMA PIGMENTOSO
XERODERMA PIGMENTOSO
El Xeroderma Pigmentoso ocurre en todas las ETNIAS y es un trastorno autosómico recesivo de la reparación del DNA
predispone a graves efectos epidérmicos, en las personas que lo padecen y que están expuestas a radiación UV.
Estas personas han perdido la capacidad de realizar NER (Reparación por escisión de nucleótidos, por sus siglas en ingles). Las personas con XP, pueden desarrollar reacciones en la piel que van desde pecas, ulceraciones de la piel hasta el desarrollo de cáncer de piel. Esta enfermedad es muy grave e incluso mortal. Esta causado por mutaciones que afectan la sub vía de reparación global del genoma
IMPORTANTE:
La capacidad reducida o ausente para la reparación global del genoma, representa una pérdida de las funciones de vigilancia necesarias para el mantenimiento de la integridad del GENOMA
Producen la acumulación de mutaciones oncogénicas. En la actualidad se conocen que son 7 genes mutados los que están involucrados con el Xeroderma Pigmentoso (XPA al XPG).
GENES INVOLUCRADOS EN EL XP
CARACTERÍSTICAS DE LA ENFERMEDAD:
Los pacientes desarrollan síntomas a la edad de 1- años El 5% inician después de los 14 años. Facilidad para quemaduras solares. Fotosensibilidad aguda.
Pecas y fotofobia. Envejecimiento prematuro. 60 al 90% presentan anomalías oculares. Sordera Retraso mental Tienen una esperanza de vida corta aprox. 30años
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS
A. Px con ampollas, luego de ser expuesto por un corto tiempo a la luz solar B. px de 2 años con desarrollo maculas hiperpigmentadas en la piel. C. px presenta cáncer a nivel de la base de la nariz y mejilla izquierda D. px con macula, neurodegeneración y sordera E. Nubosidad corneal, perdida de pestañas, pterigio. F. Demarcación aguda, cambios poiquilodermatosos en la piel expuesta G. Perdida del borde de los labios, y telangiectasias en la lengua H. Carcinoma de células escamosas desarrollada en la lengua. I. Tricotiodistrofia
Medidas terapéuticas
Evitar la exposición al sol Usar ropa protectora Vigilar cuidadosamente la aparición de neoplasmas cutáneos No hay tratamiento curativo Detección temprana Suplementos de Vitamina D
La radiación UV posee un potencial energético elevado y un intenso poder mutágeno. Actúa sobre la iniciación y el desarrollo del cáncer. Altera los oncogenes y es inmunosupresora. Por lo tal en la XP el defecto de reparación del ADN lesionado por la radiación UV es responsable de la aparición de un número elevado de células mutadas_._
RIESGO DE HERENCIA
Debido a que es una enfermedad autosómica recesiva, la probabilidad es de un 25% (1/4). El diagnóstico prenatal es posible mediante pruebas funcionales de reparación del DNA y sensibilidad a la radiación ultravioleta en cultivo de amniocitos o de vellosidades coriónicas
