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TALLER 8
- ¿Qué es y para que se realizan las tinciones? Se denomina tinción al proceso y el resultado de teñir (otorgar un color a una cosa). El concepto deriva del vocablo latino tintico. Es importante destacar que el acto y la consecuencia de teñir también se conocen como tintura. De este modo, mientras que en el lenguaje coloquial suele emplearse la idea de tintura, en el campo de la química y de la medicina se prefiere el término tinción. En este sentido, se llama tinción a una técnica que se emplea en los laboratorios con el objetivo de optimizar la visión de aquello que se observa a través de un microscopio. La tinción, de este modo, consiste en aplicar un colorante a una sustancia o un tejido para que resulte más simple detectarlo y analizarlo. Con la tinción, es posible mejorar la definición de grupos de células o de fragmentos de tejido, por citar algunas opciones. También, mediante tinturas especiales, se puede medir la presencia de ciertas sustancias o elementos en un compuesto. Cuando se tiñe un tejido vivo, se habla de tinción in vivo, supra vital o vital. Esto permite observar reacciones químicas o características morfológicas de tejidos vivos mientras las células cumplen su función natural. Por lo general, el objetivo que buscan los científicos a través de este tipo de tinción es sacar a la luz ciertos datos acerca de la cito estructura (la conformación de la célula) que no podrían ser observados de otra forma, aunque también sirve para indicar la ubicación de un producto químico determinado, o bien de una reacción que ocurre en el interior de los tejidos o de las células. Una de las características principales de la tinción in vivo es que los colorantes suelen usarse en soluciones altamente diluidas, con valores de concentración que van desde 1:5.000 a 1:50.000. Sin embargo, esto no siempre impide que la tinción sea tóxica para el organismo. Se habla de tinción in vitro para definir la coloración de estructuras o células que ya no se encuentren en su contexto biológico. Por lo general, se combinan diversos colorantes para obtener resultados más detallados y precisos. Cuando esto se une a ciertos protocolos de preparación de muestras y de fijación, la ciencia es capaz de producir diagnósticos consistentes. Tinción La clase de análisis deseada para cada caso en particular repercute en los pasos necesarios para llevar a cabo la tinción in vitro, y estos son tres:
la fijación, que consiste en modificar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas de un tejido o célula para preservar al máximo su forma; la permeabilización, para disolver la membrana celular de manera que el colorante pueda penetrarla; el montaje, que busca incrementar la resistencia de una muestra para que no se destruya ni pierda su estructura original a lo largo del proceso. También existe el concepto contratación, que se refieren a la aplicación de una segunda tinción a una determinada preparación para volver visibles aquellas partes que no pudieron ser manchadas con la primera. La tinción, por otra parte, puede ser indirecta o directa de acuerdo a la interacción del colorante con el tejido. Una de las tinciones más conocidas es la tinción de Gram, desarrollada por Christian Gram, que permite visualizar bacterias en las muestras clínicas. Las bacterias que reaccionan tornándose de color morado se denominan bacterias Gram positivas, mientras que aquellas que se vuelven rosadas se definen como bacterias Gram negativas. La tinción de Wright, la tinción hematoxilina-eosina y la tinción argéntica son otras clases de tinciones que pueden emplearse. Retomando el término contratación, podemos observar un ejemplo de esta técnica cuando se aplica cristal violeta (un grupo de compuestos que suelen usarse como colorantes e indicadores de pH y que también se denomina violeta de genciana o violeta de metilo) a una muestra de bacterias para una tinción de Gram, ya que solamente las Gram positivas resultan manchadas; por esta razón se vuelve necesaria la aplicación de safranina, la cual afecta a todas las células y, por lo tanto, permite identificar las Gram negativas.
- Explique el fundamento bioquímico del azul de lactofenol para poder observar las estructuras de los hogos. El azul de lactofenol o azul de algodón es un preparado con propiedades de colorante simple. Es utilizado en laboratorios clínicos para colorear principalmente estructuras fúngicas como, hifas, tubos germinativos y esporas. Ayuda en el diagnóstico presuntivo o preliminar de ciertos hongos, sin embargo, siempre es aconsejable reforzar el diagnóstico con pruebas más específicas, tales como pruebas bioquímicas o serológicas. Representación gráfica del colorante azul de lactofenol, frotis teñido con azul de lactofenol, preparación montada en el microscopio.
demuestra la mayor sensibilidad de las coloraciones con fluorocromos frente a la de Ziehl Neelsen, concluyendo que “…existe evidencia de la capacidad de las micobacterias para tener polimorfismo morfológico y de la necesidad de aclarar la patogénesis de la tuberculosis”. Además del sistema óptico para la identificación morfológica de los microorganismos, también se cuenta con métodos que hacen uso de microscopios electrónicos, los cuales, disponen de un flujo de electrones que choca con la muestra, creando una imagen aumentada. En este sistema, se utilizan lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones y ocasionan un espacio vacío que impide que las cargas negativas sean desviadas por las moléculas del aire. Lo anterior puede causar absorciones y emisiones electrónicas en regiones diferentes al espectro visible, lo que implica que las técnicas de coloración para las muestras no sean necesarias (50-51); mientras que, para las observaciones en el microscopio óptico son requeridas, dado que las transiciones electrónicas ocurren a longitudes de onda dentro del espectro visible que se evidencia con los colores.
- Realice un paralelo entre las diferencias estructurales que tienen entre si la Bacterias Gram negativas y Gram positivas.
Las bacterias Gram positivas tienen una capa gruesa de peptidoglicano y no tienen una membrana lipídica externa, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglicano y tienen una membrana lipídica externa. Como las bacterias Gram positivas carecen de una membrana lipídica externa, cuando se refieren correctamente a su estructura en lugar de las propiedades de tinción, se denominan monodermos. La membrana lipídica externa que poseen las bacterias Gram negativas significa que, cuando se hace referencia a su estructura física, se denominan didermas. - ¿Qué estructuras según la literatura pudo observar en el hongo? Excepto por las levaduras, que crecen como células únicas, la mayoría de los hongos crecen como filamentos similares a hilos, como los que se muestran en la Imagen siguiente. Estos filamentos se llaman hifas (singular, hifa). Cada hifa consiste en una o más células rodeadas por una pared celular tubular. Una masa de hifas componen el cuerpo de un hongo, que se llama un micelio (plural, micelios). Las hifas de la mayoría de los hongos se dividen en células mediante paredes internas llamadas septos (singular, septo). Los septos usualmente tienen pequeños poros que son lo suficientemente grandes para permitir que los ribosomas, mitocondrias y, a veces, el núcleo circule en las células. Las hifas que se dividen en células se llaman hifas septadas. Sin embargo, las hifas de algunos hongos no se separan por septos. La hifas sin septos se
llaman hifas cenocíticas. Las hifas cenocíticas son grandes células multinucleadas.
- ¿Por qué las bacterias Gram positivas tiñen de color violeta? Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por un gran número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la tinción Gram, dando un color violeta intenso al microscopio y se clasifican como Gram +. La gran aportación práctica de la tinción de Gram es que permite determinar el tipo de antibiótico así como su eficacia. El antibiótico de elección ha de ser capaz de atravesar la pared bacteriana, en función de si la bacteriana es gram positiva o negativa se seleccionará el antibiótico más eficaz. - ¿Por qué las bacterias Gram negativas tiñen de color rosado? La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las bacterias para observarlas mejor bajo el microscopio. Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras.
- ¿Cómo se clasifican los cocos y los bacilos? Dibuje.
El TSA Agar es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias. Permite visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sódico y 5% de sangre. FOTO 21. Placa A gar TSA. Es un medio recomendado para la detección y recuento de una amplia gama de microorganismos. La presencia de Lectina y Tween permite neutralizar la actividad antibacteriana, facilitando la investigación de los gérmenes en productos o superficies que contengan: Aldehídos, derivados fenólicos, o amonio cuaternario. La aportación de caseína y peptonas de soja al Agar de Tripticasa-soja hace el medio muy nutritivo por el suministro de nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y péptidos de cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran variedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen rápidamente, así como los del género Candida. También permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.
- ¿Cuál es el fundamento del agar Sangre? USO Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos microorganismos. Al ser suplementado con sangre ovina, permite el crecimiento de microorganismos nutricionalmente exigentes y la clara visualización de reacciones de hemólisis. FUNDAMENTO La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. El agregado de 5-10 % sangre ovina desfibrinada estéril (Britasheep) promueve el desarrollo de bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales y la adecuada observación de las reacciones de hemólisis.
- ¿Cuál es el fundamento del agar EMB? Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. FUNDAMENTO El medio de cultivo combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. Es nutritivo por la presencia de peptona que favorece el desarrollo microbiano. La
diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia variedad de bacterias FÓRMULA (en gramos por litro) PEPTONA ........................................................................................................ ..........................10. LACTOSA .......................................................................................................... .............................. 5. SACAROSA ........................................................................................................ ........................... 5.0 FOSFATO DIPOTÁSICO ....................................................................................................
EOSINA ............................................................................................................. ................................ 0.4 AZUL DE METILENO ...................................................................................................
AGAR .............................................................................................................. ................................13.5 PH FINAL: 7.2 ± 0.2 INSTRUCCIONES Suspender 36 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición hasta su disolución total. Esterilizar en autoclave 121°C durante 15 minutos. Distribuir en placas de Petri estériles. Gram positivas. El agar es el agente solidificante. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. También, pueden crecer especies de Candida y se observan como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas se observan como colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
- ¿Cuál es el fundamento del agar Saboreaud? UsoMedio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras. FUndamentoMedio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo). En el medio de cultivo, la peptona, la tripteína y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido, inhiben el desarrollo
debido a que frena la entrada de oxígeno, de tal manera que el oxígeno va disminuyendo a medida que se profundiza hacia el interior del tubo. Es por ello que este medio es ideal para el desarrollo de bacterias aerobias facultativas, microaerofilas y anaerobias estrictas, estas 2 últimas sin necesidad de incubar bajo estas condiciones. El mismo medio regula la cantidad de oxígeno dentro del medio, estando ausente en el fondo del tubo y en cantidad suficiente en la superficie. Así mismo, el tioglicolato y la L-cistina actúan como agentes reductores, contribuyendo a la prevención de la acumulación de sustancias nocivas para el desarrollo bacteriano, como lo es el peróxido. Además, estos compuestos contienen grupos sulfidrilos (-SH-), neutralizando los efectos inhibitorios de los derivados mercuriales, arsenicales, entre otros metales pesados. Por su parte, la resazurina es un indicador de óxido –reducción. Esta sustancia es incolora cuando está reducida y color rosa cuando está oxidada. Existen las variantes de caldo tioglicolato con indicador y sin indicador. Su uso dependerá del tipo de muestra y la preferencia del laboratorio. Entre tanto, el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico del caldo tioglicolato y el uso de la glucosa en forma anhidra previene el exceso de humedad en el medio deshidratado.
- Explique que es la micro biota benéfica.
La microbiota intestinal es la comunidad de microorganismos vivos residentes en el tubo digestivo. Muchos grupos de investigadores a nivel mundial trabajan descifrando el genoma de la microbiota. Las técnicas modernas de estudio de la microbiota nos han acercado al conocimiento de un número importante de bacterias que no son cultivables, y de la relación entre los microorganismos que nos habitan y nuestra homeostasis. La microbiota es indispensable para el correcto crecimiento corporal, el desarrollo de la inmunidad y la nutrición. Las alteraciones en la microbiota podrían explicar, por lo menos en parte, algunas epidemias de la humanidad como el asma y la obesidad. La disbiosis se ha asociado a una serie de trastornos gastrointestinales que incluyen el hígado graso no alcohólico, la enfermedad celíaca y el síndrome de intestino irritable. En el presente trabajo trataremos sobre la nomenclatura, las técnicas de estudio modernas, las funciones de la microbiota intestinal y la relación que tiene con la salud y la enfermedad.
- ¿Cuál será la finalidad y el sentido de identificar macro y microscópicamente los microorganismos? La identificación de microorganismos de forma rápida y segura es condición indispensable para las empresas que operan en la producción de alimentos.
La tipología de casuísticas en las que esto es necesario es muy amplia y diversa, las más comunes son: Por temas de seguridad alimentaria: Cuando se detectan indicios de contaminación en un producto es necesario identificar a la mayor brevedad posible y con el mayor nivel de rigurosidad el microorganismo causante. Esto es frecuente con productos propensos a la contaminación por patógenos como la Salmonella, E.Coli o Listeria monocytogenes. Por temas de calidad organoléptica: Cuando se detectan alteraciones o una depreciación de las condiciones organolépticas del alimento, como puede ser el caso de las bacterias acidolácticas en productos cárnicos o salsas; de levaduras como Brettanonmyces Sp en vinos, u otras como Zygosacharomyces baili y Z.Rouxi en productos con alto contenido en azúcar como mermeladas… En estos casos es crucial identificar en muy poco tiempo los microorganismos que están ocasionando el problema y cuál es su origen (si procede de la materia prima o si está en la planta a lo largo de la línea de producción, con algún foco de contaminación). En el desarrollo de productos funcionales: La identificación y caracterización rápida de la tipología de cócteles de microorganismos probióticos para formulaciones finales de alimentos funcionales y complementos alimenticios es una de las etapas básicas en el desarrollo de este tipo de productos. Para asegurar la homogeneidad de producto: En quesos, vinos, cervezas, embutidos… que requieren unos estándares determinados organolépticos, la identificación de los microorganismos iniciadores del proceso fermentativo, por ejemplo, es crucial para darle homogeneidad al producto, garantizando las características organolépticas del mismo en todos los lotes, algo no tan fácil de resolver cuando hablamos de grandes producciones.
- La identificación macroscópica y microscópica es suficiente para poder determinar la especie de un microorganismo. Justifique
Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos convencionales, basados en las características fenotípicas, puesto que su realización y coste los hace más asequibles. Los métodos genotípicos suelen reservarse para las bacterias que no se pueden identificar con métodos convencionales. Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las características observables de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas. El cultivo, cuando es factible, continúa siendo el método diagnóstico de elección; permite el aislamiento del microorganismo implicado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos y facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las
casos pueden ocasionar infecciones como es S. pyogenes que está asociada a la piel y a la garganta. Por eso al momento de diagnosticar una infección en esta área se lleva cabo pruebas que distingan entre especies patogénicas de las no patogénicas que forman parte de la microbiota del lugar. Se usa protocolo y medios selectivos y diferenciales para agilizar la identificación del causante de la infección. La toma de muestra del tracto respiratorio superior depende de la parte a evaluar. Por ejemplo, para tomar muestra clínica de la garganta se debe evitar tocar zonas de la lengua y boca con hisopo estéril. Usando depresor se pasa el hisopo estéril por el área detrás de la úvula por la tonsila (amígdalas), faringe posterior y zonas inflamadas o con ulceras. Se recomienda que la toma de muestra con el hisopo sea con movimiento rotatorios para tomar más muestra del lugar. Muchas veces estas muestras son inoculadas en agar de sangre para identificar posibles estreptococos que ocasionan infección. La faringitis puede ser ocasionada por S. pyogenes o por N. gonorrhoeae. Otras bacterias como H. influenzae, S. pneumoniae, Bordetella perussis, Corynebacterium diphtheriae pueden ocasionar infecciones en diferentes áreas del tracto respiratorio superior. El género Streptococcus tiene especies relacionadas a la microbiota del humano como asociados a enfermedades en humano. Se usa características morfológicas, pruebas serológicas, pruebas bioquímicas y reacciones en medios selectivos y diferenciales para su clasificación. Se clasifican en grupos A, B, C, D, F y G por las pruebas serológicas. Y en grupo alfa, beta. Gamma por su reacción hemolítica en el medio de agar de sangre. Es un género con importancia médica porque entre sus especies hay causantes de faringitis, impétigo, fiebre reumática, meningitis, abscesos, endocarditis, infecciones urinarias, caries, neumonía entre otras enfermedades. Por ejemplo, S. pyogenes es el más frecuente causante de faringitis y tonsilitis.
- ¿Qué microorganismos encontramos en la materia fecal? Qué función cumple. Una muestra de materia fecal puede otorgarles a los médicos información valiosa sobre lo que ocurre cuando un niño tiene un problema estomacal, intestinal o en otra parte del tracto gastrointestinal. Los cultivos de materia fecal ayudan al médico a determinar si existe una infección bacteriana en los intestinos. Un técnico colocará pequeñas muestras de la materia fecal en un plato plástico estéril que contiene nutrientes que favorecen el crecimiento de determinadas bacterias. Las bacterias que se intenta detectar sólo crecerán si ya están presentes en la muestra de heces. Si se forman colonias de bacterias, el técnico las evalúa con un microscopio y con análisis químicos para identificar el organismo. Por qué se realiza
Es posible que un médico solicite un cultivo de material fecal para detectar bacterias que provocan enfermedades, como las siguientes: Shigella Salmonella Yersinia Campylobacter Escherichia coli (E. coli) 0157:H En algunos casos, es posible detectar otras bacterias causantes de enfermedades. Probablemente se solicite un cultivo de materia fecal si su hijo ha tenido diarrea durante varios días o si ha presentado diarrea sanguinolenta, en especial si ha habido un brote de enfermedades provocadas por los alimentos en la comunidad, si su hijo ha comido recientemente carne o huevos a los que les faltaba cocción, si ha tomado leche no pasteurizada o si ha viajado recientemente a algunos lugares fuera de los Estados Unidos.
- ¿Qué microorganismos encontramos en el suelo? Qué función cumple. La microflora del suelo está compuesta por bacterias, actinomiceto, hongos, algas, virus y protozoarios. Entre las funciones más importantes que cumplen asociadamente en los procesos de transformación están: Suministro directo de nutrientes. Fijación de nitrógeno. Transformación de compuestos orgánicos que la planta no puede tomar a formas inorgánicas que si pueden ser asimiladas (Mineralización). Ejemplo: Proteína hasta aminoácidos y a nitratos. Solubilización de compuestos inorgánicos para facilitar la absorción por las plantas. Ejemplo. Fosfato tricálcico a Fosfato monocálcico. Cambios químicos en compuestos inorgánicos debido a procesos de oxidación y reducción. Ejemplo. Oxidación del azufre mineral a sulfato. Oxidación del nitrógeno amoniacal a nitrato. Aumento del desarrollo radicular en la planta que mejora la asimilación de nutrientes, la capacidad de campo y el desarrollo. Reacciones antagónicas, parasitismo y control de fitopatógenos. Mejoramiento de las propiedades físicas del suelo.
- ¿Qué microorganismos encontramos en el aire? Qué función cumple. La atmósfera no tiene una microbiota autóctona pero es un medio para la dispersión de muchos tipos de microorganismos (esporas, bacterias, virus y hongos), procedentes de otros ambientes. Algunos han creado adaptaciones especializadas que favorecen su supervivencia y permanencia. Los microorganismos dispersados por el aire tiene una gran importancia biológica y económica. Producen enfermedades en plantas, animales y humanos, causan alteración de alimentos y materiales orgánicos y
(ed.). 1998. Bailey & Scott’s diagnostic microbiology, 10th ed. Mosby, Inc., St. Louis, Mo.- Murray P.R., Baron, Pfaller, Tenover and Yolken. 1999. Manual of clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. Agar Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Procedimient os en Microbiologí a Clínica 67 2019 eimc
TALLER 10
¿Cuál es la finalidad de colocar las raíces de la cebolla en agua con 7 días de anterioridad para poder observar el proceso de mitosis? El crecimiento en un organismo es cuidadosamente controlado regulando el ciclo celular. En las plantas las raíces continúan creciendo mientras buscan agua y nutrientes. Estas regiones de crecimiento sirven para estudiar el ciclo celular porque en cualquier momento se pueden encontrar células que están sufriendo mitosis. Para examinar las células en la punta de una raíz de cebolla, un delgado corte de la raíz se coloca sobre un portaobjeto y se tiñe para que los cromosomas sean visibles. Las células que usted verá en esta actividad fueron fotografiadas con un microscopio óptico y luego digitalizadas para que ustedes las puedan ver en la computadora. ¿Por qué es utilizada la raíz de la cebolla y no la de otro alimento para la observación de las fases de la mitosis? Aunque el corte de la raíz de cebolla captura muchas células en diferentes fases del ciclo celular, tenga presente que el ciclo celular es un proceso
continuo. Los científicos han dividido el proceso en 5 fases, cada una caracterizada por importantes eventos, pero estas divisiones son arbitrarias Podemos observar en la mitosis de la cebolla el huso acromático. Si, no. ¿Por qué? No se puede observar porque sus estructuras generalmente no logran colorearse con los tintes utilizados en el experimento ¿Qué sucede si en la metafase no se alinean la misma cantidad de cromátidas en cada uno de los polos? Justifique. La metafase es una etapa de la división celular (mitosis o meiosis). Normalmente, los cromosomas individuales no son visibles en el núcleo celular. Sin embargo, durante la metafase en la mitosis o en la meiosis los cromosomas se condensan y se pueden distinguir cuando se alinean en el centro de la célula en división. Los cromosomas en la metafase (o metafásicos) se utilizan en la determinación del cariotipo que se realiza para buscar anormalidades cromosómicas. ¿Explica por qué las divisiones por mitosis conservan la constancia numérica de los cromosomas? La división celular por mitosis es decisiva para el desarrollo de los organismos y su reproducción; aunado a ello, es necesario que cada nueva célula sea genéticamente idéntica de la que proviene. En los eucariontes esto se logra gracias a mecanismos complejos que aseguran la integridad del material genómico y su segregación apropiada durante la mitosis. La visión tradicional de la mitosis la ha dividido en diferentes etapas que lograron caracterizarse gracias a los estudios morfológicos en células en división; los avances en biología molecular han llevado más allá esta caracterización, de manera que ahora se conoce toda una gama de participantes moleculares. En este artículo se abordarán el proceso de la mitosis celular y molecular y una breve síntesis de los actores moleculares que regulan este proceso. ¿Cuáles características o estructuras pudiste observar en cada una de las fases que encontraste en el desarrollo de la práctica?
¿Qué papel desempeña el zumo de papaya en la extracción de ADN? Los zumos de piña y papaya contienen un enzima, la papaína, que contribuye a eliminar las proteínas que puedan contaminar el ADN. ¿Qué papel desempeña el alcohol de 96° frio en la extracción de ADN? El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. ¿Por qué se debe utilizar agua destilada y no agua normal en el proceso de extracción de ADN? Porque el agua destilada es totalmente estéril, mientras el agua de llave tiene procesos y hasta cloro, dañando y alterando la muestra. Explica cómo se hace y que reactivos se utilizan en el método analítico para extracción de ADN. Incubación del lisado para su uso Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este método son las pérdidas de ADN por acción de las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que están en contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN. Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan separar, por lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método puede ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos. El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra la separación de los ácidos nucleicos. Este método se puede usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores que aseguran una buena separación. Las desventajas de este método son el uso de disolventes orgánicos dañinos para la salud humana y
que pueden quedar como trazas en la muestra de ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como el PCR, que es largo, en ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y requiere de varios trasvases que aumentan la posibilidad de contaminación de la muestra. Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico puede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. Un ejemplo de este método, quizás el más conocido, es el uso de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) como detergente para lograr la lisis. El CTAB además, en presencia de EDTA como agente quelatante y TRIS-HCl como tampón, forma complejos insolubles con el ADN. Luego se extraen los residuos orgánicos con cloroformo, para separar posteriormente el ADN por precipitación con etanol. Si se quiere evitar el uso de disolventes orgánicos se puede llevar a cabo el método del CTAB separando directamente los complejos insolubles formados con el ADN del sobrenadante donde han quedado disueltos el resto de componentes celulares. Estos complejos se resuspenden en disolución salina y se adiciona posteriormente alcohol y RNAsa, logrando que precipite el ADN con un grado de pureza aceptable para muchas aplicaciones. Método de salting-out A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. El precipitado formado se separa por centrifugacón y luego se puede extraer el ADN de la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación. Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en muchas ocasiones debe ser purificado antes de ser usado en posteriores aplicaciones. La ventaja es que se elimina el uso de disolventes orgánicos. Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en inglés proteinase K
- sodium dodecyl sulfate, es uno de los más usados para la extracción de ADN ya que la digestión de la muestra se puede realizar con proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa K inactiva las
