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TRABAJO PRÁCTICO N 4
BIOENERGÉTICA Y CINÉTICA ENZIMÁTICA
AÑO 2022
OBJETIVOS
- Comprender el alto grado de orden existente en la célula así como la necesidad de energía para generar y mantener el mismo.
- Relacionar esa necesidad energética con la ingesta y oxidación de los alimentos por medio de reacciones catalizadas enzimáticamente.
UNIDAD DE CONOCIMIENTO
CONOCIMIENTOS PREVIOS REQUERIDOS: Nociones básicas de equilibrio químico. Nociones elementales de cinética química. Trabajos prácticos de pequeñas moléculas y macromoléculas.
TEMARIO
Bioenergética: Universo, sistema y entorno. Sistemas cerrados y abiertos. La célula como un sistema abierto. Distintos tipos de energía: interconversión entre ellas. El calor como una forma de energía degradada. Conceptos de entropía (S) y energía libre (G). Unidades. Reacciones endergónicas y exergónicas. Relación entre G y G, y entre G y Keq. G’ definición. Criterios de espontaneidad de las transformaciones. Reacciones acopladas. Velocidad de Reacción: Definición de velocidad de reacción. Unidades. Estado activado y energía de activación. Reacciones reversibles e irreversibles. Factores que modifican la velocidad de reacción. Catalizadores inorgánicos y biológicos. Diferencias entre ellos. Enzimas: Definición de enzimas. Centro activo y centro alostérico o regulador. Características de las enzimas y de la catálisis enzimática. Nociones de cinética enzimática. Km y Vmáx: Conceptos y unidades. Actividad enzimática: efectos del pH y temperatura. Regulación de la actividad: inhibidores competitivos y no competitivos. Cofactores enzimáticos: inorgánicos y orgánicos (coenzimas).
VOCABULARIO ESPECÍFICO DEL TEMA Universo, sistema, energía, entorno, entropía, entalpía, calor, energía interna, energía libre, endotérmica, exotérmica, endergónico, exergónico, catalizador, velocidad de reacción, equilibrio químico, trabajo, estado activado, energía de activación, reversibilidad, cinética, inhibidor, alosterismo, cofactor, sitio activo, sitio alostérico, feedback, apoenzima, holoenzima.
BIBLIOGRAFÍA
- Karp, G. “Biología Celular y Molecular”. 6ª Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana. 2010.
- Becker W.M y col. “ El mundo de la célula ” Ed. Pearson – 2007 -
- Blanco, A. “Química Biológica”. 8a^ Edición. Editorial El Ateneo. 2015
- Alberts, B. et al. “ Biología molecular de la célula ”, Editorial Omega. 6ta Ed. 2014.
CUESTIONARIO GUÍA DE ESTUDIO
1. a) Defina universo, sistema abierto, cerrado y entorno. Realice un esquema donde se puedan visualizar estos conceptos. b) ¿Qué tipo de sistema representa una célula? ¿Por qué? 2. a) Defina G y G. ¿Cómo se vinculan? ¿En qué unidades se expresan? b) Defina S e indique en qué unidades se expresa. c) ¿Qué entiende por espontaneidad de una transformación? d) ¿Cómo debe ser G del sistema y S del universo para que una reacción sea espontánea? e) ¿Para decidir si una reacción es espontánea o no en una célula debemos tener en cuenta el valor de G o G? f) Defina G ’. En biología ¿qué G usamos? 3. Dada la reacción A → B donde GA es mayor que GB: a) ¿Qué puede decir respecto de la espontaneidad de la reacción A → B y B → A? a1- En condiciones estándar. Justifique. a2- En condiciones celulares. Justifique. b) ¿Cómo debería ser la concentración de B respecto de la de A para que la reacción B → A tenga lugar en condiciones celulares? c) Teniendo en cuenta su respuesta al item b) ¿por qué cree usted que en la célula sólo son reversibles aquellas reacciones con un G próximo a cero? 4. a) Represente gráficamente los cambios de energía libre en el curso de una reacción. b) Defina estado activado y energía de activación. c) ¿Qué entiende por velocidad de reacción química? ¿En qué unidades se mide? d) ¿De qué depende y cómo puede modificarse la velocidad de una transformación?
5. a) ¿Qué son las enzimas? ¿Todas son proteínas? Fundamente. b) ¿En qué se diferencian las enzimas de los catalizadores inorgánicos? c) ¿De qué manera las enzimas aceleran la velocidad de una reacción biológica? d) ¿Cómo se denomina al sitio donde se une el sustrato? ¿Qué características estructurales posee? ¿Sus aminoácidos deben ser contiguos en la estructura primaria de la enzima? e) ¿Cómo se modificaría el gráfico de los cambios de energía libre vs. coordenada de reacción en presencia de un catalizador? Grafíquelo. 6 - a) ¿Qué características particulares presentan las enzimas reguladoras?
b) ¿Qué tipo de enzimas reguladoras conoce?
7. a) Defina velocidad enzimática y mencione tres posibles unidades para expresarla. b) Realice un gráfico en donde se observe como varía la velocidad de reacción en función de la concentración de reactivos para una transformación catalizada enzimáticamente. c) ¿A qué se denomina Km y Vmáx y en qué unidades se expresan ambos parámetros? d) ¿Cómo se puede modificar la actividad de una enzima en función de: d1) Variación de pH; d2) Variación de temperatura. d3) Presencia de un inhibidor competitivo. d4) Presencia de un inhibidor no competitivo.
b) ¿Con cuál de las siguientes reacciones acoplaría a las anteriores activaciones para que el proceso acoplado sea espontáneo en condiciones estándar? ATP + H 2 O → ADP + Pi G = - 7,30 Kcal/mol ATP + H 2 O → AMP + PPi G = - 10,0 Kcal/mol
c) ¿Cuál sería el valor del G de los procesos acoplados?
5. La glucosa es la principal fuente de energía para la mayoría de las células. Para liberar la energía almacenada en esta molécula, las células aeróbicas la oxidan completamente en presencia de oxígeno hasta CO 2 y H 2 O (proceso denominado combustión en química y respiración celular en biología).
C 6 (H 2 O) 6 + 6O 2 → 6 CO 2 + 6 H 2 O
a) ¿Cree Ud. qué el G de esta reacción variará si el proceso se lleva a cabo en un sólo paso o en múltiples pasos? Justifique su respuesta. b) Si bien este proceso de combustión es muy exergónico, la glucosa puede permanecer durante años en contacto con el oxígeno de la atmósfera sin transformarse en CO 2 y H 2 O. b1- ¿A qué se debe esto? b2- Si la combustión ocurre en el interior de una célula (respiración celular) ¿la velocidad del proceso será la misma? Justifique. ¿Y el G?
6. La lactosa es la principal fuente de energía de los lactantes. Para su absorción debe ser hidrolizada en el intestino delgado por la enzima lactasa, situada en células del borde en cepillo. En los mamíferos, esta enzima muestra su máxima actividad en el momento del nacimiento y durante el período de lactancia para declinar tras el destete a menos de una décima parte de la capacidad funcional máxima. a) ¿Qué representa la lactosa para la lactasa? ¿Cómo se denomina la región donde ocurre la reacción química que transforma la lactosa en sus productos? b) Para estudiar la cinética de la lactasa incubó homogenado de mucosa intestinal de lactante (obtenida por biopsia) con concentraciones crecientes de lactosa registrando la velocidad (v 0 ) de aparición de productos. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
I. ¿Qué parámetros cinéticos puede obtener a partir de los datos de la tabla? II. Realice el gráfico de velocidad (vo) en función de la concentración de sustrato y ubique en el mismo los parámetros referidos en el ítem I. III. ¿Con qué características de la enzima se asocian dichos parámetros? Justifique su respuesta
c) Si repite el experimento desarrollado en el ítem b) cuando el individuo ha alcanzado el estado adulto ¿Qué modificaciones espera encontrar en los parámetros cinéticos? Justifique su respuesta.
[Lactosa] (mM)
v 0 ( M/min) 0 0 , 10 7 , 0 20 10 , 30 13, 50 16 , 100 19 , 8 150 20, 200 20,
7. En la siguiente figura se representa la relación entre el pH y la actividad catalítica de tres enzimas: la pepsina (P), la tripsina (T) y la fosfatasa alcalina (F)
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a) Explique para una enzima en particular ¿a qué se debe la variación de la actividad catalítica en función del pH en cada región de la curva? b) Si el pH sanguíneo es 7,3 ¿qué enzimas podrían presentar actividad en el plasma? c) Siendo 37 C la temperatura óptima para la tripsina, realice un gráfico de la variación de la actividad enzimática vs temperatura. Describa qué sucede en cada región de la curva.
8. La glucosa llega a los tejidos periféricos transportada por la sangre e ingresa a las células a través de una proteína transportadora. En el citosol es fosforilada a glucosa- 6 - P evitando que pueda escapar de ella. En células hepáticas existen dos enzimas capaces de catalizar la reacción:
Glucosa + ATP → glucosa – 6 – P + ADP
- Hexoquinasa (presente en todos los tejidos)
- Glucoquinasa (localizada en hepatocitos y en células de los islotes pancreáticos)
a) En la figura de la derecha se muestra el gráfico de actividad enzimática vs [glucosa] para ambas enzimas hepáticas. También puede observarse el rango de concentración de glucosa en ayunas.
a1- ¿Cuál de las enzimas tiene mayor afinidad por la glucosa? Justifique.
a2- ¿Cuál es más efectiva en la catálisis en condiciones de ayuno?
a3- ¿Qué sucederá en condiciones postprandiales?
AE: actividad enzimática
AE P (^) T F
3 5 7 9 111 pH
10. a) El colesterol celular proviene de dos fuentes (Figura):
1 - Incorporación de colesterol plasmático por captación mediada por un receptor de membrana de lipoproteínas que lo transportan en el plasma (LDL plasmáticas).
2 - Síntesis endógena a través de una ruta multienzimática conocida como vía del mevalonato. El principal punto de regulación de esta vía es la reacción catalizada por la enzima H (HMG-CoA reductasa).
A nivel celular el propio colesterol regula procesos que garantizan el mantenimiento de su homeostasis. Un aumento del contenido de colesterol celular estimula la degradación de la enzima H y disminuye el número de receptores para LDL. Por el contrario, una disminución del contenido de colesterol celular ocasiona un incremento de la síntesis de la enzima H y de receptores para LDL (por lo tanto aumenta la captación de colesterol – LDL desde el plasma).
Para obtener los parámetros cinéticos característicos de la enzima H de hepatocitos humanos se incubó una cantidad fija de enzima con concentraciones crecientes de sustrato y se cuantificó la cantidad de producto generado por minuto. Se observó que tiene un Km de 0,02 mM, concentración a la cual la velocidad (v 0 ) registrada corresponde a 60 mmoles/min. ¿Cuál es el valor de Vmáx para esta enzima?
b) Las estatinas conforman un grupo de medicamentos (naturales, semisintéticos y sintéticos) capaces de reducir los niveles de colesterol sérico por inhibición de la enzima H. En la actualidad estas son ampliamente utilizadas en el tratamiento de pacientes con hipercolesterolemia.
Como puede observarse en la figura de la izquierda, todas las estatinas presentan un componente estructural que es muy similar al mevalonato.
Marque con una ( X ) cuál/es de los siguientes pares de valores de Km y Vmáx presentados en la tabla pueden corresponder a los parámetros cinéticos de la enzima detectados en presencia de algunas de las estatinas.
Acetil-CoA
3 - Hidroxi- 3 - metil- glutaril-CoA (HMG-CoA)
Mevalonato
Colesterol (intracelular)
Colesterol de LDL (extracelular)
HMG-CoA reductasa
Endocitosis mediada por receptor
^
Km (mM) Vmáx (moles/min) ( ) 1 - 0,02 80 ( ) 2 - 0,02 120 ( ) 3 - 0,01 100 ( ) 4 - 0,01 120 ( ) 5 - 0,04 100 ( ) 6 - 0,04 120 ( ) 7 - 0,05 120 ( ) 8 - 0,03 120 Justifique su respuesta. c) Sabiendo que los valores seleccionados e el ítem anterior corresponden a los parámetros cinéticos registrados en presencia de Simvastatina, Pravastatina y Lovastatina, respectivamente ¿Cuál de las drogas es más efectiva como inhibidor de la enzima H? d) Teniendo en cuenta que todas las estatinas son administradas por vía oral ¿Cree que será necesariamente un mejor medicamento la droga que produzca la mayor inhibición de la enzima en su ensayo in vitro , o le parece que deberá tener en cuenta otros factores para su elección como fármaco hipocolesterolemiante de uso humano? LECTURA COMPLEMENTARIA: Las estatinas son los principales compuestos exógenos capaces de bloquear la síntesis endógena de colesterol. Estas actúan como inhibidores sobre la HMG-CoA reductasa al unirse a una porción del sitio de unión de la HMG-CoA, bloqueando el acceso de este sustrato, y reduciendo la producción de mevalonato. La primera estatina natural fue aislada de Pennicillium citrinum en 1971 y recibió el nombre de mevastatina o compactina. En la actualidad las comercialmente disponibles son lovastatina (Mevacor®, Merck Frosst), pravastatina (Pravachol®, Bristol-Meyers Squibb), simvastatina (Zocor®, Merck Frosst), fluvastatina (Lescol®, Novartis), atorvastatina (Lipitor®, Parke-Davis) y rosuvastatina (Crestor®, Astra-Zeneca). Para el caso específico de la cerivastatina (Baycol®/Lipobay®, Bayer), que se comercializó durante un buen periodo de tiempo, fue voluntariamente retirada del mercado desde 2001 después de determinar clínicamente que su empleo produce rabdomiolisis. Dentro de las estatinas sintéticas de última generación se encuentra la pitavastatina, la cual está disponible para uso en Japón, y en Europa se encuentra en la fase III de prueba.
- EN EL ENTORNO DE LA CÁTEDRA PODRÁ ENCONTRAR PROBLEMAS ADICIONALES QUE LE PERMITIRÁN SEGUIR UTILIZANDO LOS CONOCIMIENTO TEÓRICOS ADQUIRIDOS PARA LA RESOLUCIÓN DE SITUACIONES PROBLEMÁTICAS -
