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Este documento detalla los procesos de purificación de inmunoglobulinas (IgG, IgM y IgY) a través de diferentes técnicas, como clarificación, purificación y determinación de rendimiento, pureza y actividad específica. Se abordan métodos de un solo paso y dos pasos, utilizando proteínas como Proteína A, Proteína L, Proteína de unión a manosa y absorbentes tiofílicos, así como precipitación con ácido y intercambio iónico. Se incluyen descripciones de las etapas, el tiempo, el costo y el uso final del anticuerpo.
Tipo: Apuntes
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Purificación de Inmunoglobulinas Disminuye el background Facilita la concentración o purificación de antígenos Requerimiento de numerosas técnicas Marcación Elección del método Fuente del anticuerpo Policlonal vs monoclonal Suero, líquido ascítico, sobrenadante cultivo Tiempo Costo Uso final del anticuerpo y nivel del pureza requerido
Etapas en la purificación de anticuerpos Clarificación: remoción de células, restos celulares, agregados lipídicos o agregados proteicos (centrifugación, filtrado). Purificación: separación del anticuerpo de interés. Determinación de rendimiento, pureza y actividad específica: comparación con la solución original. Compromiso entre pureza y rendimiento vs. actividad Técnicas cromatografías de purificación
Métodos de dos pasos Precipitación con ácido caprílico u octanoico: Provoca la precipitación de la mayoría de las proteínas séricas excepto de la IgG. Se obtiene un 80% de pureza. Pueden no precipitar otras proteínas de alto peso molecular como la albúmina. Se utiliza como primer paso antes de otro método de purificación. Precipitación con sulfato de amonio: Provoca la precipitación de las moléculas de anticuerpos por disminuir su solubilidad. Diferentes concentraciones sales de amonio se utilizan para precipitar proteínas de diferentes características (Ac clarificado: 45% v/v). El precipitado debe resuspenderse y desalarse (filtración en gel, dialisis, ..). Se obtiene un 80% de pureza. También pueden estar contaminado con otras proteínas de alto peso molecular. Se utiliza como primer paso antes de otro método de purificación. Intercambio iónico: se utiliza intercambio aniónico por que Ig tienen punto isoeléctrico básico. DEAE (Di-etil-aminoetil). A) Selección positiva: Se utilizan pH elevados (pH 9) en la solución con Ac de modo que estos queden retenidos en a columna gracias a su carga neta negativa y se eluye incrementando la fuerza iónica (calibrar). Puede haber contaminación de endotoxinas o DNA (carga negativa). B) Selección negativa: Se utilizan pH mas bajos (pH 6-8) en la solución con Ac, estos NO quedan retenidos en la columna por tener carga neta positiva o cero y salen con el volumen muerto. Como método secundario tiene un rendimiento del 95%.
Métodos de un único paso Proteína L: Tiene alta afinidad por las cadenas k de las Ig (Peptostreptococcus magnus). (No une Igs de bovinos) Proteína de unión a manosa (MBP): Posee alta afinidad por la IgM Inmunoafinidad: requiere del antígeno específico o un anti-anticuerpo (anti-IgM). Métodos de dos pasos Precipitación con sulfato de amonio: Provoca la precipitación de las moléculas de anticuerpos por disminuir su solubilidad. Se utiliza como primer paso antes de otro método de purificación. Cromatografía de exclusión molecular: malla porosa de dextran o agarosa. Separacion de proteínas según su tamaño.
Cromatografías de inmunoafinidad Matriz (sepharosa o gel) con antígeno purificado Matriz (sepharosa o gel) con un anticuerpo purificado
