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Controle do
Crescimento
Microbiano
O controle científico do crescimento microbiano começou somente há cerca de 100 anos. Lembre- -se do Capítulo 1 que o trabalho de Pasteur sobre os micro-organismos levou os cientistas a acredi- tarem que os micróbios seriam uma possível causa de doenças. Na metade do século XIX, o médico húngaro Ignaz Semmelweis e o médico inglês Joseph Lister utilizaram essa ideia em algumas das primeiras práticas de controle microbiano para procedimentos médicos. Essas práticas incluíam a lavagem das mãos com hipoclorito de cálcio, que matava os micro-organismos, e a utilização de técnicas de cirurgia assépticas para impedir a contaminação microbiana de feridas cirúrgicas. Até aquele momento, as infecções adquiridas em hospital, ou infecções nosocomiais, eram a causa de morte em pelo menos 10% dos casos cirúrgicos, e as mortes de parturientes chegavam a 25%. A ignorân cia a respeito dos micro-organismos era tanta que, durante a Guerra Civil Americana, um cirurgião poderia limpar seu bisturi na sola de sua bota, entre as incisões.
No último século, os cientistas continuaram a desenvolver uma série de métodos físicos e agentes químicos para controlar o crescimento microbiano. No Capítulo 20, dis- cutiremos os métodos para o controle dos micro-organismos após a infecção ter ocorrido, principalmente a antibioticoterapia.
SOB O MICROSCÓPIO
Bactérias presas em uma membrana filtrante (note os dois poros presentes na figura).
A filtração pode ser usada para remover micro-or- ganismos de água e de soluções. Em qual situação este é o único método prático para a eliminação de micro-organismos indesejáveis? Procure pela resposta neste capítulo.
P & R
Microbiologia 185
A terminologia do controle microbiano
OBJETIVO DO APRENDIZADO 7-1 Definir os seguintes termos-chave relacionados ao con trole microbiano: esterilização, desinfecção, antissepsia, degerminação, sanitização, biocida, germicida, bacteriostase e assepsia.
Um termo frequentemente usado, e mal empregado, ao discutir o controle do crescimento microbiano é a esterilização. Esterili zação é a remoção ou destruição de todas as formas de vida microbiana. Os príons, no entanto, são altamente resistentes a todos os modos de esterilização (veja a página 203), o que na prática requer a mo- dificação deste termo (mesmo que ainda não estabelecido). Por- tanto, a definição de esterilização em geral considera a ausência de príons. O aquecimento é o método mais comum usado para matar micro-organismos, incluindo as formas mais resistentes, como os endosporos. Agentes utilizados em processos de esterilização são denominados esterilizantes. Líquidos ou gases podem ser esterili- zados por filtração. As pessoas pensam que os alimentos enlatados à venda em supermercados são completamente estéreis. Na realidade, o trata- mento com calor requerido para assegurar a esterilidade absoluta iria degradar o ali mento desnecessariamente. Em vez disso, os ali- mentos são submetidos somente ao calor suficiente para destruir os endosporos de Clostridium botulinum, que pode produzir uma toxina mortal. Esse tratamento limitado de calor é denominado esterilização comercial. Os endosporos de uma série de bactérias termofílicas, capazes de causar deterioração dos alimentos, mas não doença em humanos, são consideravelmente mais resistentes ao calor que C. botulinum. Se estiverem presentes, irão sobreviver, mas sua sobrevivência normalmente não tem consequência prá- tica; eles não crescerão nas temperaturas normais de armazena- mento do alimento. Se os enlatados de um supermercado fossem incubados em temperaturas na faixa de crescimento dessas termó- filas (acima de 45°C), uma grande quantidade de alimentos iria se deteriorar.
A esterilização completa muitas vezes não é necessária em ou- tras situações. Por exemplo, as defesas normais do corpo podem lidar com alguns micro-organismos que penetram em uma ferida cirúrgica. Um copo ou um garfo em um restaurante necessita ape- nas de um controle microbiano suficiente para prevenir a trans- missão de micro-organismos possivelmente patogênicos de uma pessoa para outra. O controle voltado para a destruição de micro-organismos no- civos é denominado desinfecção. Este termo normalmente refere- -se à destruição de patógenos na forma vegetativa (não formadores de endosporos), o que não é o mesmo que esterilidade completa. Processos de desinfecção podem ser realizados com o uso de subs- tâncias químicas, radiação ultravioleta, água fervente ou vapor. Na prática, o termo é mais comumente aplicado ao uso de um produ- to químico (um desinfetante) para tratar uma superfície ou subs- tância inerte. Quando esse tratamento é dirigido a tecidos vivos, é denominado antissepsia , e o produto químico é então denomina- do antisséptico. Assim, na prática, uma mesma substância química pode ser denominada um desinfetante para um determinado uso e um antisséptico para outro. É claro que muitos produtos apro- priados para lavar uma mesa, por exemplo, seriam muito agressivos para serem usados sobre tecidos vivos. Existem variações da desinfecção e da antissepsia. Por exem- plo, quando alguém precisa receber uma injeção, a pele é limpa com álcool – o processo de degerminação , que resulta principal- mente na remoção mecânica, em vez da morte, da maioria dos micro-organismos em uma área limitada. Os copos, as louças e os talheres dos restaurantes estão sujeitos à sanitização , que tem a fi- nalidade de reduzir as contagens microbianas a níveis seguros de saúde pública e minimizar as chances de transmissão de doença de um usuário para outro. Isso normalmente é obti do por lavagem em altas temperaturas ou, no caso das louças em um bar, lavagem em uma pia seguida por imersão em um desinfetante químico. A Tabela 7.1 resume a terminologia relacionada ao controle do crescimento microbiano.
Tabela 7.1 Terminologia relacionada ao controle do crescimento microbiano
Definição Comentários
Esterilização Destruição ou remoção de todas as formas de vida microbiana, in- cluindo os endosporos, possivelmente com exceção dos príons.
Normalmente realizada com vapor sob pressão ou um gás esterili- zante, como o óxido de etileno. Esterilização comercial
Tratamento de calor suficiente para matar os endosporos de Clostridium botulinum em alimentos enlatados.
Os endosporos mais resistentes de bactérias termófilas podem sobreviver, mas não irão germinar e crescer sob condições normais de armazenamento. Desinfecção Destruição de patógenos na forma vegetativa. Pode fazer uso de métodos físicos ou químicos. Antissepsia Destruição de patógenos na forma vegetativa em tecidos vivos. O tratamento é quase sempre por antimicrobianos químicos. Degermina- ção
Remoção de micro-organismos de uma área limitada, como a pele ao redor do local da aplicação de uma injeção.
Basicamente uma remoção mecânica feita com algodão embebido em álcool. Sanitização Tratamento destinado a reduzir as contagens microbianas nos utensílios alimentares a níveis seguros de saúde pública.
Pode ser feita por meio de lavagem em altas temperaturas ou imer- são em um desinfetante químico.
Microbiologia 187
Danos às proteínas e aos ácidos nucleicos
As bactérias algumas vezes são vistas como “pequenos sacos de enzimas”. As enzimas, que são principalmente proteínas, são vitais para todas as atividades celulares. Lembre-se de que as proprie- dades funcionais das proteínas resultam de sua forma tridimen- sional (veja a Figura 2.15, página 46). Essa forma é mantida por ligações químicas que unem as porções adjacentes da cadeia de aminoácidos onde ela se dobra sobre si mesma. Algumas dessas ligações são ligações de hidrogênio, que são suscetíveis ao rompi- mento pelo calor ou por certos produtos químicos; o rompimento resulta em desnaturação da proteína. As ligações covalentes, que são mais fortes, também estão sujeitas ao ataque. Por exemplo, as pontes dissulfeto, que desempe nham um papel importante na es- trutura das proteínas ao unir os aminoácidos com grupos sulfi- drila expostos (–SH), podem ser rompidas por certos produtos químicos ou calor suficiente.
Os ácidos nucleicos DNA e RNA são os transportadores da in- formação genética celular. Danos a esses ácidos nucleicos por calor, radiação ou substâncias químicas frequentemente são letais para a célula, que não pode mais se replicar, nem realizar funções metabó- licas normais como a síntese de enzimas. TESTE SEU CONHECIMENTO
3 Um agente químico de controle microbiano que afeta a membrana plasmática de micro-organismos também é capaz de afetar os humanos? 7-
Métodos físicos de controle microbiano
OBJETIVOS DO APRENDIZADO 7-4 Comparar a efetividade do calor úmido (fervura, autoclave, pasteurização) e calor seco.
1.000.
Redução de um log = morte de 90% da população
6,
5,
4,
3,
2,
1,
0
log
10
do número de células sobreviventes
Número aritmético de células sobreviventes 0 1 2 3 4 5 6 Tempo (min)
Alta carga populacional
6,
5,
4,
3,
2,
1,
0
log
10
do número de células sobreviventes
0 1 2 3 4 5 6 Tempo (min)
Baixa carga populacional
Escala logarítmica
Escala aritmética
(a) Os dados são plotados logarítmica (linha vermelha) e aritmeticamente (linha azul). Este gráfico foi construído de modo que as escalas logarítmica e aritmética coincidam em dois pontos: em uma célula e em 1 milhão de células. Neste exemplo, as células estão morrendo a uma taxa constante de 90% a cada minuto. Note que a tentativa de plotar a população de forma aritmética não é prática; aos três minutos, a população de 1.000 células seria apenas um centésimo da distância gráfica entre 100.000 e a linha de base. Números logarítmicos são necessários para demonstrar adequadamente esta situação em gráficos, mesmo com nossa percepção simplificada da situação.
(b) Efeito da alta ou baixa carga microbiana inicial. Se a taxa de morte for constante, será necessário um maior tempo para matar todos os indivíduos de uma população maior que os de uma menor. Isto é verdade tanto para os tratamentos que usam calor quanto para os químicos.
O conceito de uma curva de morte para populações microbianas, incluindo os elementos de tempo e tamanho da população inicial, é especialmente útil na preservação de alimentos e na esteriliza- ção de meios de cultura ou materiais médicos.
Conceito-chave
É necessário usar números logarítmicos para a construção efetiva de gráficos de populações microbianas. Curvas de morte logarítmicas podem demonstrar, por exemplo, os efeitos do tamanho inicial da população no tempo necessário para atingir a esterilidade.
FIGURA FUNDAMENTAL
Figura 7.
Uma curva de morte microbiana
188 Tortora, Funke & Case
7-5 Descrever como a filtração, as baixas temperaturas, a alta pressão, a dessecação e a pressão osmótica suprimem o crescimento microbiano. 7-6 Explicar como a radiação mata as células.
Já na Idade da Pedra, é provável que os seres humanos utilizassem algum método físico de controle microbiano para preservar os ali- mentos. A secagem (dessecação) e o uso do sal (pressão osmótica) provavelmente estiveram entre as técnicas iniciais. Ao selecionar métodos de controle microbiano, deve-se con- siderar os efeitos desses métodos sobre outras coisas, além dos mi- cro-organismos. Por exemplo, certas vitaminas ou antibióticos em uma solução podem ser inativados pelo calor. Muitos materiais de laboratório ou hospitalares, como as sondas de borracha e látex, são danificados por ciclos repetidos de aquecimento. Existem também considerações econômicas; por exemplo, pode ser mais barato usar instrumentos plásticos pré-esterilizados, descartáveis, do que lavar e reesterilizar repetidamente objetos de vidro.
Calor
Uma visita a qualquer supermercado demonstrará que a preser- vação pelo uso de calor em alimentos enlatados representa um dos métodos mais comuns de conservação de alimentos. Meios de cultura e vidrarias de laboratório, assim como muitos instru- mentos hospitalares, também são normalmente esterilizados pelo calor. O calor aparentemente mata os micro-organismos pela desnaturação de suas enzimas, que resulta em mudanças na for- ma tridimensional dessas proteínas, inativando-as (veja a Figura 5.6, página 119). A resistência ao calor varia entre diferentes micro-organismos; estas diferenças podem ser expressas pelo conceito de ponto de morte térmica. O ponto de morte térmica ( PMT ) é a menor tem- peratura em que todos os micro-organismos em uma suspen são líquida específica serão mortos em 10 minutos. Outro fator a ser considerado na esterilização é o tempo reque- rido para o material se tornar estéril. Esse período é expresso como tempo de morte térmica ( TMT ), o tempo mínimo em que todas as bactérias em uma cultura líquida específica serão mortas, em uma dada temperatura. Ambos o PMT e o TMT são orientações úteis, que indicam a severidade do tratamento necessário para matar uma dada população de bactérias. O tempo de redução decimal ( TRD , ou valor D) é o terceiro conceito relacionado à resistência bacteriana ao calor. TRD é o tempo, em minutos, em que 90% de uma população de bactérias em uma dada temperatura serão mortas (na Tabela 7.2 e na Figura 7.1a, o TRD é 1 minuto). No Capítulo 28, você irá encontrar uma aplicação importante do TRD para a indústria de enlatados. Veja a discussão sobre o tratamento 12D em alimentos enlatados no Ca- pítulo 28.
Esterilização por calor úmido
O calor úmido mata os micro-organismos principalmente pela coagulação proteica (desnaturação), que é causada pela ruptura de ligações de hidrogênio que mantêm as proteínas em sua estrutura tridimensional. Esse processo de coagulação é familiar a qualquer pessoa que já observou uma clara de ovo fritando. Um tipo de esterilização por calor úmido é a fervura, que mata as formas vegetativas dos patógenos bacterianos, quase todos os
vírus, e os fungos e seus esporos dentro de cerca de 10 minutos, normalmente muito mais rápido. O vapor de fluxo livre (não pres- surizado) é equivalente em temperatu ra à água fervente. Os endos- poros e alguns vírus, contudo, não são destruídos tão rapidamente. Alguns tipos de vírus da hepatite, por exemplo, podem sobreviver a até 30 minutos de fervu ra, e alguns endosporos bacterianos podem resistir à fervura por mais de 20 horas. Desse modo, a fervura nem sempre é um procedimento confiável de esterilização. Contudo, a fervura breve, mesmo em altitudes elevadas, matará a maioria dos patógenos. O uso da fervura para sanitizar mamadeiras de bebê é um exemplo conhecido. A esterilização confiável com calor úmido requer temperaturas mais elevadas que a da água fervente. Essas temperaturas elevadas são mais comumente obtidas por vapor sob pressão, em uma auto- clave (Figura 7.2). A autoclave é o método preferido de sanitização, a não ser que o material a ser esterilizado possa ser dani ficado por calor ou umidade. Quanto maior a pressão na autoclave, maior a temperatura. Por exemplo, quando o vapor de fluxo livre a uma temperatura de 100°C é colocado sob uma pressão de 1 atmosfera acima da pressão ao nível do mar – isto é, cerca de 15 libras de pressão por polegada quadrada (psi) – a temperatura sobe para 121°C. Aumentando a pressão para 20 psi, a temperatura sobe para 126°C. As relações en- tre temperatura e pressão são mos tradas na Tabela 7.3. A esterilização com autoclave é mais eficaz quando os orga- nismos são contatados diretamente pelo vapor ou estão contidos em um pequeno volume de solução aquosa (constituída primaria- mente por água). Sob essas condições, o vapor a uma pressão em torno de 15 psi (121ºC) matará todos os organismos (com exceção dos príons, veja a página 392) e seus endosporos em cerca de 15 minutos. A autoclave é um método usado para esterilizar meios de cul- tura, instrumentos, vestimentas, equipamento intravenoso, apli- cadores, soluções, seringas, equipamento de transfusão e diversos outros itens que podem suportar altas temperaturas e pressões. As grandes autoclaves industriais são denominadas retortas (veja a Figura 28.2, página 795), mas o mesmo princípio se aplica para a panela de pressão doméstica comum, na produção de conservas caseiras. O calor requer tempo extra para alcançar o centro de materiais sólidos como as carnes enlatadas, pois esses materiais não desen- volvem correntes de convecção de distribuição de calor eficientes como ocorre nos líquidos. O aquecimento de recipientes grandes também requer tempo extra. A Tabela 7.4 mostra as exigências de tempo para esterilizar líquidos em recipientes de diferentes tama- nhos. Ao contrário da esterilização de soluções aquosas, a esterili- zação da superfície de um sólido requer que o vapor realmente entre em contato com ela. Para a esterilização de vidros secos, bandagens e similares, deve-se ter o cuidado de assegurar que o vapor entre em contato com todas as superfícies. Por exemplo, fo- lhas de papel alumínio não são afetadas pelo vapor, e não devem ser usadas para embalar materiais que serão esterilizados; em vez disso, deve-se usar papel comum. Cuidado também é necessário para evitar o aprisionamento de ar no fundo de um recipiente seco, pois o ar aprisionado não será substituído pelo vapor, que é mais leve que o ar. O ar aprisionado é o equivalente a um peque-
190 Tortora, Funke & Case
no forno de ar quente que, como veremos em breve, requer uma temperatura maior e mais tempo para esterilizar os materiais. Os recipientes que podem aprisionar ar devem ser colocados em uma posição invertida, para que o vapor force o ar para fora. Os produtos que não permitem a penetração de umidade, como o óleo mineral ou a vaselina, não são esterilizados pelos mesmos métodos usados para soluções aquosas. Vários métodos comercialmente disponíveis indicarão se a es- terilização foi obtida por tratamento com calor. Alguns deles são reações químicas em que um indicador altera sua cor quando os tempos e temperaturas corretos tiverem sido atingidos (Figura 7.3). Em alguns métodos, a palavra estéril ou autoclavado aparece nas embalagens ou em adesivos. Em outro método, uma pastilha con- tida dentro de um frasco de vidro derrete. Um teste amplamente usado consiste na preparação de determinadas espécies de endos- poros bacterianos impregnados em tiras de papel. Após a autoclave, as tiras são então inoculadas assepticamente em meios de cultura. O crescimento nos meios de cultura indica a sobrevivência dos en- dosporos e, assim, o processamento inadequado. Outros métodos usam suspensões de endosporos que podem ser liberadas, após o aquecimento, em um meio de cultura circundante dentro do mes- mo frasco. O vapor sob pressão falha em esterilizar quando o ar não é completamente removido. Isso pode acontecer com o fechamento prematuro da válvula ejetora automática da autoclave (veja a Fi- gura 7.2). Os princípios da esterilização com o uso do calor têm relação direta com a produção de conservas caseiras. Qualquer pessoa familiarizada com a produção de conservas caseiras sabe
que o vapor deve fluir vigorosamente para fora da válvula da tam- pa por vários minutos, para remover todo o ar antes que a panela de pressão esteja selada. Se o ar não é completamente removido, o recipiente não atinge a temperatura esperada para uma dada pressão. Devido à possibilidade de botulismo, um tipo de into- xicação alimentar resultante de métodos inadequados de envasa- mento (veja o Capítulo 22, página 616), as pessoas envolvidas na produção de conservas caseiras deveriam obter orientações confi- áveis e segui-las rigorosamente.
Pasteurização Lembre-se do Capítulo 1 que, nos primórdios da microbiologia, Louis Pasteur descobriu um método prático de prevenir a deterio- ração da cerveja e do vinho. Pasteur usou um aquecimento leve, que era suficiente para matar os organismos que causavam o pro- blema específico de deterioração, sem alterar consideravelmente o sabor do produto. O mesmo princípio foi aplicado posterior- mente ao leite, para produzir o que atualmente denominamos leite pasteurizado. O objetivo ao pasteurizar o leite é eliminar micro- -organismos patogênicos. O processo também reduz o número de micro-organismos, prolongando a qualidade do leite quando mantido sob refrigeração. Muitas bactérias relativa mente resis- tentes ao calor ( termodúricas ) sobrevivem à pasteurização, mas têm pouca probabilidade de causar doença ou deteriorar o leite refrigerado. Outros produtos além do leite, como o sorvete, o iogurte e a cerveja, possuem seus próprios tempos e temperaturas de pasteu- rização, que com frequência diferem consideravelmente. Existem diversas razões para essas variações. O aquecimento, por exem- plo, é menos eficiente em alimentos mais viscosos, e as gorduras podem ter um efeito protetor para os micro-organismos nos ali- mentos. A indústria de laticínios utiliza rotineiramente um teste para determinar se os produtos foram pasteurizados: o teste da fosfatase (a fosfatase é uma enzima naturalmente encontrada no leite). Se o produto sofreu pasteurização, a fosfatase foi inativada. Atualmente, a maioria dos processos de pasteurização do lei- te utiliza temperaturas mínimas de 72ºC, mas por apenas 15 se- gundos. Esse tratamento, conhecido como pasteurização de alta temperatura e curto tempo ( HTST , de high-temperature, short- -time), é aplicado enquanto o leite flui continuamente por uma serpentina. Além de matar os patógenos, a pasteurização HTST diminui as contagens bacterianas totais; assim, o leite se conserva bem sob refrigeração. O leite também pode ser esterilizado – algo muito diferente da pasteurização – por tratamentos de temperatura ultraelevada ( UHT , de ultra-high temperature), podendo ser armazenado sem refrigeração por vários meses (veja também esterilização comercial, na página 794). O leite UHT é muito comercializado na Europa, sendo especialmente útil em regiões menos desenvolvidas do mun- do, onde condições apropriadas de refrigeração nem sempre estão disponíveis. Nos Estados Unidos, o tratamento de UHT algumas vezes é usado em recipientes pequenos de creme para o café, encon- trados em restaurantes. Para evitar dar ao leite um sabor de cozido, é usado um sistema UHT em que o leite nunca toca uma superfície mais quente que ele próprio enquanto é aquecido por vapor. Ge- ralmente, o leite líquido é aspergido por um bocal em uma câmara com vapor sob pressão em altas temperaturas. Como um pequeno
Figura 7.3 Exemplos de indicadores de esterilização. As ti ras in- dicam se o item foi esterilizado corretamente; a palavra NÃO (NOT) aparece se o aquecimento foi inadequado. Na ilustração, o indicador que está envolto na lâmina de papel alumínio não foi esterilizado porque o vapor não conseguiu penetrar na lâmina.
P O que deveria ter sido usado em vez de papel alumínio para envolver os itens?
Microbiologia 191
volume de fluido aspergido em uma atmosfera de vapor em alta temperatura expõe uma superfície relativamente grande, as gotí- culas do fluido são aquecidas pelo vapor, e as temperaturas de este- rilização são alcançadas quase que instantaneamente. Após atingir uma temperatura de 140 oC por 4 segundos, o fluido é rapidamente resfriado em uma câmara de vácuo. O leite (ou suco) é então empa- cotado em uma embalagem hermética e pré-esterilizada. Os tratamentos de calor que acabamos de discutir ilustram o conceito de tratamentos equivalentes : à medida que a temperatura é aumentada, muito menos tempo é necessário para matar o mes- mo número de micro-organismos. Por exemplo, a destruição de endosporos altamente resistentes pode levar 70 minutos a 115°C, enquanto apenas 7 minutos seriam necessários a 125°C. Ambos os tratamentos produzem o mesmo resultado.
Esterilização por calor seco
O calor seco mata por efeitos de oxidação. Uma analogia simples é a lenta carbonização do papel em um forno aquecido, mesmo quan- do a temperatura permanece abaixo do ponto de ignição do papel. Um dos mais simples métodos de esterilização com calor seco é a chama direta. Você utilizará esse proce dimento muitas vezes no la- boratório de microbiologia, quando esterilizar alças de inoculação. Para esterilizar efetivamente a alça de inoculação, você aquece o fio até obter um brilho vermelho. Um princípio similar é usado na incineração, um modo efetivo de esterilizar e eliminar papel, copos, sacos e vestimentas contaminadas. Outra forma de esterilização por calor seco é a esterilização em ar quente. Os itens esterilizados por esse procedimento são co- locados em um forno. Geralmente, uma temperatura de cerca de 170°C mantida por aproximadamente duas horas assegura a este- rilização. Um tempo maior e uma temperatura mais alta (relativos ao calor úmido) são necessários, pois o calor na água é conduzi- do mais rapidamente para um corpo frio do que o calor no ar. Por exemplo, imagine os diferentes efeitos da imersão de sua mão em água fervente a 100°C e de mantê-la em um forno de ar quente na mesma temperatura pela mesma quantidade de tempo.
Filtração
Lembre-se do Capítulo 6 que a filtração é a passagem de um líquido ou gás por meio de um material seme- lhante a uma tela, com poros pequenos o suficiente para reter os micro-organismos (frequentemente o mesmo aparato usado para contagem; veja a Figura 6.18, página 177). Um vácuo é criado no frasco coletor, e a pressão do ar força a passagem do líquido pelo filtro. A filtração é usada para esterilizar os materiais sensíveis ao calor, como alguns meios de cultura, enzimas, vacinas e soluções antibióticas. Algumas salas de cirurgia e salas ocupadas por pacientes queimados recebem ar filtrado para reduzir o número de micro- -organismos transmitidos pelo ar. Os filtros de partículas de ar de alta eficiência ( HEPA , de high-efficiency particulate air) remo- vem quase todos os micro-organismos maiores que cerca de 0, μm de diâmetro. Nos primórdios da microbiologia, filtros ocos em forma de velas feitos de porcelana não esmaltada eram usados para filtrar os líquidos. As passagens longas e indiretas através das paredes
do filtro adsorviam as bactérias. Os patógenos invisíveis que passavam através dos filtros (e que causavam doenças como a raiva) eram denominados vírus filtráveis. Veja a discussão sobre a filtração nos processos modernos de tratamento de água, na página 782. Recentemente, os filtros de membrana , compostos de subs- tâncias como ésteres de celulose ou polímeros plásticos, tornaram- -se populares para uso industrial e laboratorial (Figura 7.4). Esses filtros possuem apenas 0,1 mm de espessura. Os poros de um filtro de membrana incluem, por exemplo, tamanhos de 0,22 μm e 0, μm, que são destinados a bactérias. Entretanto, algumas bactérias muito flexíveis, como as espiroquetas ou os micoplasmas sem pa- rede celular, algumas vezes passam através desses filtros. Existem filtros com poros tão pequenos quanto 0,01 μm, um tamanho que retém os vírus e mesmo algumas moléculas grandes de proteína.
Baixas temperaturas
O efeito das baixas temperaturas sobre os micro-organismos de- pende do micróbio específico e da intensidade da aplicação. Por exemplo, nas temperaturas dos refrigeradores comuns (0 a 7°C), a taxa metabólica da maioria dos micro-organismos é tão reduzida que eles não podem se reproduzir ou sintetizar toxinas. Em outras
P & R
Filtrado estéril
Rolha de algodão na linha de vácuo assegurando a esterilidade
Tampa
Filtro de membrana
Frasco da amostra
Linha de vácuo
Figura 7.4 Esterilização com filtro, com uma unidade plástica descartável, pré-esterilizada. A amostra é colocada na câmara superior e forçada através do filtro de membrana pelo vácuo, para a câmara inferior. Os poros do filtro de membrana são menores que as bactérias, e assim, elas são retidas no filtro. A amostra este rilizada pode então ser decantada na câmara inferior. Um equipamen to similar com discos de filtro removíveis é usado para contar as bactérias em amostras (veja a Figura 6.18). P Como um aparato plástico de filtração pode ser pré-esterilizado? (Con- sidere que o plástico não pode ser esterilizado por calor.)
Microbiologia 193
A indústria de alimentos recentemente renovou seu interesse no uso da radiação para a conservação de alimentos (discutida mais amplamente no Capítulo 28). A radiação ionizante de baixa penetração, usada durante anos em muitos países, foi aprovada nos Estados Unidos para processamento de temperos e alguns tipos de carne e de vegetais. A radiação ionizante, especialmente os feixes de elétrons de alta energia, é usada na esterilização de produtos farmacêuticos e materiais descartáveis dentários e médicos, como seringas plásticas, luvas cirúrgicas, materiais de sutura e cateteres. Como forma de proteção contra o bioterrorismo, os correios fre- quentemente usam a radiação para esterilizar certos tipos de cor- respondências. A radiação não ionizante possui um comprimento de onda maior que o da radiação ionizante, normalmente acima de 1 nm. O melhor exemplo de radiação não ionizante é a luz ultravioleta (UV). A luz UV causa danos ao DNA das células expostas, pro- duzindo ligações entre as bases pirimídicas adjacentes, normal- mente timinas nas cadeias de DNA (veja a Figura 8.20, página 230). Esses dímeros de timina inibem a replicação correta do DNA durante a reprodução da célula. Os comprimentos de onda UV mais eficazes para matar os micro-organismos são os de cerca de 260 nm; esses comprimentos são absorvidos especificamente pelo DNA celular. A radiação UV também é usada para controlar os micro-organismos no ar. Uma lâmpada UV ou “germicida” é comumente encontrada em salas de hospitais, enfermarias, salas de cirurgia e refeitórios. A luz UV também é usada para desinfe- tar vacinas e outros produtos médicos. Uma grande desvantagem da luz UV como desinfetante é que a radiação não é muito pene- trante; assim, os organismos a serem mortos devem ser expos- tos diretamente aos raios. Organismos protegidos por sólidos e coberturas como papel, vidro e tecidos não são afetados. Outro
problema potencial é que a luz UV pode lesionar os olhos huma- nos, e a exposição prolongada pode causar queimaduras e câncer de pele em seres humanos. A luz solar contém um pouco de radiação UV, mas os compri- mentos de onda mais curtos – aqueles mais eficazes contra as bac- térias – são filtrados pela camada de ozônio da atmosfera. O efeito antimicrobiano da luz solar está quase inteiramente relacionado à formação de oxigênio livre no citoplasma (veja o Capítulo 6, página 161). Muitos pigmentos produzidos por bactérias fornecem prote- ção contra a luz solar. As micro-ondas não possuem um efeito muito direto sobre os micro-organismos, e as bactérias podem ser facilmente isoladas do interior de fornos de micro-ondas recém-utilizados. Os alimentos contendo umidade são aquecidos pela ação das micro-ondas, e o calor matará a maioria dos patógenos na forma vegetativa. Os ali- mentos sólidos se aquecem de modo desigual, devido à distribuição heterogênea da umidade. Por essa razão, a carne de porco cozida em um forno de micro-ondas tem sido responsável por surtos de triquinose. TESTE SEU CONHECIMENTO
3 Como prevenir o crescimento microbiano em alimentos enlatados? 7- 3 Por que um enlatado contendo somente carne de porco requer um tempo maior de esterilização a uma dada temperatura do que um que contenha sopa com pedaços de carne de porco? 7- 3 Qual é a relação entre o efeito mortal da radiação e as formas de radi- cais hidroxilas do oxigênio? 7-
A Tabela 7.5 resume os métodos físicos de controle microbiano.
10 –5^ nm 10 –3^ nm 1 nm 10 3 nm 106 nm (10 9 nm) 103 m
1 m
Raios gama Raios X^ UV^ Infravermelho^ Micro-ondas^ Ondas de rádio
Energia aumenta
Comprimento de onda aumenta
200 nm 250 nm 300 nm 400 nm 550 nm 280 nm 295 nm 330 nm
350 nm 450 nm 500 nm 600 nm 650 nm 700 nm 750 nm
Luz ultravioleta (UV) Luz visível
Bactericida
Bronzeamento
UV na luz solar
Figura 7.5 O espectro de energia radiante. A luz visível e outras formas de energia radiante se irradiam pelo espaço como ondas de vários comprimentos. A radiação ionizante, como os raios gama e X, possui um comprimento de onda mais curto que 1 nm. A radiação não ionizante, como a luz ultravioleta (UV), possui um comprimento de onda entre 1 nm e cerca de 380 nm, onde o espectro visível começa.
P Como o aumento da radiação UV (devido à diminuição da camada de ozônio) pode afetar os ecossistemas da Terra?
194 Tortora, Funke & Case
Tabela 7.5 Métodos físicos usados para o controle do crescimento microbiano
Método Mecanismo de ação Comentário Uso preferencial
Calor
- Calor úmido a. Fervura ou pas- sagem de vapor
Desnaturação de proteínas. Mata células bacterianas e fúngicas patogêni- cas na forma vegetativa e quase todos os vírus em 10 minutos; menos efetivo para endosporos.
Pratos, bacias, jarros, equipamentos e uten- sílios variados.
b. Autoclave Desnaturação de proteínas. Método muito efetivo de esterilização; em aproximadamente 15 psi de pressão (121°C), todas as células vegetativas e seus endosporos são mortos em cerca de 15 minutos.
Meios microbiológicos, soluções, roupa de cama, utensílios, curativos, equipamento e outros itens que podem suportar temperatu- ra e pressão.
- Pasteurização Desnaturação de proteínas. Tratamento com calor para o leite (72°C por cerca de 1 5 segundos) que mata todos os pa- tógenos e a maioria dos não patogênicos.
Leite, creme e certas bebidas alcoólicas (cerveja e vinho).
- Calor seco a. Chama direta Queima dos contaminantes até se tornarem cinzas.
Método muito eficaz de esterilização. Alças de inoculação.
b. Incineração Queima até se tornarem cinzas. Método muito eficaz de esterilização. Copos de papel, curativos contaminados, carcaças de animais, sacos e panos de limpeza. c. Esterilização com calor quente
Oxidação. Método muito eficaz de esterilização, mas re- quer temperatura de 170°C por cerca de duas horas.
Vidros vazios, instrumentos, agulhas e serin- gas de vidro.
Filtração Separação das bactérias do líqui- do de suspensão.
Remove os micro-organismos por meio da passagem de um líquido ou gás através de um material semelhante a uma tela; a maioria dos filtros em uso consiste em acetato de celulose ou nitrocelulose.
Útil para esterilizar líquidos (enzimas, vaci- nas) que são destruídos pelo calor.
Frio
- Refrigeração Diminuição das reações químicas e possíveis alterações nas pro- teínas.
Possui efeito bacteriostático. Conservação dos alimentos, drogas e cul- turas.
- Congelamento pro- fundo (veja o Capítu- lo 6, página 170)
Diminuição das reações químicas e possíveis alterações nas pro- teínas.
Um método eficaz para conservar culturas mi- crobianas, em que as culturas são rapidamente congeladas a –50 e –95°C.
Conservação dos alimentos, drogas e cul- turas.
- Liofilização (veja o Capítulo 6, página
Diminuição das reações químicas e possíveis alterações nas pro- teínas.
Método mais eficaz para a conservação pro- longada de culturas microbianas; a água é re- movida por alto vácuo em baixa temperatura.
Conservação dos alimentos, drogas e cul- turas.
Alta pressão Alteração da estrutura molecular de proteínas e carboidratos.
Conservação de cores, sabores e valores nu- tricionais.
Sucos de fruta.
Dessecação Interrupção do metabolismo. Envolve a remoção de água dos micro-organis- mos; principalmente bacteriostático.
Conservação dos alimentos.
Pressão osmótica Plasmólise. Resulta na perda de água das células micro- bianas.
Conservação dos alimentos.
Radiação
- Ionizante Destruição do DNA. Não disseminado na esterilização de rotina. Método usado para esterilizar produtos farmacêuticos e suprimentos médicos e dentários.
- Não ionizante Danos ao DNA. Radiação não muito penetrante. Controle de ambientes fechados com lâm- pada UV (germicida).
196 Tortora, Funke & Case
Bifenóis
Os bifenóis são derivados do fenol que possuem dois grupos fe- nólicos ligados por uma ponte (bi indica dois). Um bifenol, o he- xaclorofeno (Figuras 7.6 e 7.7c) é um dos ingredientes da loção pHisoHex, usada em procedimentos de controle microbiano cirúr- gico e hospitalar. Estafilococos e estreptococos gram-positivos, que podem causar infecções de pele em recém-nascidos, são especial- mente suscetíveis ao hexaclorofeno, que é usado com frequência
para controlar essas infecções em berçários. Contudo, o uso exces- sivo deste bifenol, como o banho de lactentes com ele várias vezes por dia, pode levar a danos neurológicos. Outro bifenol amplamente utilizado é o triclosano (Figura 7.7d), um dos componentes presentes nas formulações de sabo- netes antibacterianos e pastas de dente. O uso do triclosano foi incorporado inclusive em tábuas de cozinha e em cabos de facas e outros utensílios de cozinha feitos de plástico. Seu uso está tão difundido atualmente que bactérias resistentes a este agente já foram relatadas, e há uma preocupação quanto ao efeito do tri- closano sobre a resistência de micro-organismos a certos antibió- ticos. O triclosano inibe a ação de uma enzima necessária para a biossíntese de ácidos graxos (lipídeos), afetando principalmente a integridade da membrana plasmática. É especialmente efeti- vo contra bactérias gram-positivas, mas também funciona bem contra fungos e bactérias gram-negativas. Existem algumas ex- ceções, como a Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria gram-ne- gativa que é muito resistente ao triclosano, bem como a muitos outros antibióticos e desinfetantes (veja a discussão nas páginas 308, 414 e 591).
Biguanidas As biguanidas apresentam um amplo espectro de atividade, com um mecanismo de ação que afeta principalmente as membranas celulares bacterianas. Elas são especialmente efetivas contra bac-
Staphylococcus aureus (gram-positivo)
Cloro
Escherichia coli (gram-negativa)
Pseudomonas aeruginosa (gram-negativa)
Cloro (^) Cloro
Zona de inibição
Hexaclorofeno O-fenilfenol
Quat
Hexaclorofeno
O-fenilfenol
Quat
Hexaclorofeno O-fenilfenol
Quat
Figura 7.6 Avaliação de desinfetantes pelo método de disco-difusão. Neste experimen- to, discos de papel são embebidos em uma solução de desinfetante e colocados na superfície de meio nutriente em que uma cultura de bactérias-teste foi semeada para produzir um crescimento uniforme. No alto de cada placa, verifica-se que o cloro (como no hipoclorito de sódio) foi efetivo contra to- das as bactérias-teste, mas foi mais efetivo contra as bactérias gram-positivas. Na fileira inferior de cada placa, os testes mostraram que o composto de amônio quaternário (“quat”) também foi mais efetivo contra as bactérias gram-positivas, mas não afetou as pseudomonas. No lado esquerdo de cada placa, o hexaclorofeno foi efetivo somente contra as bactérias gram- -positivas. No lado direito, o O-fenilfenol foi ineficaz contra pseudomonas, mas foi quase igualmente eficaz contra as bactérias gram-positivas e as gram-negativas. Todas as quatro substâncias químicas funcionaram contra as bactérias-teste gram-positivas, mas somente uma das quatro afetou as pseudomonas.
P Qual grupo de bactérias é o mais resistente aos desinfetantes testados?
OH OH
(a) Fenol (b) O-fenilfenol
Cl Cl
Cl OH
C
Cl Cl
HO Cl (c) Hexaclorofeno (um bifenol)
Cl Cl (d) Triclosano (um bifenol)
Cl OH
H O
H
Figura 7.7 A estrutura dos fenólicos e dos bifenóis.
P Alguns produtos com o objetivo de aliviar os sintomas de uma dor de garganta contêm fenol. Por que esta substância foi incluída?
Microbiologia 197
térias gram-positivas. As biguanidas também são efetivas contra bactérias gram-negativas, com exceção da maioria das pseudomo- nas. Elas não apresentam atividade esporocida, mas possuem algu- ma ação contra vírus envelopados. A biguanida mais conhecida é a clorexidina, frequentemente usada no controle microbiano da pele e das membranas mucosas. Combinada a um detergente ou álcool, a clorexidina também é usada para a escovação cirúrgica das mãos e no preparo pré-operatório da pele de pacientes. A alexidina é uma biguanida similar à clorexidina, apresentando, porém, ação mais rápida.
Halogênios
Os halogênios, particularmente o iodo e o cloro, são agentes anti- microbianos eficazes, tanto isoladamente quanto como constituin- tes de compostos inorgânicos ou orgânicos. O iodo (I 2 ) é um dos antissépticos mais antigos e mais eficazes, sendo eficiente contra todos os tipos de bactérias, muitos endosporos, vários fungos e al- guns vírus. O iodo impede a síntese de algumas proteínas e causa alterações nas membranas celulares microbianas, aparentemente pela formação de complexos com aminoácidos e ácidos graxos in- saturados. O iodo está disponível como uma tintura – isto é, em solução em álcool aquoso – e como um iodóforo. Um iodóforo é uma com- binação de iodo e uma molécula orgânica, da qual o iodo é lenta- mente liberado. Os iodóforos possuem a atividade antimicrobiana do iodo, mas não mancham e são menos irritantes. O preparado comercial mais comun é o Betadine, que é uma povidona-iodo. A povidona é um iodóforo com atividade de superfície que melhora a ação de umedecer e funciona como um reservatório de iodo livre. O iodo é usado principalmente na desinfecção da pele e no trata- mento de feridas. Muitos campistas estão familiarizados com seu uso para o tratamento da água. O cloro (Cl 2 ), como gás ou em combinação com outras subs- tâncias químicas, é outro desinfetante amplamente usado. Sua ação germicida é causada pelo ácido hipocloroso (HOCl) que se forma quando o cloro é adicionado à água:
(1)
Cloro Água Íon hidrogênio
Íon hipoclorito
Íon hidrogênio
Íon cloreto
Ácido hipocloroso
Ácido hipocloroso
HOCl H +^ + OCl -
Cl 2 + H 2 O H +^ + Cl -^ + HOCl
O ácido hipocloroso é um forte agente oxidante que impede o fun- cionamento de boa parte do sistema enzimático celular. Esse ácido é a forma mais eficaz de cloro, pois tem carga elétrica neutra e se difunde tão rapidamente quanto a água através da parede celular. Devido à sua carga negativa, o íon hipoclorito (OCl – ) não pode pe- netrar livre mente na célula. Uma forma líquida de gás cloro comprimido é bastante usada para desinfetar a água potável municipal, a água das piscinas e o esgoto. Vários compostos de cloro também são desinfetantes efi- cazes. Por exemplo, as soluções de hipoclorito de cálcio [Ca(OCl) 2 ] são usadas para desinfetar equipamentos de fábricas de laticínios e utensílios de restaurantes. Esse composto, que um dia foi chama-
do de cloreto de cálcio, já era usado em 1825, muito tempo antes do conceito de uma teoria dos germes e das doenças, para deixar ataduras de molho em hospitais de Paris. Também era o desin- fetante usado na década de 1840 por Semmelweis para controlar as infecções hospitalares durante o parto, como mencionado no Capítulo 1, página 11. Outro composto de cloro, o hipoclorito de sódio (NaOCl; veja a Figura 7.6) é usado como desinfetante do- méstico e alvejante (Clorox), como desinfetante em fábricas de laticínios e alimentos, e em sistemas de hemodiálise. Quando a qualidade da água potável é duvidosa, o alvejante doméstico pode fornecer um equivalente aproximado da cloração municipal. Após duas gotas de alvejante serem adicionadas a um litro de água (qua- tro gotas se a água estiver turva) e a mistura ser armazenada por 30 minutos, a água é considerada segura para beber em condições de emergência. A indústria de alimentos utiliza soluções de dióxido de cloro como desinfetantes de superfície, pois não deixam odores e sabo- res residuais. Como desinfetante, o dióxido de cloro possui um amplo espectro de atividade contra bactérias e vírus, sendo tam- bém efetivo, quando empregado em altas concentrações, contra cistos e endosporos. Em baixas concentrações, ele pode ser usado como antisséptico (veja também a página 201 para o uso do dióxi- do de cloro como desinfetante e esterilizante). Outro grupo importante de compostos de cloro são as clora- minas, combinações de cloro e amônia. A maioria dos sistemas municipais de tratamento de água mistura amônia com cloro para formar cloraminas. (As cloraminas são tóxicas aos peixes de aquário, mas a maioria das lojas de animais comercializa subs- tâncias químicas para neutralizá-las.) As forças militares norte- -americanas em batalha recebem pastilhas (Chlor-Floc) que con- têm dicloroisocianurato de sódio, uma forma de cloro combinada a um agente que flocula (coagula) os materiais suspensos em uma amostra de água, fazendo-os precipitar e limpando a água. Clo- raminas também são utilizadas para sanitizar louças e utensílios de restaurantes, e para tratar equipamentos de indústrias de la- ticínios e de alimentos. Elas são compostos relativamente está- veis, que liberam cloro durante períodos prolongados. Também são relativamente eficazes em presença de matéria orgânica, mas possuem a desvantagem de agir mais lentamente e de ser menos eficazes que o hipoclorito.
Alcoóis Alcoóis matam efetivamente as bactérias e os fungos, mas não os endosporos e os vírus não envelopados. O mecanismo de ação do álcool normalmente é a desnaturação de proteínas, mas ele também pode romper membranas e dissolver muitos lipídeos, incluindo o componente lipídico dos vírus envelopados. Os al- coóis têm a vantagem de agir e então evaporar rapidamente, sem deixar resíduo. Quando a pele é limpa (degerminada) antes de uma injeção, a atividade de controle microbiano provém do fato de simplesmente remover a poeira e os micro-organismos, junto com os óleos cutâneos. Contudo, os alcoóis não são antissépticos satisfatórios quando aplicados em feridas. Eles causam a coagu- lação de uma camada de proteína, sob a qual as bactérias conti- nuam a crescer. Dois dos alcoóis mais comumente usados são o etanol e o iso- propanol. A concentração ótima recomendada de etanol é 70%,
Microbiologia 199
bastante duradoura e permanecendo no local onde foi aplicada por no mínimo 13 dias. Quando uma bactéria entra em contato com a superfície, a membrana externa da célula é reconhecida, e uma quantidade letal de íons prata é liberada. Os compostos de mercúrio inorgânico, como o cloreto de mer- cúrio, têm uma longa história de uso como desinfetantes. Eles pos- suem um espectro muito amplo de atividade; seu efeito é principal- mente bacteriostático. Contudo, seu uso agora é limitado devido à sua toxicidade, poder de corrosão e ineficácia em presença de matéria orgânica. Atualmente, o principal uso dos mercuriais é no controle do mofo em tintas. O cobre em forma de sulfato de cobre, ou outros aditivos que contenham cobre, é usado principalmente para destruir as algas verdes (algicida) que crescem em reservatórios, tanques, piscinas e aquários. Se a água não contém matéria orgânica excessiva, os compostos de cobre são efetivos em concentrações de uma parte por milhão de água. Para prevenir o mofo, compostos de cobre como a 8-hidroxiquinolina de cobre algumas vezes são incluídos na tinta. Outro metal usado como antimicrobiano é o zinco. O efeito de quantidades traço de zinco pode ser visto nos telhados de pré- dios construídos com telhas galvanizadas (revestidas com zinco). O telhado adquire cor mais clara onde o crescimento biológico, na maioria das vezes algas, é impedido. Telhas tratadas com cobre e zinco já estão sendo comercializadas. O cloreto de zinco é um in grediente comum em soluções para bochecho, e o piritionato de zinco é um componente presente em formulações de xampus anticaspa.
Agentes de superfície
Os agentes de superfície ( tensoativos ou surfactantes ) podem re- duzir a tensão superficial entre as moléculas de um líquido. Esses agentes incluem os sabões e os detergentes.
Sabões e detergentes. O sabão tem pouco valor como antissép- tico, mas tem uma função importante na remoção mecânica dos micro-organismos pela esfregação. A pele normalmente contém cé- lulas mortas, pó, suor seco, micro-organismos e secreções oleosas das glândulas sebáceas. O sabão rompe o filme oleoso em gotículas pequenas, um processo denominado emulsificação, e água e sabão juntos removem o óleo emulsificado e os resíduos e os fazem flutu- ar para longe à medida que a pele é lavada. Nesse sentido, os sabões são bons agentes degerminantes.
Sanitizantes ácido-aniônicos. Os desinfetantes de superfície ácido-aniônicos são muito importantes na limpeza de utensílios e equipamentos para laticínios. Sua capacidade de limpeza está relacionada à porção carregada (ânion) da molécula, que reage com a membrana plasmática. Eles atuam sobre um amplo espec- tro de micro-organismos, incluindo as problemáticas bactérias termodúricas, são atóxicos, não corrosivos e possuem rápida ação.
Compostos quaternários de amônio (quats). Os agentes de su- perfície mais amplamente usados são os detergentes catiônicos, em especial os compostos quaternários de amônio ( quats ). Sua capa- cidade de limpeza está relacionada à parte positivamente carregada
- o cátion – da molécula. Seu nome é derivado do fato de que eles são modificações do íon amônio de quatro valências, NH 4 +^ (Figura 7.9). Os compostos quaternários de amônio são bactericidas fortes contra as bacté rias gram-positivas e um pouco menos ativos contra as gram-negativas (veja a Figura 7.6). Os quats também são fungicidas, amebicidas e viricidas con- tra vírus envelopados. Eles não matam os endosporos ou as mi- cobactérias. (Veja o quadro na página 201.) Seu modo de ação química é desconhecido, mas eles provavelmente afetam a mem- brana plasmática. Eles alteram a permeabilidade celular e cau- sam a perda de constituintes citoplasmáticos essenciais, como o potássio. Dois quats populares são o Zephiran, o nome comercial do cloreto de benzalcônio (veja a Figura 7.9), e o Cepacol, o nome co- mercial do cloreto de cetilpiridínio. Eles são antimicrobianos fortes, incolores, inodoros, insípidos, estáveis, facilmente solúveis e atóxi- cos, exceto em altas concentrações. Se o seu frasco de líquido para higiene oral se enche de espuma quando sacudido, o produto pro- vavelmente contém um quat em sua composição. Contudo, a ma- téria orgânica interfere com sua atividade, e eles são neutralizados pelos sabões e detergentes aniônicos. Qualquer pessoa interessada nas aplicações médicas dos quats deve se lembrar de que certas bactérias, como algumas espécies de Pseudomonas, não somente sobrevivem nos compostos qua- ternários de amônio, como também crescem ativamente neles. Es- ses micro-organismos são resistentes às soluções desinfetantes e às gazes e bandagens embebidas nestas soluções, uma vez que as fibras tendem a neutralizar os quats. Antes de abordarmos o próximo grupo de agentes químicos, consulte a Figura 7.10, que compara a efetividade de al guns dos an- tissépticos discutidos.
Conservantes químicos de alimentos Os conservantes químicos frequentemente são adicionados aos ali- mentos para retardar sua deterioração. O dióxido de enxofre (SO 2 ) tem sido usado como desinfetante há bastante tempo, especialmente na fabricação de vinho. Homero mencionou o seu uso em A odisseia, escrito cerca de 2800 anos atrás. Entre os aditivos mais comuns estão o benzoato de sódio, o ácido sórbico e o propionato de cálcio. Essas substâncias químicas são ácidos orgânicos simples ou sais de ácidos orgânicos, que o corpo metaboliza prontamente e que em geral são considerados seguros em alimentos. O ácido sórbico, ou seu sal mais solúvel, o sorbato de potássio, e o benzoato de sódio impedem os bo-
H N+^ H H
H N+ C 18 H 37
CH (^3)
CH (^3)
Cl–
Íon amônio Cloreto de benzalcônio
C H
H
Figura 7.9 O íon amônio e um composto quaternário de amônio, o cloreto de benzalcônio (Zephiran). Observe como outros grupos substi- tuem os hidrogênios do íon amônio. P Os quats são mais eficazes contra bactérias gram-positivas ou gram- -negativas?
200 Tortora, Funke & Case
lores de crescerem em certos alimentos ácidos, como o queijo e os refrigerantes. Tais alimentos, geralmente com um pH de 5,5 ou me- nos, são mais suscetíveis à deterioração pelo mofo. O propionato de cálcio, um fungistático efetivo usado em pães, previne o crescimen- to de bolores em superfícies e da bactéria Bacillus, que deteriora o pão. Esses ácidos orgânicos inibem o crescimento de bolores, não por afetar o pH, mas por interferir no metabolismo do bolor ou na integridade de sua membrana plasmática. O nitrato de sódio e o nitrito de sódio são adicionados a muitos produtos derivados de carne, como o presunto, o bacon, as salsichas e as linguiças. O ingrediente ativo é o nitrito de sódio, que certas bactérias na carne também podem produzir a partir do nitrato de sódio. Essas bactérias usam o nitrato como um substituto do oxigê- nio em condições anaeróbicas. O nitrito tem duas funções princi- pais: preservar a agradável cor vermelha da carne ao reagir com os componentes do sangue e prevenir a germinação e o crescimento de quaisquer endosporos botulínicos que possam estar presentes. O nitrito inibe seletivamente algumas enzimas de Clostridium botu- linum. Tem havido alguma preocupação, pois a reação dos nitritos com os aminoácidos pode formar certos produtos carcinogênicos conhecidos como nitrosaminas , e a quantidade de nitritos adicio- nados aos alimentos, de modo geral, foi reduzida recentemente por esta razão. Contudo, o uso de nitritos continua devido ao seu valor comprovado na prevenção do botulismo. Como as nitrosaminas são formadas no corpo a partir de outras fontes, o risco adicional apresentado por um uso limitado de nitratos e nitritos na carne é inferior ao que se pensava anteriormente.
Antibióticos Os antimicrobianos discutidos neste capítulo não são úteis para in- gestão ou injeção no tratamento de doenças. Antibióticos são usa- dos para este objetivo. O uso de antibióticos é altamente restrito; contudo, no mínimo dois têm utilização considerável na conser- vação dos alimentos. Nenhum deles tem valor para fins clínicos. A nisina (veja a página 578), frequentemente adicionada ao queijo para inibir o crescimento de certas bactérias formadoras de en- dosporos que causam deterioração, é um exemplo de bacteriocina, uma proteína que é produzida por uma bactéria e que inibe outra (veja o Capítulo 8, página 239). A nisina está naturalmente presente em pequenas quantidades em muitos laticínios. Ela é insípida, facil- mente digeri da e atóxica. A natamicina (pimaricina) é um antibió- tico antifúngico aprovado para uso em alimentos, principalmente para os queijos.
Aldeídos Os aldeídos estão entre os antimicrobianos mais efetivos. Dois exemplos são o formaldeído e o glutaraldeído. Eles inativam pro- teínas formando ligações cruzadas covalentes com vários grupos funcionais orgânicos nas proteínas (—NH (^2) , —OH, —COOH e —SH). O gás de formaldeído é um excelente desinfetante. Contudo, sua forma mais comumente disponível é a formalina, uma solução aquosa a 37% de gás de formaldeído. A formalina antigamente era bastante usada para conservar amostras biológicas e tornar inativas as bactérias e os vírus nas vacinas. O glutaraldeído é um produto químico menos irritante e mais efetivo que o formaldeído. O glutaraldeído é usado para desinfetar instrumentos hospitalares, incluindo endoscópios e equipamen- tos de terapia respiratória, mas eles precisam ser primeiramente limpos de forma cuidadosa. Quando usado em uma solução a 2% (Cidex), é bactericida, tuberculocida e viricida em 10 minutos e esporocida em 3 a 10 horas. O glutaraldeído é um dos poucos de- sinfetantes químicos líquidos que pode ser considerado um agente esterilizante. Contudo, 30 minutos frequentemente são considera- dos o tempo máximo permitido para a atuação de um esporocida, que é um critério que o glutaraldeído não pode atender. Tanto o glutaraldeído quanto a formalina são usados por agentes funerá- rios para embalsamar. Um possível substituto para muitos usos do glutaraldeído é o orto-fitalaldeído (OFA), que é mais efetivo contra a maioria dos micro-organismos, sendo pouco irritante.
Esterilização química A esterilização com o uso de agentes químicos líquidos é possível, mas mesmo substâncias químicas esporocidas como o glutaraldeí- do normalmente não são consideradas esterilizantes na prática. En- tretanto, os quimioesterilizantes gasosos frequentemente são utili- zados como substituintes de processos físicos de esterilização. Sua aplicação requer a utilização de uma câmara fechada similar a uma autoclave. Provavelmente, o exemplo mais comum seja o óxido de etileno:
O
H 2 C CH 2
60
40
20
10
100
80
20 40 60 80 100 120 Tempo (seg)
Porcentagem de bactérias sobreviventes
Solução aquosa de cloreto de benzalcônio 1:1.000^ Água e sabão
1% de iodo em 70% de etanol (tintura de iodo)Tintura de cloreto de benzalcônio
0
Figura 7.10 Uma comparação da efetividade de vários antissépti- cos. Quanto maior a inclinação para baixo da curva de morte do antisséptico, mais eficaz ele é. Uma solução de 1% de iodo em 70% de etanol é a mais eficaz; a água e o sabão são os menos efi cazes. Observe que uma tintura de cloreto de benzalcônio é mais efi caz que uma solução aquosa do mesmo antis- séptico.
P Por que a tintura de cloreto de benzalcônio é mais eficaz que a solução aquosa?
202 Tortora, Funke & Case
a maioria dos organismos vegetativos que causam deterioração e que se desenvolvem em alimentos. Mesmo a inativação dos endos- poros requer apenas uma temperatura de cerca de 45ºC. Utilizado há vários anos no tratamento de alimentos, o dióxido de carbono supercrítico tem sido usado recentemente para descontaminar im- plantes, como ossos, tendões ou ligamentos retirados de pacientes doadores.
Peroxigênios e outras formas de oxigênio
Os peroxigênios são um grupo de agentes oxidantes que inclui pe- róxido de hidrogênio e ácido peracético. O peróxido de hidrogênio é um antisséptico encontrado em muitos armários de remédio domésticos e em salas de suprimentos hospitalares. Ele não é um bom antisséptico para feridas abertas, sendo rapidamente degradado em água e oxigênio gasoso pela ação da enzima catalase, que está presente nas células humanas (veja o Capítulo 6, página 162). Contudo, o peróxido de hidrogênio desin- feta efetivamente objetos inanimados, e chega a apresentar efeito esporocida nestas aplicações, especialmente em concentrações ele- vadas. Em uma superfície inerte, as enzimas normalmente prote- toras das bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas são suplan- tadas pelas altas concentrações de peróxido usadas. Devido a esses fatores, e à sua rápida degradação em água e oxigênio, a indústria de alimentos está aumentando a utilização de peróxido de hidrogê- nio no empacotamento asséptico (veja a Figura 28.4). Os materiais de empacotamento passam por uma solução quente do produto antes de serem transformados em uma embalagem. Além disso, muitos usuários de lentes de contato estão familiarizados com a de- sinfecção por peróxido de hidrogênio. Após a desinfecção, um cata- lisador de platina no kit de desinfecção da lente destrói o peróxido de hidrogênio residual, para que ele não permaneça na lente, onde poderia causar irritação ocular. Peróxido de hidrogênio aquecido pode ser usado como um esterilizante gasoso. Ele não é tão penetrante quanto o óxido de etileno e não pode ser usado para esterilizar produtos têxteis ou líquidos. O ácido peracético (PAA, ácido peroxiático) é um dos mais efetivos esporocidas químicos líquidos disponíveis e pode ser usado como esterilizante. Seu modo de ação é similar ao do pe- róxido de hidrogênio. Geralmente é efetivo em endosporos e vírus em 30 minutos e mata as bactérias na forma vegetativa e os fungos em menos de cinco minutos. O ácido peracético tem muitas aplicações na desinfecção de equipamentos médicos e de processamento de alimentos, especialmente endoscópios, pois não deixa resíduos tóxicos (apenas água e pequenas quantida- des de ácido acético) e é minimamente afetado pela presença de matéria orgânica. A FDA aprovou o uso do PAA para lavagem de frutas e vegetais. Outros agentes oxidantes incluem o peróxido de benzoíla, provavelmente mais conhecido como o principal componente dos medicamentos de venda livre (over-the-counter – OTC) para acne. O ozônio (O 3 ) é uma forma altamente reativa do oxigênio, gerada pela passagem de oxigênio por descargas elétricas de alta volta- gem (veja a Figura 27.16, página 783). Ele é responsável pelo odor fresco do ar após um relâmpago, próximo a faíscas elétricas ou à
luz ultravioleta. O ozônio frequentemente é usado para comple- mentar a cloração na desinfecção da água, pois ajuda a neutrali- zar sabores e odores. Embora o ozônio seja um agente bacterici- da mais efetivo que o cloro, sua atividade residual dificilmente é mantida em água. TESTE SEU CONHECIMENTO
3 Por que a escolha do desinfetante seria importante se você desejasse desinfetar uma superfície contaminada por vômito e uma superfície contaminada por perdigotos? 7- 3 O que é mais viável de ser usado em um laboratório clínico, um teste de uso-diluição ou um teste de difusão em disco? 7- 3 Por que o álcool é efetivo contra alguns vírus e não contra outros? 7- 3 A betadina é um antisséptico ou um desinfetante quando utilizada na pele? 7- 3 Quais características tornam os agentes de superfície interessantes para a indústria de laticínios? 7- 3 Quais desinfetantes químicos podem ser considerados esporocidas? 7- 3 Quais substâncias químicas podem ser usadas para esterilização? 7-
Características e controle microbiano
OBJETIVO DO APRENDIZADO 7-14 Explicar como o controle do crescimento microbiano é afetado pelo tipo de micro-organismo. Muitos biocidas tendem a ser mais eficientes contra bactérias gram-positivas, enquanto grupo, do que contra bactérias gram- -negativas. Esse princípio é ilustrado na Figura 7.11, que apresen- ta uma hierarquia simplificada da resistência relativa dos prin- cipais grupos de biocidas microbianos. Um fator fundamental nessa resistência relativa a biocidas é a camada externa de lipo- polissacarídeos das bactérias gram-negativas. Entre as bactérias gram-negativas, membros do gênero Pseudomonas e Burkholde- ria são de especial interesse. Essas bactérias estritamente relacio- nadas são muito resistentes aos biocidas (veja a Figura 7.6) e são capazes de crescer ativamente em alguns desinfetantes e antissép- ticos, mais especificamente em compostos quaternários de amô- nio. No Capítulo 20, você verá que essas bactérias também são resistentes a muitos antibióticos. Essa resistência a antimicrobia- nos químicos está relacionada principalmente às características de suas porinas (orifícios presentes na parede das bactérias gram- -negativas; veja a Figura 4.13c, página 86). As porinas selecionam as moléculas que penetram na célula. As micobactérias são outro grupo de bactérias não formado- ras de endosporos que exibem uma resistência maior que o normal aos biocidas químicos (veja o quadro na página 201). Esse grupo inclui o Mycobacterium tuberculosis, o patógeno que causa a tu- berculose. A parede celular desse organismo, e de outros membros desse gênero, possui um componente céreo e rico em lipídeos. As instruções nos rótulos de desinfetantes frequentemente especifi-
Microbiologia 203
cam se o produto é tuberculocida, indicando se é eficiente contra as micobactérias. Testes tuberculocidas especiais foram desenvol- vidos para avaliar a eficácia dos biocidas contra esse grupo bacte- riano. Os endosporos bacterianos são afetados por relativamente poucos biocidas. (A ação dos principais antimicrobianos químicos contra as micobactérias e os endosporos está resumida na Tabela 7.7.) Os cistos e oocistos dos protozoários também são relativa- mente resistentes à desinfecção química. Os vírus não são especialmente resistentes aos biocidas, com exceção dos vírus que possuem envelope lipídico. Os agentes an- timicrobianos que são lipossolúveis possuem maior probabilida- de de serem eficientes contra os vírus envelopados. O rótulo des- se tipo de agente indicará que ele é efetivo contra vírus lipofílicos. Os vírus não envelopados, que possuem apenas um revestimento proteico, são mais resistentes – uma quantidade menor de bioci- das é efetiva contra eles.
Um problema que ainda não foi completamente resolvido é a eliminação dos príons. Os príons são proteínas infecciosas que causam doenças neurológicas, as encefalopatias espongiformes, como a doença popularmente conhecida como “síndrome da vaca louca” (veja o Capítulo 22, página 631). Para destruir os prí- ons, as carcaças de animais infectados são incineradas. Um gran- de problema, no entanto, é a desinfecção de instrumentos cirúr- gicos expostos à contaminação por príons. O processo normal de autoclave é comprovadamente inadequado. A Organização Mundial da Saúde (OMS) e o Centro para Controle e Prevenção de Doenças (CDC) recomendam o uso combinado de uma so- lução de hidróxido de sódio e da autoclave a uma temperatura de 134°C. Contudo, estudos recentes mostraram que instrumen- tos cirúrgicos foram tratados com eficácia para a inativação dos príons, que são proteínas, pela adição de proteases à solução de lavagem. Em resumo, é importante lembrar que os métodos de con- trole microbianos, especialmente os biocidas, não apresentam eficácia uniforme contra todos os micro-organismos.
TESTE SEU CONHECIMENTO
3 Sabe-se que a presença ou a ausência de endosporos interfere no controle microbiano, mas por que as bactérias gram-negativas são mais resistentes aos biocidas que as bactérias gram-positivas? 7-
A Tabela 7.8 resume os agentes químicos usados para controlar o crescimento microbiano. Os compostos discutidos neste capítulo geralmente não são úteis no tratamento de doenças. Os antibióticos e os patógenos contra os quais eles são ativos serão discutidos no Capítulo 20.
Eficácia dos antimicrobianos químicos contra endosporos e micobactérias Tabela 7.
Agentes químicos Endosporos Micobactéria
Mercúrio Sem atividade Sem atividade Fenólicos Baixa Boa Bifenóis Sem atividade Sem atividade Compostos quaterná- rios de amônio
Sem atividade Sem atividade
Cloro e derivados Leve Leve Iodo Baixa Boa Alcoóis Baixa Boa Glutaraldeído Leve Boa Clorexidina Sem atividade Leve
Menos resistente
Mais resistente
Príons
Endosporos de bactérias
Micobactérias
Cistos de protozoários
Protozoários vegetativos
Bactérias gram-negativas
Fungos, incluindo a maioria das formas de esporos fúngicos
Vírus não envelopados
Bactérias gram-positivas
Vírus envelopados
Figura 7.11 Ordem decrescente de resistência de micro-organis- mos a biocidas químicos.
P Por que os vírus com envelopes lipídicos são relativamente suscetíveis a certos biocidas?
