CENTRO UNIVERSITÁRIO SÃO CAMILO
Curso de Farmácia
ANÁLISE DE AUSÊNCIA DE MICRORGANISMOS EM AMOSTRAS
DE SORO FISIOLÓGICO ATRAVÉS DOS TESTES DE ESTERILIDADE
COM INOCULAÇÃO DIRETA E INDIRETA
SÃO PAULO – SP
2012
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Análise de Ausência de Microrganismos em Amostras de Soro Fisiológico Através dos Testes,, Trabalhos de Farmácia
- Título do Trabalho: "Análise de Ausência de Microrganismos em Amostras de Soro Fisiológico Através dos Testes, Trabalhos de Farmácia"; - Objetivo do trabalho: Analisar ausência total de microrganismos em amostras de soro fisiológico, empregando-se os métodos de teste de esterilidade com inoculação direta e inoculação indireta; - Disciplina: Controle de Qualidade Microbiológico de Medicamentos e Correlatos; - Professora: Márcia Marin; - Ano: 2012; - Autor: Pawel
Tipologia: Trabalhos
2012
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CENTRO UNIVERSITÁRIO SÃO CAMILO
Curso de Farmácia
ANÁLISE DE AUSÊNCIA DE MICRORGANISMOS EM AMOSTRAS
DE SORO FISIOLÓGICO ATRAVÉS DOS TESTES DE ESTERILIDADE
COM INOCULAÇÃO DIRETA E INDIRETA
SÃO PAULO – SP
ANÁLISE DE AUSÊNCIA DE MICRORGANISMOS EM AMOSTRAS DE SORO FISIOLÓGICO ATRAVÉS DOS TESTES DE ESTERILIDADE COM INOCULAÇÃO DIRETA E INDIRETA Análise de ausência de microrganismos em amostras de soro fisiológico através dos testes de esterilidade com inoculação direta e indireta apresentado ao curso de Farmácia do Centro Universitário São Camilo. Sob orientação da Profª. Márcia Marin. SÃO PAULO - SP 2012
1. INTRODUÇÃO
Em um medicamento podem estar presentes diversos tipos de contaminantes, principalmente os microrganismos devido à sua característica de ubiquidade. Estão naturalmente presentes no ar, na água, nos materiais, nas pessoas, nos equipamentos e nos reagentes podendo, portanto, contaminar um produto em diversos pontos da linha de produção (AGALLOCO, 2007). Define-se esterilização sendo a completa destruição de todos os microrganismos viáveis (capazes de se multiplicar) podendo ser realizada com a utilização de esterilizantes físico, a vapor de gás, ou químicos e por temperatura. Entre os microrganismos incluem as formas mais resistentes, como os esporos bacterianos, os vírus não envelopados e os fungos e as bactérias (MURRAY,2006). O teste de esterilidade foi usado primeiramente em líquidos estéreis em 1936 e relacionado na 11º edição da United StatesPharmacopeia (USP). De acordo com as orientações da ANVISA e da Farmacopeia Brasileira, a esterilidade do produto só pode ser comprovada analiticamente através do teste de esterilidade. Esterilidade é ausência de microorganismo viáveis e é um requisito a serem atendidos quando se trata de medicamentos injetáveis e/ ou estéreis (F. PORTUGUESA, 2007). Os medicamentos estéreis são produzidos em processos mais controlados a fim de garantir a esterilidade dos produtos até o momento da sua utilização (PARENTERAL, 1998). Os testes de esterilidade pelo método indireto são realizados por filtração em membrana utilizados para preparações aquosas, alcoólicas e oleosas filtráveis e preparações miscíveis ou solúveis outros solventes com ou sem atividade antimicrobiana. Pode ser executado pelo sistema aberto ou fechado. (PINTO, 2010) Os testes de esterilidade pelo método indireto consistem em uma inoculação direta (para preparações que não podem ser filtradas: suspensões, gazes, luvas e outros) no meio de cultura. A incubação é feita em tubos de ensaio (PINTO, 2010). Os meios de cultura de caseína-soja e tioglicolato são usualmente recomendados para testes de esterilidade de produtos biológicos. A caseína-soja é utilizada para a
detecção de bactérias aeróbicas, bolores e leveduras. Segundo pesquisas, este meio proporciona maior confiabilidade aos testes de esterilidade. No caldo de tioglicolato crescem praticamente todas as bactérias, exceto Haemophilus. Este meio leva agentes redutores (tioglicolato e L-cistina) que diminuem o coeficiente de óxido redução e favorecem o desenvolvimento de anaeróbios. A resazurina atua como indicador (apresenta cor rosa no estado oxidado). A pequena proporção de agar que contem o meio (0,75g/L) tem como finalidade limitar a absorção do oxigênio atmosférico.(MARTOS, 1994) O método de esterilização conhecido por filtração já foi realizada com diferentes tipos de filtros, incluindo asbesto, cerâmica e vidro prensado, mas atualmente, são mais utilizados os filtros de membrana de nitrocelulose.É utilizada para a esterilização de líquidos sensíveis ao calor, ou seja, termolábeis, incluindo soro,vitaminas e antibiótico, estes não podem ser esterilizados pelo calor sem sofrer graves alterações. No entanto muitos filtros considerados como “esterilizadores” apenas filtram bactéria, de forma que o material filtrado ainda pode conter microplasmas ou vírus. (SPICER, 2002) Os filtros são dispositivos com poros de dimensões muito pequenas, que impedem a passagem de microrganismos suficientemente grandes para permitir para permitir a passagem de líquidos ou gases. Em um processo de esterilização a variação no tamanho das partículas envolvidas é relativamente grande. Algumas das maiores células microbianas possuem diâmetro superior a 10 micrômetros, enquanto as menores da escala encontram-se com diâmetro inferior a 0,3 micrômetros (MANGIGAN,2010). Outros métodos de esterilização empregados são a irradiação (utiliza a luz ultravioleta, radiação ionizante ou acelerador linear para esterilização de artigos plásticos descartáveis sensíveis ao calor, inclusive seringas e cateteres), substancias química como, formaldeído na forma de gás (tratam-se substâncias tóxicas de uso restrito, porém eficientes para esterilização de materiais) e calor, podendo ser seco ou úmido. (SPICER, 2002) A desinfecção é a destruição ou remoção da maioria, mas não de todos os microrganismos viáveis. É dividida em desinfecção de alto nível, de nível intermediário ou de nível baixo. (SPICER, 2002)
3. METODOLOGIA
3.1 Montagem Do Sistema De Filtração Em Membrana Objetivo Montar o sistema de filtração em membrana. Fundamento Introduzir o aluno na montagem do sistema de filtração para avaliação da qualidade microbiológica de produtos estéreis pelo método de inoculação direta. Material 1 frasco com 500 mL de álcool 70 GL 1 caneta hidrográfica 4 folhas de papel impermeável 1 rolo de fita crepe 1perflex sem uso 1 caixa de filtro membrana de fibra de celulose, branca lisa, medindo 47 mm de diâmetro, com poros de 0,45 micras 1 caixa de filtro de membrana de fibra de celulose, branca, superfície quadriculada, medindo 47 mm de diâmetro, com poros de 0,45 micras Autoclave calor úmido 2 suportes para filtro membrana de 47 mm de diâmetro, em polissulfona, com capacidade aproximada de 250 mL, com frasco âmbar coletor contendo base para filtro membrana de 47 mm de diâmetro, rolha de borracha, anel de vedação, funil graduado conectável a base e tampa com vedantes de borracha 2 suportes de filtração tipo swinex de 13 mm
Método
- Foi procedida a lavagem dos materiais com água purificada.
- Colocaram-se as peças dobre o perflex e esperou-se secar.
- Foi montado o suporte de filtração tipo swinnex de 13 mm, com membrana de 13 mm.
- Na tampa do suporte tem 3 orifícios, sendo que 2 foram tampados com os vedantes de borracha e o terceiro com suporte de filtração tipo swinnex de 13 mm.
- Foi colocado o funil graduado na bancada com a parte de cima virada para baixo e colocou-se o anel de vedação no encaixe.
- Foi conectada a rolha de borracha na base para o filtro membrana e colocada a telinha suporte de modo que a parte lisa fique para cima.
- Foi colocada a membrana de fibra de celulose, branca lisa, medindo 47 mm de diâmetro, com poros de 0,45 micra e encaixar no funil graduado.
- Colocou-se a membrana e encaixar no suporte de filtração.
- Foi repetido todo o processo e foi montado o sistema com filtro membrana em nitrocelulose, branca, superfície quadriculada, medindo 47 mm de diâmetro, com poros de 0,45 micras.
- Foi embrulhado separadamente os frasco coletores e os suportes de filtração, em papel impermeável e prendeu-se com fita crepe e identificou-se o grupo e foi esterilizado em autoclave a 121 C 15 minutos. 3.2 Teste De Esterilidade Pelo Método Direto Objetivo Teste de Esterilidade pelo Método Direto Fundamento Consiste na transferência asséptica de quantidade do produto a ser examinado para o meio de tioglicolato fluído e meio caseína-soja fluído, seguida de incubação a 30-35 C e 20-25 C, respectivamente, durante 14 dias. Material :
- 2 ampolas de solução de cloreto de sódio 0,9% (solução fisiológica) 10 ML
- 2 frascos com 100 ML de álcool 70 GL
- 1 embalagem de gaze estéril, em compressa
- 1 seringa estéril descartável de 5 ml com agulha
3.3 Teste De Esterilidade Pelo Método Indireto Objetivo Teste de esterilidade pelo método indireto Fundamento Consiste em dissolver a substância em análise, em fluido estéril adequado e a passagem dessa solução através de membrana estéril, que irá reter qualquer contaminação em sua superfície, em seguida esta é lavada, seccionada e transferida, assepticamente para o meio de cultura adequado. Material
- 1bolsa plástica com 100 ml de solução injetável de cloreto de sódio 0,9% (solução fisiológica);
- 1frasco com 500 ml de álcool 70°GL;
- 1 embalagem de gaze estéril, em compressa;
- 1 frasco para reagente, de vidro borossilicato, com tampa azul ou tubo de ensaio com tampa ou tampão de algodão, contendo 90 ml de caldo de tioglicolato estéril;
- 1 caneta hidrográfica;
- 1 pinça pequena, embrulhada em papel impermeável, fechada com fita crepe, identificada com o nome do material e esterilizada em autoclave a 121°C por 15 minutos;
- 1 tesoura, embrulhada em papel impermeável, fechada com fita crepe, identificada com o nome do material e esterilizada em autoclave a 121°C por 15 minutos;
- 1 cuba pequena de metal ou plástico, embrulhada em papel impermeável, fechada com fita crepe, identificada com o nome do material e esterilizada em autoclave a 121°C por 15 minutos;
- 1 suporte para filtro membrana de 47 mm de diâmetro em polissulfona, com frasco coletor, contendo: base para filtro, montado com uma membrana de fibra de celulose branca, lisa e com poros de 0,45 micra, rolha de borracha, anel de vedação, funil graduado conectável à base, tampa com vedantes de borracha e suporte de filtração tipo swinex de 13 mm, montado com membra de fibra de celulose de 13 mm de diâmetro e poros de 0,2 micras, sendo todo o sistema,
exceto o coletor, embalado em papel impermeável e esterilizado em autoclave a 121°C por 15 minutos (observação: preparado pelos alunos);
- 1 bomba a vácuo;
- 100 ml de água peptonada 0,1% estéril. Método
- A capela de fluxo laminar foi ligada com a luz comum e a luz ultraviloleta. A luz ultravioleta ficou ligada por 5 minutos e após desligá-la os trabalhos foram iniciados sob fluxo laminar.
- A assepsia das paredes externas do produto a ser analisado foi feita com gaze estéril embebido em solução de álcool 70°GL e colocada na cuba, previamente esterilizada.
- Para a manipulação foi exigido o uso de luvas estéreis.
- Dentro da capela de fluxo laminar, cerca de 10 a 15 cm da parte frontal, foi montado assepticamente, o sistema de filtração esterilizado e acoplado à bomba a vácuo.
- Aberto o produto, o vácuo foi ligado e o conteúdo filtrado com o copo de filtração tampado.
- Após a filtração do produto, a tampa foi aberta parcialmente e 100 ml de água peptonada estéril a 0,1% foi filtrada para lavar a membrana.
- Desligado o vácuo, o filtro foi aberto e com a pinça esterilizada pegou-se a membrana com a mesma sendo cortada ao meio com tesoura esterilizada.
- Uma parte da membrana foi transferida para o frasco ou tubo contendo 90 ml de tioglicolato, a outra metade foi transferida para o frasco ou tubo contendo 90 ml de caseína-soja (TSB).
- Esses frascos ou tubos com caldo de tiogliconato foram identificados e incubados em estufa a temperatura de 30-35°C por 14 dias e o caldo de soja-caseína a 20- 25°C por 14 dias.
- A leitura dos tubos foi realizada, diariamente, e os resultados registrados.
- A turvação do meio indica contaminação do produto.
5. DISCUSSÃO
As técnicas empregadas podem resultar em amostras com resultado negativo ou positivo. No caso do resultado ser positivo é que houve o crescimento de microrganismos naquele meio, e no caso do resultado negativo é que não houve crescimento de microrganismos. Há duas possibilidades de realização do teste de esterilidade, uma por inoculação direta da amostra no meio de cultura e outra por inoculação indireta. Tanto no resultado das amostras pelo método indireto quanto nas amostras pelo método direto, não houve crescimento de microorganismos, portanto o resultado deu negativo, indicando que todas as amostras estavam estéreis, de acordo com o que é obrigatório. O resultado negativo a respeito da contaminação por microorganismos das amostras mostra que método de esterilização foi realizado com sucesso, e, portanto não houve um manuseio inadequado por parte do operador. O método empregado inoculação indireta apresenta vantagens em relação ao método empregado inoculação diretas. Tais vantagens não seriam apenas técnicas, mas também econômicas com a redução da quantidade de meios de cultura e de vidraria empregados. Os meios utilizados são usualmente empregados para os testes de esterilidade, e estes através de suas reações específicas de uma maneira eficiente, comprovaram a ausência de microrganismos.
6. CONCLUSÃO
Realizados os testes de esterilidade pode-se observar que o processo de esterilização, neste caso, foi realizado de maneira eficiente para a eliminação dos microrganismos viáveis, incluindo seus esporos, pois realizou a eliminação num todo, ou seja, não houve qualquer crescimento de microrganismos nos meios em nenhum dos métodos. Os testes de esterilidade são aplicáveis a insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos para a saúde que devem ser estéreis. Eles são importantes para assegurar a qualidade do processo esterilizante realizado durante a fabricação de medicamentos estéreis e manipulações assépticas. O teste de esterilidade quando realizado corretamente, constitui-se em uma ferramenta efetiva para segurança no consumo de produtos estéreis.