Identificação de Bactérias: Teste de Gram e Outros Testes de Coloração, Manuais, Projetos, Pesquisas de Microbiologia

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APOSTILA DE PRATICAS DE EXAMES LABORATORIAS

PARA BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS

MICROBIOLOGIA CLÍNICA

Introdução às Práticas de Exames

microbiológicos

EDITORES

Camila Corrêa Silva Davi Rodrigues de Araújo Bianca Rocha Vicktoria da Silva Furlani

Muriaé - MG, 2021

PRÁTICA 1- Procedimento de Identificação por coloração- Teste de Gram

1. INTRODUÇÃO

O diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas envolve duas abordagens

principais: uma consiste na abordagem bacteriológica , na qual o organismo é

identificado por meio de técnicas de coloração e cultivo, enquanto a outra consiste

na abordagem imunológica ( sorológica ), na qual o organismo é identificado pela

detecção de anticorpos contra o organismo no soro do paciente. [1]

Na abordagem bacteriológica de diagnóstico de doenças infecciosas, várias etapas

importantes antecedem o trabalho laboratorial propriamente dito, ou seja: (1)

escolha do espécime apropriado a ser examinado, o que requer um entendimento a

respeito da patogênese da infecção; (2) coleta do espécime de modo apropriado, a

fim de evitar a contaminação pela microbiota normal; (3) transporte do espécime

rapidamente ao laboratório, ou sua armazenagem correta; e (4) fornecimento de

informações essenciais para orientar os Profissionais do laboratório.[1]

Uma abordagem comumente utilizada consiste no teste sorológico, que determina a

presença de anticorpos específicos contra o organismo. Na maioria dos casos, um

aumento de quatro vezes no título de anticorpos entre as amostras de soro da fase

aguda e da fase de convalescência é considerado significativo. [1]

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês

Hans Christian Gram. Ela e um dos procedimentos de coloração mais uteis, pois

classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.

Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto à coloração de Gram,

pois diferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou a

liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada complexo

cristal violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas

possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeos e

aminoácidos) que as bactérias gram-negativas. Além disso, as bactérias gram-

negativas contêm uma camada de lipopolissacarídeo (lipídeos e polissacarídeos)

como parte de sua parede célula. [2]

OBJETIVO: Realizar os procedimentos do Teste de Gram ilustrando as etapas de

preparação e os tipos de corantes usados. Com base nos resultados apresentados

pela técnica de coloração de Gram iremos diferenciar as bactérias Gram positivas

das Gram Negativas. Essa será nossa primeira etapa de um processo longo que terá

como foco o diagnóstico das bactérias Gram positivas de importância médica

2. EQUIPAMENTOS E MATERIAS USADOS PARA TESTE COLORAÇÃO

DE GRAM

3. ETAPAS DE

REALIZAÇÃO DO TESTE DE GRAM

1. Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe agir por 1 minuto. 2. Lave com água corrente para retirar o excesso de corante. 3. Cubra o esfregaço com Lugol e deixe agir por 1 minuto. 4. Lave com água corrente. 5. Realize a descoloração da lâmina com álcool absoluto até que não escorra mais o cristal violeta (cuidado para não descorar demais, normalmente, 15 a 20 segundos são suficientes). 6. Lave com água corrente. 7. Cubra o esfregaço com fucsina e deixe agir por 40  Lâminas de vidro limpas e desengorduradas 7,  cm x 2,5 cm  Centrífuga e/ou citocentrífuga  Tubos estéreis • Lata para descartar o material contaminado  Alça bacteriológica • Incinerador ou bico de Bunsen  Meio de cultura • Óleo de imersão  Pipeta e ponteiras estéreis • Agitador tipo Vortex  Luvas (quando necessário) • Lâminas de bisturi  Cronômetro • Chapa com aquecimento brando para fixação dos  esfregaços (50ºC)  Salina estéril 0,85% • Microscópio  Metanol ou etanol absoluto para fixação

REFERÊNCIAS: 1-LEVINSON; Microbiologia Médica e Imunologia.10 Edição, Porto

Alegre, 2010. 2- TORTORA.; Microbiologia. 10 Edição, Porto Alegre. 2012.

PRÁTICA 2 – IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS e ESTREPTOCOCUS DE

IMPORTÂNCIA MÉDICA

1. INTRODUÇÃO:

Há dois gêneros de cocos gram-positivos de importância médica: Staphylococcus e Streptococcus. Dois dos mais importantes patógenos de humanos, Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes , são descritos neste capítulo. Os estafilococos e estreptococos são imóveis e não formam esporos.[1] Staphylococcus aureus causa abscessos, várias infecções piogênicas (p. ex., endocardite, artrite séptica e osteomielite), intoxicação alimentar, síndrome da pele escaldada e síndrome do choque tóxico. O organismo é uma das causas mais comuns de pneumonia hospitalar, septicemia, e infecções de feridas cirúrgicas. É uma importante causa de infecções cutâneas, como foliculite, celulite e impetigo. Staphylococcus epidermidis pode causar endocardite e infecções em articulações Prostéticas. Staphylococcus saprophyticus causa infecções do trato urinário. [1] Todos os estafilococos produzem catalase , ao contrário dos estreptococos (a catalase degrada H2O2 a O2 e H2O). A catalase é um importante fator de virulência, uma vez que o H2O2 é microbicida e sua degradação limita a capacidade de os neutrófilos promoveram a morte. [1] Três espécies de estafilococos são patógenos de humanos: S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus. Das três, S. aureus é a mais importante. S. aureus distingue-se das demais principalmente pela produção de coagulase. [1] A coagulase é uma enzima que provoca a coagulação do plasma por ativar a protrombina, originando trombina. A trombina, então, catalisa a ativação de fibrinogênio, originando o coágulo de fibrina. S. epidermidis e S. saprophyticus são frequentemente referidos como estafilococos [1]

OBJETIVO: Para analisamos as espécies de Estafilococus de interesse clinico precisamos

conhecer principalmente os meios de identificação mais utilizados nos laboratórios. Com base nisso abordaremos alguns testes bioquímicos de identificação da sua espécie

REFERENCIAS: 1-LEVINSON; Microbiologia Médica e Imunologia.10 Edição, Porto

2. PROCEDIMENTOS DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICOS

2.1 TESTE DA CATALASE

Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre esse esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas. Para a família Staphylococcaceae (estafilococos) a prova é geralmente positiva, enquanto que para a família Streptococcaceae (estreptococos) é negativa. Esse teste tem como objetivo a identificação e diferenciação dos Grupos Estafilococos e Estreptococos sendo que resultado positivo para Estafilococus e negativo Estreptococos.[1] Figura A: Teste de catalase. https://pt.linkedin.com/pulse/teste-de-catalase-marcos-fid%C3%A9lis Figura B: Provas bioquímicas para identificação de Staphylococcus spp. https://publica.ciar.ufg.br/ebooks/iptsp/bacteriologia_humana/artigo_1.html.

2.3 TESTE DE COAGULASE

Esse teste baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator plasmático formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio formando a fibrina. O teste é melhor efetuado se: Adicionar 0,1 mL de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 mL de plasma. Incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria. „ A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. Um método alternativo é a emulsificação dessa mesma colônia suspeita em um 0,5 plasma e incubado da mesma forma. Qualquer coágulo indica uma prova positiva, porém não confundir com precipitados ou floculação. O melhor plasma a ser usado é o de coelho com EDTA, não devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de sangue. Ideal para identificação de Staphylococcus aureus .[1] Figura D. Ilustração do teste de Coagulase. Cocos Gram-positivos Staphylococcus Streptococcus. Publicado por May Martin

3 REPRESENTAÇÃO DAS ESPÉCIES ESTAFILOCOCUS DE MAIOR

IMPORTÂNCIA CLINICA

Figura E: MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Módulo 6: Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. file:///C:/Users/Novo %20Usuario/Downloads/iras_moduloDeteccaoBacterias%20(1).pdf

4. TESTE DA DNAse

Teste da DNAse Esse teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, (DNAse test Ágar) obtido comercialmente. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%. O meio adquire uma coloração azul intensa. Incubar a 35°C por 24 horas. Uma coloração rósea característica ao redor das colônias produtoras de DNAse indica a positividade da prova. O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne à placa original onde nem sempre as colônias estão bem isoladas[1]

de Chapman. O indicador de pH é o vermelho de fenol, que indica uma reação positiva quando o meio ao redor das colônias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado[1] REFERÊNCIAS: 1- MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Módulo 6: Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. file:///C:/Users/Novo%20Usuario/Downloads/iras_moduloDeteccaoBacterias%20(1).pdf

PRÁTICA 3 – IDENTIFICAÇÃO DE ESTREPTOCOCUS ESPECIFICOS

1. INTRODUÇÃO:

Os estreptococos causam uma ampla variedade de infecções. S. pyogenes (um estreptococo do grupo A) é a principal causa bacteriana de faringite e celulite. É uma importante causa de impetigo, fasciite necrosante, e síndrome do choque tóxico estreptocóccico. Também é o fator incitador de duas importantes doenças imunológicas, a febre reumática e a glomerulonefrite aguda. Streptococcus agalactiae (estreptococo do grupo B) é a principal causa de sépsis e meningite neonatais. Enterococcus faecalis é uma importante causa de infecções nosocomiais do trato urinário e endocardite. Os estreptococos do grupo viridans são a causa mais comum de endocardite. Streptococcus bovis também causa endocardite. [1]

OBJETIVO: Nosso objetivo amplo e que analisaremos os principais meios de

identificação de estreptococos. Já o objetivo especifico é que daremos mais ênfase nos exames ou testes que identifiquem as duas espécies que consideramos as mais importantes na parte clínica: S. pyogenes, Streptococcus pneumoniae)

2. PROCEDIMENTO

Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparência na placa de ágar sangue após incubação a 35°C em presença de 5% de CO2 , podendo apresentar: hemólise total (beta), parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). A identificação de espécie de estreptococos beta hemolíticos é feita através de aglutinação com soros específicos contra os antígenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rápida, porém não acessível a todos os laboratórios em virtude do elevado custo. [2]

3. TESTE DA BACITRACINA

É importante notar que as identificações devem ser feitas em ágar sangue sem tensão de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes. Semear meia placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma. Colocar o disco de bacitracina 0,004 UI como indicado. Incubar por uma noite a 35ºC sem CO2. Observar qualquer zona de inibição como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) é assim rapidamente identificado.[2] Figura G prova de sensibilidade. https://www.slideshare.net/AntonioCarlosStradio/aula-streptococcus

4. TESTE DA OPTOQUINA

Semear um quarto de uma placa de ágar sangue com a cepa alfa hemolítica a ser testada. Aplicar um disco de optoquina.

amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mostra cocos em cadeias que não crescem no subcultivo em ágar sangue, então deve-se proceder dessa forma: – Semear o repique em ágar sangue. – Fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a identificação presuntiva de Haemophilus influenzae. – Incubar a 35°C em atmosfera com CO2 .[2] Figura I: MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Módulo 6: Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. file:///C:/Users/Novo %20Usuario/Downloads/iras_moduloDeteccaoBacterias%20(1).pdf

6. REFERENCIAS

1-LEVINSON; Microbiologia Médica e Imunologia.10 Edição, Porto. 2-MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Módulo 6: Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. file:///C:/Users/Novo%20Usuario/Downloads/iras_moduloDeteccaoBacterias%20(1).pdf

PRÁTICA 4 QUESTIONÁRIO

1. Descreva a importância técnica da coloração de Gram?
2. Com base nos dados da apostila, descreva os principais testes realizados para identificação da espécie Staphylococcus aureus?
3. Qual importância dos testes de Coagulase e Catalase para identificação da espécie de Staphylococcus aureus?
4. Com base na apostila descreva todos os testes abordados aqui, dando ênfase para procedimentos de realização do teste e sua utilização para identificar um tipo espécie de interesse clinico?