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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Programa de Pós-graduação em Odontologia
Faculdade de Odontologia
Juliana Silvério Flausino de Almeida
EFEITOS DE DIFERENTES MATERIAIS RESTAURADORES
NA FORMAÇÃO DE BIOFILME-
ANÁLISE DO ÂNGULO DE CONTATO, RUGOSIDADE DA
SUPERFÍCIE 3D E MICROSCOPIA CONFOCAL
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Uberlândia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de concentração em Clínica Odontológica Integrada.
Uberlândia
Juliana Silvério Flausino de Almeida
EFEITOS DE DIFERENTES MATERIAIS RESTAURADORES
NA FORMAÇÃO DE BIOFILME-
ANÁLISE DO ÂNGULO DE CONTATO, RUGOSIDADE DA
SUPERFÍCIE 3D E MICROSCOPIA CONFOCAL
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Uberlândia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de concentração em Clínica Odontológica Integrada.
Orientador : Prof. Dr. Denildo de Magalhães Co-orientador: Prof. Dr. Carlos José Soares Colaboradoras: Prof. Ms. Priscilla Barbosa Ferreria Soares Ac. Valessa Florindo Carvalho
BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Denildo de Magalhães Prof. Dr. Paulo Vinícius Soares Prof. Dra Camila Christian Gomes Moura
UBERLÂNDIA
DEDICATÓRIA
Dedico esta vitória aos meus pais, por tudo o que eles são e por todo o amor, carinho e compreensão que dedicaram a mim e aos meus irmãos.
A Deus, que iluminou meus caminhos e me fortaleceu nos momentos mais difíceis desta caminhada, me indicando os passos certos a serem dados nesta etapa de crescimento pessoal e profissional.
AGRADECIMENTOS
A elaboração deste trabalho não teria sido possível sem a colaboração, estímulo e empenho de diversas pessoas. Gostaria de expressar toda a minha gratidão e apreço a todos aqueles que contribuíram para que esta tarefa se tornasse uma realidade. Agradeço a minha família, que sempre esteve ao meu lado em todas as escolhas que fiz na vida. Aos meus pais João e Maria, que me ensinaram os valores da vida e fazem tudo para realizar cada sonho que tenho. Todas as minhas vitórias devo a eles. Dedico essa conquista aos meus irmãos Fabrício e Marcelo, que me incentivaram desde o primeiro dia de aula na graduação, a sempre buscar mais em todos os meus caminhos, e por isso cheguei até aqui. Ao meu esposo, Antônio José que não me deixou desistir nos momentos difíceis e que teve paciência e compreensão nos meus momentos de estudo. Ao Professor Doutor Carlos José Soares e Professora Mestre Priscilla Barbosa Ferreira Soares, para quem não há agradecimentos que eu possa expressar em palavras. Sempre ao meu lado, se dedicando com toda força e carinho. São excelentes professores, que sabem fazer e ensinar. Sabem compreender as ansiedades de seus alunos e responder as suas expectativas. Suas dedicações às pesquisas levam os alunos a sempre querer mais e ir muito mais além do que imaginam que podem ir. Foram professores que me ensinaram a pensar, que abriu horizontes e me deixou participar de seus ensinamentos, por onde consegui chegar ao sucesso. Ao Professor Doutor Denildo de Magalhães que me ensinou a transmitir conhecimentos aos alunos. Agradeço a sua disponibilidade, a sua forma crítica e criativa de arguir as ideias apresentadas, que facilitaram o alcance dos propósitos nesta dissertação. Agradeço aos Professores Dr. José Daniel Biasolli de Mello, Dra. Henara Lilian Costa, Dr. Washington Martins da Silva Junior e aos alunos José Lúcio e Sara do Laboratório de Tribologia dos Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica, pela disponibilidade de me ensinar a trabalhar nos equipamentos que utilizei na metodologia desta pesquisa. Fico grata a Mariani do Laboratório de Microscopia pelas inúmeras vezes que precisei utilizar seus conhecimentos e ao Professor Mário PauloAmanti Penatti pela contribuição na pesquisa com o biofilme. De uma maneira muito especial quero agradecer com todo carinho as alunas da graduação Valessa e Maiara que puderam compartilhar comigo todas as conquistas e as dificuldades encontradas no caminho. Agradeço o modo como elas compartilharam comigo e se disponibilizaram para desenvolvermos esse estudo. “Meninas desejo sucesso sempre para vocês”.
SUMÁRIO
LISTAS DE FIGURAS, QUADROS, TABELAS, ABREVIATURAS, SIGLAS E
SÍMBOLOS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Desenvolvimento de um biofilme: (a) Colonização primária de um substrato; (b) crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de múltiplas espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro.................................................................. Figura 2: Estágios de formação e vida de um biofilme, determinados por fatores físicos, biológicos e ambientais............................................................................................................. Figura 3: Representação gráfica dos defeitos de forma, ondulação e rugosidade................... Figura 4: Comprimento de corte utilizado para excluir erro de forma em medições 2D........ Figura 5: Diagrama da influência do raio de ponta sobre o perfil medido.............................. Figura 6 : Diferentes perfis com o mesmo Sa ......................................................................... Figura 7: Ionômero de vidro modificado por resina (Vitremer, 3M-Espe); Ionômero de vidro convencional (Ketac Fil Plus, 3M-Espe); Ionômero de vidro modificado por resina nanoparticulada (Ketac Nano, 3M-Espe); Resina composta nanoparticulada (Filtek Z350, 3M- Espe).......................................................................................................................................... Figura 8: Proporção do Ketac Nano........................................................................................ Figura 9: Ionômero de vidro modificado por resina – Vitremer............................................. Figura 10 : Proporção do material a ser espatulado – Vitremer............................................... Figura 11: Espatulação do material – Vitremer....................................................................... Figura 12: Inserção do material no interior da matriz de teflon. Tira de poliéster posicionada
- Vitremer................................................................................................................................ Figura 13: Posicionamento da matriz de poliéster sobre os orifícios – Vitremer................... Figura 14: Polimerização do material – Optilux 501, Demetron, USA.................................. Figura 15: Padronização do tamanho da amostra (4x2mm).................................................... Figura 16: Interferômetro a laser UBM (Taylor Hobson Ltd, Leicester, LE)......................... Figura 17: Crescimento do biofilme 24 horas após semeadura............................................... Figura 18 : Seleção de uma colônia isolada............................................................................. Figura 19: Caldo estéril de BHI.............................................................................................. Figura 20 : Diluição da suspensão bacteriológica em caldo de BHI não contaminado............
Figura 54: Biofilme formado sobre Ketac Nano..................................................................... Figura 55: Biofilme formado sobre Filtek Z350 XT............................................................... Figura 56: Gráfico da correlação entre os parâmetros da rugosidade de superfície (μm) e biovolume do biofilme (μm^3 /μm^2 ) entre os diferentes grupos.................................................. Figura 57 : Gráfico da correlação entre os parâmetros da rugosidade de superfície (μm) e espessura do biofilme (μm^3 /μm^2 ) entre os diferentes grupos....................................................
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Média ± desvio padrão (DP) e para o parâmetro rugosidade da superfície (mm) s, os parâmetros de amplitude (Sa e Sq), parâmetro espacial (Sds) e parâmetro híbrido (Sds).. 56
Quadro 2: Média ± desvio padrão (DP) para ângulo de contato (graus)..................................
Quadro 3: Média ± desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) para a espessura média (μm) e biovolume (μm^3 /μm^2 )....................................................................................................
RESUMO
O objetivo deste estudo foi o de avaliar o efeito dos parâmetros de topografia e hidrofobicidade de diferentes tipos de materiais restauradores utilizados para restaurar lesões cervicais não cariosas sobre a formação de biofilme. Quatro materiais restauradores foram investigados: cimento de ionômero de vidro convencional (KF, Ketac Fil Plus, 3M ESPE), ionômero de vidro modificado por resina (VT, Vitremer, 3M ESPE), ionômero de vidro nanoparticulado modificado por resina (KN, Ketac Nano, 3M ESPE) resina composta nanoparticulada (FZ, Filtek Z350 XT, 3M ESPE). Quinze amostras foram preparadas a partir de cada material, divididas em quatro grupos. Dez amostras foram utilizadas para a análise de parâmetros usando a perfilometria a laser 3D. Os parâmetros amplitude (Sa e Sq), parâmetro espacial (Sds) e parâmetro híbrido (Ssc) foram extraídos em área usando cut-off= 0,25 mm. A hidrofobicidade foi determinada pela medição do ângulo de contato usando água deionizada sobre a superfície (n=5 por material). Biofilme foi avaliado após 24 horas após cultura sobre as amostras, que depois foram coradas com fluoresceína sódica a 1% utilizando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para análise do biovolume e espessura. Os dados foram analisados utilizando-se ANOVA e teste de Tukey (α = 0,05). A correlação de Pearson foi utilizada para comparar os parâmetros topográficos com a formação de biofilme. Foram encontradas diferenças significativas entre os parâmetros de amplitude relacionados (Sa e Sq: FZ = KN˂ VT˂KF). KN apresentou a maior hidrofobicidade. FZ e KN apresentaram a menor espessura e biovolume de biofilme quando comparadas com VT e KF. Todos os parâmetros de topografia foram significativamente correlacionados com a formação de biofilme. FZ e KN, materiais com nano partículas apresentaram melhor desempenho nos parâmetros relacionados com topografia e formação de biofilme.
PALAVRAS-CHAVE: nanomaterial, biofilme, microscopia confocal, rugosidade da superfície, ângulo de contato
ABSTRACT
The purpose of this study was to evaluate the effect of the topography parameters and hydrophobicity of restorative material used to restore non-carious cervical lesions on the biofilm formation. Four restorative materials were investigated: conventional glass ionomer cement (KF, Ketac Fill Plus, 3M ESPE), resin-modified glass ionomer cement (VT, Vitremer, 3M ESPE), nanofilled resin-modified glass ionomer (KN, Ketac Nano, 3M ESPE) nanofilled resin composite (FZ, Filtek Z350 XT, 3M ESPE). Forty disk specimens were prepared from each material, dived in four groups. Five samples were used for topography parameters analysis using a 3D profilometry. The amplitude parameters (Sa and Sq), spatial parameter (Sds) and hybrid parameter (Ssc) were extracted in area using cut off of 0.25mm. Hydrophobicity was determined by the contact angle measurement of deionized water on the surface. Biofilm was evaluated after 24 hours formation with each disk after stained with 1% fluorescein using confocal laser-scanning microscopy (CLSM). Data were analyzed using one-way ANOVA and Tukey test (α=.05), Pearson correlation was used to compare topography parameters with biofilm formation. Significant differences were found related amplitude parameters (Sa and Sq, FZ=KN˂VT˂KF). KN presented the highest hydrophobicity. FZ and KN presented the lowest thickness and biovolume of biofilm when compared with VT and KF. All topography parameters were significantly correlated with biofilm formation. FZ and KN, material with nanoparticles presented better performance related topography parameters and biofilm formation.
KEYWORDS: nanomaterial, biofilm, confocal laser microscopy, surface roughness, contact angle
áreas auxiliam na proteção contra maior perda de estrutura dental, sensibilidade e manutenção na qualidade dos tecidos gengivais.
As hipóteses nulas lançadas para este estudo foram: não existem diferenças significativas nos parâmetros de topografia e hidrofobicidade entre os materiais restauradores testados; não houve efeito dos parâmetros de topografia e hidrofobicidade de diferentes materiais utilizados para restaurar LCNC sobre a formação de biofilme.
Contudo, há que se considerar a possibilidade de atuarem como um agente colaborador no desenvolvimento do biofilme resultando assim, em uma possível agressão ao periodonto.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LESÃO CERVICAL NÃO CARIOSA
A resseção gengival é caracterizada pela perda de estruturas do periodonto, e consequente exposição da superfície radicular, independente do padrão de higiene bucal do indivíduo. O fator, provavelmente predominante para a recessão localizada é a oclusão traumatogênica, principalmente em adultos (Bartlett et al., 2006). Associada à recessão gengival e, por conseguinte, à superfície radicular exposta, há a presença de LCNC. Em função de medidas de prevenção à cárie é notória a redução de sua incidência, porém nota-se crescimento contínuo na ocorrência de LCNC, ou seja, aquelas não ocasionadas por bactérias. Estas são classificadas em três categorias: corrosão, abrasão e abfração, caracterizadas pela perda de tecido dental duro na região próxima à junção cemento- esmalte (Terry et al., 2003; Soares et al., 2006; Lucchesi et al., 2007; Barbosa et al., 2009). A corrosão é determinada pela dissolução de substância, pela presença de um meio quimicamente ácido, seja essa de origem intrínseca ou extrínseca. A primeira é procedente por regurgitação de ácido gástrico, enquanto a segunda ocorre em função da dieta de baixo pH. Em contrapartida, a abrasão é caracterizada por um desgaste da estrutura dentária causada por forças mecânicas anormais, tais como: excessiva e imprópria escovação e hábitos parafuncionais orais, como roer unhas, bruxismo, morder a haste de um tubo, segurar pregos entre os dentes. Por fim, a abfração advém de alterações na distribuição da força sobre o dente, principalmente na região cervical, porém, pode se manifestar, também, como invaginações oclusais resultantes da excessiva carga excêntrica de hábitos parafuncionais (Soares et al., 2006; Lucchesi et al., 2007; Francisconi et al., 2009; Pikdoken et al., 2011). Historicamente, estas lesões eram classificadas de acordo com sua aparência: áreas em forma de cunha, em forma de disco, achatada e irregular. Geralmente, elas variam de sulcos rasos com amplas lesões em forma de cunha com defeitos afiados. Estudos clínicos e observações mostram que as lesões de desgaste cervical são muitas vezes situadas na superfície vestibular dos dentes, raramente nas regiões lingual e proximal. Elas também são mais pronunciadas em pré-molares e molares e mais prevalente na maxila que na mandíbula (Pikdoken et al, 2011).
2.1.2 CONSTITUIÇÃO E FORMAÇÃO DO BIOFILME DENTAL
Genericamente, biofilmes são definidos como comunidades microbianas sésseis aderidas a superfícies rígidas. Os microrganismos que compõem o biofilme formam uma comunidade extremamente organizada, sendo envolvidos por uma matriz extracelular, composta principalmente de polissacarídeos produzidos pelos próprios microrganismos, os quais interagem com componentes do fluído pelo qual são banhados. Constitui-se de depósitos bacterianos e constituintes salivares, com um crescimento contínuo, sendo considerado a principal causa das doenças cárie e periodontal, infecções periimplantares e estomatites (Rosan et al., 2000). Segundo Rickard et al., 2003 a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos os organismos denominados colonizadores primários, que se aderem a uma superfície, geralmente contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas passam a se desenvolver, originando micro colônias que sintetizam uma matriz exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderência de microrganismos denominados colonizadores secundários. Estes colonizadores secundários podem aderir diretamente aos primários, ou promoverem a formação de coagregados com outros microrganismos e então se aderirem aos primários, conforme ilustrado na Figura 1.
Figura 1. Desenvolvimento de um biofilme: (a) Colonização primária de um substrato; (b) crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de múltiplas espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro. (Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)
Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinâmica, pois, de acordo com os microrganismos que o compõem, teremos condições físicas, químicas e biológicas distintas. Estas alterações fazem com que cada biofilme seja único, de acordo com os microrganismos presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composição microbiana dos biofilmes geralmente sofre alterações significativas. A Figura 2 ilustra não somente a estruturação físico-química de um biofilme, mas também sua evolução e amadurecimento, dependendo das relações estabelecidas pelos microrganismos presentes (Rickard et al., 2003).
