Ciclo de Krebs, Notas de estudo de Nutrição

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VALTER T. MOTTA

BIOQUÍMICA BÁSICA

Ciclo do Ácido

Cítrico

Capítulo

7

Ciclo do Ácido Cítrico

Objetivos

1. Descrever a obtenção de acetil−CoA pela descarboxilação oxidativa do piruvato nas mitocôndrias.
2. Reconhecer que o ciclo do ácido cítrico é a via de oxidação do grupo acetila da acetil−CoA com formação de três NADH e de um FADH 2 além da formação de um ATP (ou GTP) por fosforilação ao nível do substrato.
3. Identificar a reação catalisada pela citrato−sintase como a primeira reação do ciclo do ácido cítrico e reconhecer as substâncias participantes.
4. Identificar as substâncias participantes das reações do ciclo do ácido cítrico catalisadas por: isocitrato−desidrogenase, complexo do α−cetoglutarato, succinil−CoA−sintetase (succinato−tiocinase), succinato desidrogenase e malato−desidrogenase.
5. Explicar a reação catalisada succinil−CoA−sintetase (succinato tiocinase) na formação de ATP ao nível do substrato.
6. Calcular o número de compostos de “alta energia” (ATP) sintetizados pela oxidação de um mol acetil−CoA no ciclo do ácido cítrico.
7. Descrever os mecanismos de regulação do ciclo do ácido cítrico.
8. Descrever a entrada e saída de intermediários do ciclo do ácido cítrico.

O ciclo do ácido cítrico (também chamado de ciclo de Krebs ou ciclo dos ácidos tricarboxílicos ) é o estágio final da oxidação dos combustíveis metabólicos. Os átomos de carbono entram no ciclo na forma de grupos acetila derivados dos carboidratos, ácidos graxos e aminoácidos. O grupo acetila ligado a coenzima A (acetil-CoA) é oxidado em oito reações mitocondriais para formar duas moléculas de CO 2 com a conservação da energia livre liberada em três moléculas de NADH, uma de FADH 2 e um composto de “alta energia” (GTP ou ATP). O NADH e o FADH 2 são oxidados e os elétrons são conduzidos pela cadeia mitocondrial transportadora de elétrons com a liberação de energia conservada na forma de ATP sintetizado a partir de ADP e P i por meio de processo denominado fosforilação oxidativa ( ver Capítulo 8). A reação líquida para o ciclo do ácido cítrico é:

7 Ciclo do ácido cítrico • 193

que fornece energia para a síntese de ATP.

7.1 Oxidação do piruvato a acetil − CoA e CO 2

Sob condições aeróbicas, o piruvato presente na matriz mitocondrial é convertido em CO 2 e um fragmento de dois carbonos, a acetil−CoA em reação de descarboxilação oxidativa. A reação é catalisada pelo complexo da piruvato − desidrogenase constituído por três enzimas distintas: a piruvato − desidrogenase (E1) , a diidrolipoil − transacetilase (E2) e a diidrolipoi − desidrogenase (E3) associadas de modo não-covalente e cinco diferentes coenzimas_._ O complexo está localizado exclusivamente na mitocôndria das células eucarióticas. Devido a grande energia livre padrão negativa dessa reação sob condições fisiológicas, o processo é irreversível o que impede a reação inversa de formação do piruvato a partir do

acetil−CoA.

A operação do complexo da piruvato desidrogenase requer cinco coenzimas cujos papéis funcionais são descritos a seguir.

1. Descarboxilação oxidativa do piruvato. A reação requer o co-fator pirofosfato de tiamina (TPP) ligado à enzima piruvato − desidrogenase (E1). O TPP ataca o carbono da carbonila do piruvato e libera o CO 2 deixando o grupo hidroxietil ligado ao TPP para formar o hidroxietil−TPP (HETTP). 2. Transferência do grupo hidroxietil do HETTP para a diidrolipoil − transacetilase (E2). O aceptor do hidroxietil é o

H O C CH 3

H + CO^2

N

O C C CH 3

C S

+

CH 3 N C S

+

CH 3

C

O O

+

C O

CH 3

O OH

N C S

+

CH 3

Piruvato

Hidroxietil-TPP

Citosol Matriz mitocondrial

NAD NADH,H

Complexo piruvato desidrogenase

COO C O CH 3 H

Piruvato translocase

+ +^ +

HS-CoA CO 2 S-CoA C O CH 3 Piruvato Acetil-CoA

Piruvato

194 • MOTTA • Bioquímica

grupo prostético lipoamida. A reação de transferência regenera o TPP da E1 e oxida o grupo hidroetil a um grupo acetila.

3. Transferência do grupo acetila para a coenzima A, em reação catalisada pela diidrolipoil − transacetilase. 4. Regeneração do complexo da piruvato−desidrogenase original. O grupo diidrolipoato da E2 é reduzido pela flavina adenina dinuclotídeo (FAD) em presença de diidrolipoil − desidrogenase com a regeneração do lipoato.

CoA SH

C

O CH 3

S

HS

Coenzima A

Acetil CoA

CoA S C CH 3

O

+

HS

HS

N

H O C CH 3

S

S

C S

+

CH 3

H +

N

H O C CH 3

HS

S

C S

+

CH 3

N

HS

S

C S

+

CH 3

C

O CH 3

S

S CH 2 CH (^2) CH 2

CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C NH (CH )2 4 CH

O NH

C O

Lipoamina

Ácido lipóico Lis

Lipoamina

H +

196 • MOTTA • Bioquímica

Figura 7. Operação do complexo da piruvato-desidrogenase. TTP = pirofosfato de tiamina. O lipoato tem dois grupos tiós (−SH) que formam uma ligação dissulfeto (−S−S−) por oxidação.

Os mecanismos de regulação alostérica do complexo são complementados por modificações covalentes de proteínas. O complexo é inibido por fosforilação pela ação de proteína-cinase (altos teores de piruvato, CoASH e NAD +^ inibem a cinase) e ativado por desfosforilação pela ação de fosfatases quando os níveis de [ATP] mitocondrial declinam. A seguir a fórmula d coenzima A (CoA):

TPP

Hidroxietil-TPP Lipoamida

FAD S

S

CO (^2)

NADH + H +

NAD +

Piruvato

CH 3 C C

O (^) O

O

1 2

CH 3 C TPP

OH

HS

CH 3 C S

O

S

S

HS

HS

Acetil-diidrolipoamida

FAD SH

SH

3

4

5

CoA

CH 3 C S CoA

O

Acetil-CoA

Piruvato desidrogenase (^) transacetilaseDiidrolipoil

Diidrolipoil desidrogenase

7 Ciclo do ácido cítrico • 197

A. Destinos metabólicos do acetil-CoA

Os principais destinos metabólicos do acetil−CoA produzido na mitocôndria incluem: (1) completa oxidação do grupo acetila no ciclo do ácido cítrico para a geração de energia; (2) conversão do excesso de acetil−CoA em corpos cetônicos (acetoacetato, β −hidroxibutirato e acetona) no fígado; (3) transferência de unidades acetila para o citosol com a subseqüente biossíntese de moléculas complexas como os esteróis e ácidos graxos de cadeia longa.

S C CH

CH 2 CH

NH C O

CH CH

NH

2 2

C O HO C H

H C C CH CH 2 O P O P O

Resíduo de -mercaptoetilamida

N N

N

NH 2

H

O

O

H H^ H

OH

CH 2

N

2

3 O^ O

O O

Adenosina-3 -fosfato

Resíduo de ácido pantotênico

O P O

O

3

O

3

Grupo acetil

Acetil-coenzima A (acetil-CoA)

´

α

7 Ciclo do ácido cítrico • 199

Figura 7. Reações do ciclo do ácido cítrico. O ciclo oxida duas unidades de carbono com a produção de duas moléculas de CO 2 , uma molécula de GTP, três moléculas de NADH e uma molécula de FADH 2.

1. Condensação da acetil-CoA com o oxaloacetato. A etapa inicial do ciclo do ácido cítrico é a condensação do acetil−CoA com o

HO C COO

CH

COO

CH 2

2

COO

Citrato

Acetil-CoA

CoASH

H O 2

CH C S CoA

O

3

1. Citrato- sintase

CH

C O

COO

COO

2

Oxaloacetato

NADH

NAD +

8. Malato- desidrogenase

HO C COO

CH

COO

HO C H

2

COO

Isocitrato

2. Aconitase

Ciclo do ácido cítrico

CH COO

HO C H

2

COO

L-Malato

7. Fumarase

H O 2

HC

CH

COO

COO

Fumarato

FAD

FADH (^2)

6. Succinato- desidrogenase

Succinil-CoA

CoASH

5. Succinil- CoA-sintetase Succionato

CH (^2)

COO

CH (^2)

COO

GTP GDP + P i

CoASH CO (^2)

NADH

NAD +

4. -Cetoglutarato- desidrogenase

CH

C O

2

COO

CH (^2)

COO

CH

C O

2

COO

CH 2

S Coa

-Cetoglutarato

NAD +

NADH

CO 2

3. Isocitrato- desidrogenase

200 • MOTTA • Bioquímica

oxalacetato para formar citrato e CoA livre, em reação irreversível catalisada pela citrato − sintase. A condensação aldólica ocorre entre o grupo metílico da acetil−CoA e o grupo carboxílico do oxaloacetato, com hidrólise da ligação tioéster e a produção de coenzima A livre. A reação é altamente exergônica (∆ G °′ = −31,5 kJ·mol−^1 ).

C CH 2 COO-

COO-

O

• CoA^ S^ C^ CH 3

O

• H^2 O^ C

CH 2

COO-

CH 2 COO-

HO COO- + CoA SH

A citrato-sintase é inibida pelo ATP, NADH, succinil−CoA e ésteres acil−CoA graxos. A velocidade de reação é determinada pela disponibilidade de acetil−CoA e do oxaloacetato. O citrato também está envolvido na regulação de outras vias metabólicas (inibe a fosfofrutocinase na glicólise e ativa a acetil − CoA − carboxilase na síntese dos ácidos graxos) e como fonte de carbono e equivalentes redutores para vários processos de síntese. Além da condensação com o acetil−CoA para formar citrato, o oxaloacetato pode ser transformado em piruvato, glicose (gliconeogênese) e aspartato.

2. Isomerização do citrato em isocitrato via cis − aconitato. A aconitase catalisa a isomerização reversível do citrato e do isocitrato, por meio do intermediário cis −aconitato. A mistura em equilíbrio contém 90% de citrato, 4% de cis −aconitato e 6% de isocitrato. No meio celular, a reação é deslocada para a direita, porque o isocitrato é rapidamente removido na etapa seguinte do ciclo. A aconitase contém um centro ferro−enxôfre que atua tanto na ligação do substrato como na catálise da reação.

202 • MOTTA • Bioquímica

5. Clivagem da succinil − CoA com formação de GTP. A succinil − CoA − sintetase (succinato−tiocinase) hidrolisa a ligação

tioéster de “alta energia” da succinil−CoA (∆ G °′ = −32,

kJ·mol−^1 )para formar succinato. A energia liberada é conservada como

trifosfato de guanosina (GTP) produzida a partir de GDP + P i (∆ G °′

= −30,5 kJ·mol−^1 ), em uma fosforilação ao nível do substrato. O teor energético do GTP é equivalente ao do ATP.

CH 2

CH 2

C S

COO -

O CoA

• GTP^ + Pi CH 2

CH 2

COO-

COO-

• GTP^ +^ CoA^ SH

Em presença da nucleosídio − difosfato − cinase e Mg 2+ , o GTP é convertido reversivelmente em ATP:

GTP + ADP ' GDP + ATP

6. Oxidação do succinato para formar fumarato e FADH 2. O succinato é oxidado a fumarato pela succinato − desidrogenase. Essa enzima necessita de flavina adenina dinucleotídio (FAD) ligada covalentemente. Nas células dos mamíferos, a enzima está firmemente ligada à membrana mitocondrial interna sendo um componente da succinato−ubiquinona, um complexo multiprotéico que participa da cadeia mitocondrial transportadora de elétrons. A succinato−desidrogenase é fortemente inibida competitivamente pelo malonato e ativada pelo ATP, fósforo inorgânico e succinato.

COO H C O

COO

C C OOC

Succinato Fumarato

H C H Succinato-desidrogenase H

Enz-FAD Enz-FADH (^2) H COO

COO CH CoASH^ CO

CH 2

COO

2 2

C O

COO CH

CH 2

S CoA

2

NAD +^ NADH C^ O

α-Cetoglutarato Succinil-CoA

7 Ciclo do ácido cítrico • 203

Os co-fatores participam da transferência de elétrons do succinato para a ubiquinona.

7. Hidratação da liga dupla do fumarato para formar malato e o terceiro NADH. O fumarato é hidratado a L−malato pela enzima fumarase. A enzima é estereoespecífica e catalisa a hidratação da dupla ligação trans do fumarato. 8. Oxidação do malato a oxaloacetato. A reação final do ciclo é catalisada pela malato-desidrogenase com a formação de oxaloacetato e NADH. A posição de equilíbrio dessa reação está deslocada quase totalmente para a síntese do L−malato (∆ G °′= +29,7 kJ·mol−^1 ). Entretanto, a rápida remoção do oxaloacetato pela citrato sintase para a formação de citrato, possibilita a oxidação do malato.

Além da condensação com a acetil−CoA para formar citrato, o oxaloacetado pode ser transformado em piruvato, glicose (neoglicogênese) e aspartato ( ver Metabolismo dos aminoácidos).

A. Energia no ciclo do ácido cítrico

O ciclo do ácido cítrico é a via oxidativa terminal para a maioria dos combustíveis metabólicos (piruvato, aminoácidos e ácidos graxos). Os dois carbonos do grupo acetila que participam do ciclo são oxidados completamente a CO 2 e H 2 O. A energia liberada por essas oxidações é conservada na forma de três NADH, um FADH 2 e uma molécula de GTP (ou ATP). Para cada NADH que transfere seus elétrons para a cadeia mitocondrial transportadora de elétrons ( ver Capítulo 8: Fosforilação oxidativa), aproximadamente 2,5 ATP são produzidos a partir de ADP + P i. Para cada FADH 2 , cerca de 1,5 ATP são produzidos. Assim, a completa oxidação do grupo acetila da acetil−CoA no ciclo do ácido cítrico produz 10 ATP.

COO H C OH

Fumarase COO

COO CH

HC

COO Fumarato Malato

H C H

H O 2

COO H C OH

NAD NAD + H

CH 2 Malato-desidrogenase

COO

COO C O

CH 2

COO

+ +

Malato Oxaloacetato

Enzima-FADH 2 Enzima-FAD

Q QH (^2)

7 Ciclo do ácido cítrico • 205

Figura 7. Regulação do fluxo metabólico do ciclo do ácido cítrico

7.3 Entrada e saída de intermediários do ciclo do

ácido cítrico

O ciclo do ácido cítrico tem papel central no catabolismo de carboidratos, ácidos graxos e aminoácidos, com liberação e conservação de energia. Entretanto, o ciclo também está envolvido no fornecimento de precursores para muitas vias biossintéticas. O ciclo do ácido cítrico é, portanto, anfibólico (anabólico e catabólico). Os intermediários do ciclo (exceto o isocitrato e o succinato) são precursores ou produtos de várias moléculas biológicas. Por exemplo, a succinil−CoA é precursora da maioria dos átomos de carbono das porfirinas. Os aminoácidos aspartato e glutamato podem ser provenientes do oxaloacetato e α −cetoglutarato, respectivamente, via reações de transaminação. A síntese de ácidos graxos e colesterol no citosol necessita de acetil−CoA gerada a partir do citrato que

Acetil-CoA

Citrato sintase

CoA-SH

H O 2

Aconitase

Aconitase

-Cetoglutarato

Isocitrato desidrogenase

Succinil-CoA

Complexo da -cetoglutarato desidrogenase

Citrato

Succinato Succinil-CoA sintetase

Succinato desidrogenase

Fumarato

Malato

Fumarase

Oxaloacetato

Malato desidrogenase

CO 2

Cis-aconitato

CO 2

NADH, ATP, Citrato

NAD ,ADP, Ca + NADH, ATP

NADH

Ca 2 +

2 +

Isocitrato

206 • MOTTA • Bioquímica

atravessa a membrana mitocondrial ( ver Capítulo 10: Metabolismo dos lipídeos).

Quadro 7.2 Ciclo do glioxilato

Nos vegetais, em certos microrganismos e em levedura é possível sintetizar carboidratos a partir de substratos de dois carbonos como o acetato e etanol, por meio de uma via alternativa chamada ciclo do glioxilato. A via emprega as enzimas do ciclo do ácido cítrico, além de duas enzimas ausentes nos tecidos animais: a isocitrato − iase e a malato − sintase. Pela ação da isocitrato−liase, o isocitrato é clivado em succinato e glioxilato. O glioxilato condensa com uma segunda molécula de acetil-CoA sob a ação da malato-sintase (em reação análoga àquela catalisada pela citrato-sintase no ciclo do ácido cítrico) para formar malato.

O malato passa para o citosol, onde é oxidado a oxaloacetato, que pode ser transformado em glicose pelas reações da gliconeogênese ou se condensar com outra molécula de acetil−CoA e iniciar outra volta do ciclo. Nas plantas, o ciclo do glioxalato está localizado em organelas chamadas glioxissomos. Os animais vertebrados não apresentam o ciclo do glioxilato e não podem sintetizar glicose a partir de acetil−CoA. Nas sementes em germinação, as enzimas do ciclo do glioxilato degradam os ácidos graxos que são convertidos em glicose, precursor da celulose.

Os intermediários do ciclo do ácido cítrico desviados para a biossíntese de novos compostos devem ser repostos por reações que permitam restabelecer seus níveis apropriados. Além disso, as flutuações nas condições celulares podem necessitar de aumento na atividade do ciclo, o que requer a suplementação de intermediários. O processo de reposição de intermediários do ciclo é chamado anaplerose (do grego, preencher completamente). A produção de oxaloacetato permite a entrada do grupo acetila no ciclo do ácido cítrico (oxaloacetato + acetil−CoA → citrato) e é a mais importante reação anaplerótica. Em deficiências de qualquer dos intermediários do ciclo, o oxaloacetato é formado pela carboxilação reversível do piruvato por CO 2 , em reação catalisada pela piruvato − carboxilase que contém biotina como coenzima. O excesso de acetil-CoA ativa alostericamente a enzima.

Piruvato + CO 2 + ATP + H 2 O ' oxaloacetato + ADP + P i

As reações do ciclo convertem o oxaloacetato nos intermediários deficientes para que se restabeleça sua concentração apropriada. A síntese do oxaloacetato ocorre também a partir do fosfoenolpiruvato e é catalisada pela fosfoenolpiruvato − carboxicinase presente tanto no citosol como na matriz mitocondrial. A enzima é ativada pelo intermediário glicolítico frutose−1,6−bifosfato, cuja concentração aumenta quando o ciclo do ácido cítrico atua lentamente.

Fosfoenolpiruvato + CO 2 + GDP ' oxaloacetato + GTP

Pela ação conjunta das duas enzimas malato−desidrogenase (“enzima málica”), o malato (e o oxaloacetato) pode ser produzido a partir do piruvato:

Piruvato + CO 2 + NAD(P)H ' malato + NAD(P) +

Outras reações que abastecem o ciclo do ácido cítrico incluem a succinil-CoA, um produto do catabolismo de ácidos graxos de cadeia ímpar, e os α−cetoácidos a partir do α−cetoglutarato e oxaloacetato

208 • MOTTA • Bioquímica

Referências

BLACKSTOCK, J. C, Biochemistry. Oxford: Butterworth, 1998. p. 47-75. CAMPBELL, M. K. Bioquímica. 3 ed. Porto Alegre: ArtMed, 2000. p. 492-519. NELSON, D. L., COX, M. M. Lehninger: Princípios de bioquímica. 3 ed. São Paulo: Sarvier, 2002. p. 441-64. MOTTA, V. T. Bioquímica clínica para o laboratório: princípios e interpretações. 4 ed. Porto Alegre: Editora Médica Missau, 2003. p. 75-103.