Disertação-identificação de patogenos causadores de mastite por espectrometria de massa, Notas de estudo de Ciências Biologicas

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JULIANA REGINA BARREIRO

Identificação de patógenos causadores de mastite

subclínica por espectrometria de massas

Pirassununga 2010

JULIANA REGINA BARREIRO

Identificação de patógenos causadores de mastite

subclínica por espectrometria de massas

Pirassununga 2010

Dissertação apresentada no Programa de Pós- Graduação em Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento: Nutrição e Produção Animal

Área de concentração: Nutrição e Produção Animal

Orientador: Prof. Dr. Marcos Veiga dos Santos

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: BARREIRO, Juliana Regina

Título: Identificação de patógenos causadores de mastite subclínica por espectrometria de massas.

Data://___

Banca Examinadora

Prof.Dr._____________________________ Instituição:_______________________

Assinatura:__________________________ Julgamento_______________________

Prof.Dr._____________________________ Instituição:_______________________

Assinatura:__________________________ Julgamento_______________________

Prof.Dr._____________________________ Instituição:_______________________

Assinatura:__________________________ Julgamento_______________________

Dissertação apresentada no Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciência

AGRADECIMENTOS

À Deus por guiar-me nesta e em todas as trajetórias de minha vida;

Agradeço as oportunidades proporcionadas pela Universidade de São Paulo, a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, e ao Departamento de Nutrição e Produção Animal pelo apoio incessante ao trabalho, aprimoramento pelo conhecimento profissional, acadêmico e científico;

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela concessão da bolsa de estudo;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão do auxílio à pesquisa;

Ao orientador Prof. Dr. Marcos Veiga dos Santos, pela orientação, pelo profissionalismo, pelos ensinamentos, pela confiança e pela paciência;

À Christina Ramires Ferreira pela compreensão, humildade, amizade, atenção, dedicação e ensinamentos ao longo desta etapa;

Aos grandes amigos que se tornaram irmãs e irmãos que tiveram presentes em todos os momentos sendo eles bons ou ruins: Ju Diniz, Barbara Marques, Dani Beuron (Guria), Dani Geronimo, Nara Consolo (Magrela), Carol Malek, Elmeson (Mineirinho), Henrique (Branquelo), Amanda (Potranca), Ana Paula (Bodinha), Natália (Caiçara);

Aos meus queridos Ju Naves e Ailton pelo carinho, atenção, conselhos e alegria, fazendo com que esta etapa se tornasse mais branda;

Á família Raspantini: Ester, Paulo Cesar, Paulinho, Débora e em especial Filipe que sempre presentes com carinho, alegria e companheirismo tornaram está fase mais branda;

À todos os professores do Departamento de Nutrição e Produção Animal (VNP): Dr. Ricardo Albuquerque, Dr. Paulo Henrique Mazza, Dr. Alexandre Gobesso, Dr. Anibal de Sant'Anna Moretti, Dra. Angélica Simone Cravo Pereira, Dr. Romualdo Shigueo Fukushima, Dr. Augusto Hauber Gameiro, Dr. Luís Felipe Prada e Silva, Dr. Francisco Palma Rennó, Dra. Maria de Fátima pelos ensinamentos ao longo dessa etapa e profissionalismo;

Aos colegas e amigos de mestrado pelos momentos inesquecíveis e ensinamentos eternos: Milton Maturana, Paulinha Duarte, Dani Donatto, Ju Pinheiro, Claudinha, Carol Tobias, Henry, Anaí Naves, Rafa (bizão), Tarley, Rinaldo, Marília, Marina, Tenente Ribeiro, Fernando (Boi), Cris Cortinhas, Lenita, José Esler (Zé), Jefferson e Erika Gandra, Bruno Botaro, Marco Aurélio, Juliano, Cássia, Fernanda, Maria Fernanda, Francine, Esther, Mayara, Larissa, Flávio “Perna”, Ana Paula, Bia (Beatriz), Iaçanã, João (Pé), Maurício (Xibungo), Eduardo (Frodo), Paula Pieruzzi, Lara, Tiago Tomazi;

Aos funcionários da Secretaria do VNP, Sr. José Francisco M. Ferreira e Sra. Alessandra de Cássia T. da Silva, Sr. João Paulo de Oliveira Barros pelo apoio e atenção dispensadas;

Sr. José Franchini Garcia Moreno e Sra. Lucinéia Mestieri, funcionários do Laboratório de Tecnologia de Produtos de Origem Animal do Departamento de Nutrição e Produção Animal FMVZ-USP, pelo auxílio na realização das análises laboratoriais, amizade e carinho;

Aos funcionários competentes do Setor de Bovinocultura de Leite da Prefeitura do Campus Administrativo de Pirassununga – PCAPS, Srs. Carlos Alberto Schimmitt, João Paulo Pagotti, Valmir Donizetti Botteon e José Antônio Coelho pelo apoio, atenção, alegria e amizade dispensadas;

Ao Sr. Gilmar Edson Botteon (Sr. Gigi), funcionário dedicado, atencioso e amigo;

Às queridas moças da faxina, pelo bom humor diário, amizade e carinho.

RESUMO

BARREIRO, J. R. Identificação de patógenos causadores de mastite subclínica por espectrometria de massas. [Identification of subclinical mastitis pathogens causing by mass spectrometry.]. 2011. 75 f. Dissertação (Mestrado em Ciência) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2010.

O diagnóstico rápido e eficiente da mastite subclínica é importante para reduzir a persistência da doença e os prejuízos decorrentes. O objetivo do estudo foi avaliar a técnica de espectrometria de massas (MS) por ionização e dessorção a laser assistida por matriz - tempo-de-vôo (MALDI-TOF) para identificação de bactérias causadoras de mastite subclínica bovina por dois métodos: 1) a partir de bactérias isoladas por cultivo microbiológico; 2) a partir da recuperação de bactérias diretamente do leite, visando eliminar completamente a necessidade de cultivo microbiológico para identificação dos patógenos. O estudo foi composto por dois experimentos (1 e 2), no experimento 1 foram utilizadas 33 amostras de leite provenientes de animais das raças Gir e Holandesa de quatro fazendas leiteiras para a identificação microbiológica e MALDI-TOF MS. As amostras com resultados conflitantes foram confirmadas por sequenciamento do gene 16S rRNA. Os resultados de cultura microbiológica foram Staphylococcus aureus (n = 13), Streptococcus agalactiae (n = 10) e Estafilococos coagulase negativo (ECN) (n = 10). Para todas as amostras de Streptococcus agalactiae , resultados similares foram observados para a identificação microbiológica e por MALDI-TOF MS. De 13 isolados de Staphylococcus aureus, 11 foram igualmente identificados por MALDI- TOF, 1 isolado foi identificado como Staphylococcus haemolyticus por sequenciamento do gene 16S rRNA, e o outro isolado isolado com resultado conflitante foi caracterizado como cultura mista de Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis. Em relação às amostras de ECN, todas as amostras do grupo foram identificadas por MALDI-TOF em nível de gênero (S. simulans , S. epidermidis, S. Haemolyticus , S. Chromogens e S. aureus coagulase negativa). No experimento 2 foi avaliado o método de recuperação de bactérias presentes em leite e sua identificação por MALDI-TOF MS utilizando o método de contaminação experimental de leite com Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus. A identificação de patógenos recuperados diretamente do leite foi possível

quando a concentração de E. faecalis e S. aureus foi de 10^6 ufc/mL, e de 10^7 ufc/mL para E.coli. Concluímos que o uso de MALDI-TOF MS pode acelerar a identificação de patógenos causadores de mastite subclínica bovina podendo contribuir para a adoção de medidas de controle e tratamento mais adequado.

Palavras-chave: Mastite subclínica. Espectrometria de Massas. Bactéria. MALDI- TOF MS. Bovino. Leite.

We conclude that the use of MALDI-TOF MS can accelerate the identification of pathogens causing bovine subclinical mastitis may contribute to the adoption of control measures and appropriate treatment.

Keywords : Mastitis_._ Mass Spectrometry. Bacterium. MALDI-TOF MS. Milk. Bovine

LISTA DE TABELA E QUADRO

Tabela 1 - Frequência de microrganismos isolados de amostras de leite de quartos mamários de quatro fazendas comerciais pelo método microbiológico. ................................................................................................... 47

Quadro 1 - Identificação de agentes causadores de mastite subclínica por cultura microbiológica e por MALDI-TOF MS. ........................................ 48

Figura 9 - Espectros de massas obtidos a partir do processamento de amostras contendo concentrações iniciais de 10^2 a 10^5 E. coli mL-^1 , em (a) 10^2 , (b) 10^3 , (c) 10^4 e (d) 10^5. ............................................. 54

Figura 10- Planilha de resultados fornecida pelo programa computacional Biotyper após coleta e processamento dos espectros de massas. ........ 55

Figura 11- MALDI-TOF MS: espectros obtidos a partir da identificação de microorganismos instantânea de leite em etanol 75%. A quantidade de leite de cada amostra foi de 300 μL (a) 10^7 , (b) 108 e (c) 10^9 mL de E. coli -^1 , e (d) 10^7 e (e) 10^8 do E. faecalis mL- (^1). ............................................................................................................. 56

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BHI Brain Heart Infusion CCS Contagem de Células Somáticas CHCA Ácido alfa-ciano-4-hidroxicinamínico CI Ionização Química CMBT Ácido 5-cloro-2-mecaptobenzothiazole CMT Califormia Mastitis Test DESI Ionização por Dessorção de Spray de Elétrons DHB Ácido Diidróxido Benzóico DO Densidade Óptica EC Condutividade Elétrica ECN Estafilicocos coagulase negativa EI Ionização Eletrônica EM Multiplicadores de Fótons ESI Ionização por Spray de Elétrons FAB Ionização por Bombardeamento Rápido FT Transformada de Fourier IM Analizadores de Mobilidade de Íons IQPA Ionização Química a Pressão Atmosférica IT Armadinha de Íons KOH Hidróxido de Potássio LB Caldo Lysogeny MALDI Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz PCR Reação em Cadeia pela Polimeras SA Ácido Sinapínico TOF Tempo-de-vôo TFA Ácido Trifluoroacético TSA Agar Tripticase de Soja VS Streptococcus viridans WMT Wisconsin Mastitis Test

4.1.6 Processamento dos dados.................................................................... 41

4.2 EXPERIMENTO 2 – IDENTIFICAÇÃO DE MICROORGANISMOS CAUSADORES DE MASTITE A PARTIR DO LEITE POR MALDI-TOF MS ......... 42

4.2.1 Cepas Bacterianas................................................................................ 42

4.2.2 Contaminação bacteriana experimental do leite................................... 43

4.2.3 Incubação de leite experimentalmente contaminado............................ 44

4.2.4 Leite contaminado total tratado com etanol para a inativação de bactérias e armazenamento da amostra........................................................... 44

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 46

5.1 BACTÉRIAS CAUSADORAS DE MASTITE SUBCLÍNICA ................................... 46

5.2 EXPERIMENTO I - IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS CAUSADORAS DE MASTITE SUBCLÍNICA POR MALDI-TOF MS ..................................................... 47

5.3 EXPERIMENTO II – IDENTIFICAÇÃO DE MICROORGANISMOS CAUSADORES DE MASTITE SUBCLÍNICA A PARTIR DE LEITE PELO MALDI- TOF MS ................................................................................................................. 51

5.3.1 Identificaçao direta de bactérias presentes no leite.............................. 51

5.3.2 Incubação do leite experimentalmente contaminado............................ 53

5.3.3 Identificação direta de bactérias em amostras de leite com etanol...... 55

6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 58

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 59

• ANEXO A
• ANEXO B