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Incqs - 65.3210-007 - método da diluição de uso, Notas de estudo de Engenharia Ambiental

INCQS - 65.3210-007 - MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO

Tipologia: Notas de estudo

2010
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Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Av. Brasil, 4365 - Manguinhos - CEP 21045-900 - Rio de Janeiro - RJ - Brasil
Tel: (0xx21) 3865 –5100 / 3865-5151 Fax: (0xx21) 2290-0915
MANUAL DA QUALIDADE
PÁGINA
1/20
TÍTULO: MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO
NÚMERO
65.3210.007
PALAVRAS-CHAVE
DESINFETANTE - BACTERICIDA
REVISÃO
07
SEÇÃO DO
MANUAL
10
ELABORADO
Célia Romão
VERIFICADO
M. Helena V. Bôas/Neide H.
Miyazaki
APROVADO
Marise S. de Magalhães
REFERENDADO
André L. Gemal
DATA
12/02/2004
SUMÁRIO
1. Objetivo
2. Campo de aplicação
3. Definição
4. Sigla
5. Condições gerais
6. Condições específicas
7. Bibliografia
8. Anexos
A. Meios de Cultura
B. Soluções
1. OBJETIVO
Este Procedimento Operacional Padronizado (POP) estabelece a metodologia a ser
adotada para a avaliação da atividade bactericida de desinfetantes.
2. CAMPO DE APLICAÇÃO
Este POP aplica-se à análise microbiológica dos desinfetantes classificados, segundo a
Portaria DISAD n.º 15/88, como:
a) desinfetante de uso geral;
b) desinfetante para indústria alimentícia;
c) desinfetante para lactários;
d) desinfetante hospitalar para superfícies fixas;
e) desinfetante hospitalar para artigos semi-críticos.
3. DEFINIÇÃO
Para efeito deste POP é adotada a seguinte definição:
pf3
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MANUAL DA QUALIDADE

PÁGINA 1/

TÍTULO: MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO^

NÚMERO

PALAVRAS-CHAVE DESINFETANTE - BACTERICIDA

REVISÃO 07

SEÇÃO DO MANUAL 10

ELABORADO Célia Romão

VERIFICADO M. Helena V. Bôas/Neide H. Miyazaki

APROVADO Marise S. de Magalhães

REFERENDADO André L. Gemal

DATA 12/02/

SUMÁRIO

  1. Objetivo
  2. Campo de aplicação
  3. Definição
  4. Sigla
  5. Condições gerais
  6. Condições específicas
  7. Bibliografia
  8. Anexos A. Meios de Cultura B. Soluções

1. OBJETIVO

Este Procedimento Operacional Padronizado (POP) estabelece a metodologia a ser adotada para a avaliação da atividade bactericida de desinfetantes.

2. CAMPO DE APLICAÇÃO

Este POP aplica-se à análise microbiológica dos desinfetantes classificados, segundo a Portaria DISAD n.º 15/88, como:

a) desinfetante de uso geral; b) desinfetante para indústria alimentícia; c) desinfetante para lactários; d) desinfetante hospitalar para superfícies fixas; e) desinfetante hospitalar para artigos semi-críticos.

3. DEFINIÇÃO

Para efeito deste POP é adotada a seguinte definição:

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TÍTULO: MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO

NÚMERO

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3.1 – Subcultura

Cultivo realizado após o contato do microrganismo teste com o desinfetante, para verificação de microrganismos sobreviventes.

4. SIGLA

É usada no texto deste POP a seguinte sigla:

ATCC - American Type Culture Collection

5. CONDIÇÕES GERAIS

5.1 – Material e equipamentos:

a) material:

  • pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL;
  • provetas graduadas de 100, 250, 500 e 1000 mL com tampa esmerilhada;
  • erlenmeyers de 250, 500 e 1000 mL;
  • lâminas para microscopia;
  • tubos de ensaio de 25 mm x 150 mm com tampa de aço inoxidável;
  • tubos de ensaio de 18 mm x 180 mm e 20 mm x 200 mm com tampa de algodão;
  • tubos de ensaio de 20 mm x 160 mm e 25 mm x 200 mm com tampa de rosca;
  • placas de Petri com 100 mm de diâmetro forradas com 2 folhas de papel de filtro Whatman nº 2 ou similar;
  • placas de Petri com 100 mm de diâmetro;
  • gancho de transferência de fio de Nichrome com bitola B & S nº 18 ou similar com a extremidade dobrada (± 3 mm) formando um ângulo suficiente para permitir o transporte de cilindros;
  • alça de transferência: fazer uma alça de 4 mm de diâmetro interno na extremidade de um fio de platina ou liga de platina, com bitola B & S nº 23 ou similar com 50 - 75 mm de comprimento ou utilizar uma alça de 4 mm fundida. Fazer um ângulo de 30 o^ em relação à haste;
  • fita indicadora de pH;
  • cilindros carreadores : cilindros de aço inoxidável tipo 304, SS 18 - 8, polidos, com 8 ± 1mm (diâmetro externo) x 6 ± 1mm (diâmetro interno) x 10 ± 1 mm (comprimento); Fabricante: S & L Metal Products Corp. 58-29-57 Drive, Maspeth NY 11378;
  • papel de filtro Whatman nº 2 ou similar;
  • estantes para tubos de ensaio;
  • banho de água a 20 º C. b) equipamentos:
  • termômetro;
  • cronômetro;
  • estufa bacteriológica a 36 ± 1º C;

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TÍTULO: MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO

NÚMERO

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Staphylococcus aureus INCQS n.º 00039 (ATCC nº 6538 ) Salmonella choleraesuis INCQS n.º 00028 (ATCC n.º 10708) Pseudomonas aeruginosa INCQS n.º 00025 (ATCC n.º 15442) Escherichia coli INCQS n.º 00032 (ATCC n.° 11229 )

6. CONDIÇÕES ESPECÍFICAS

6.1 – Preparo dos cilindros carreadores:

a) observar os cilindros quanto a danos visíveis (orifícios, lascas, falta de polimento, arranhões). Desprezar os cilindros danificados; b) ferver os cilindros em água destilada por 10 minutos; c) mergulhar os cilindros em solução de hidróxido de sódio 1N e deixar durante uma noite; d) lavar abundantemente com água da torneira até que a água de lavagem não apresente pH básico. Medir o pH com fita indicadora de pH. Rinsar, então, 5 vezes com água destilada; e) colocar os cilindros em tubos de ensaio 25 mm x 200 mm com tampa de rosca (ou em erlenmeyer), na quantidade de 11 cilindros por tubo e cobrir com a solução de asparagina a 0,1%. Esterilizar por autoclavação a 121º C por 20 minutos. Guardar à temperatura ambiente; f) fazer a triagem dos cilindros através do Método da Diluição de Uso, utilizando o S. aureus INCQS n.º 00039 (ATCC n.º 6538) e uma solução de 500 ppm de cloreto de alquil dimetil benzil amônio. Desprezar os cilindros que apresentarem crescimento neste ensaio de triagem. Nos ensaios com as amostras de desinfetantes, cilindros que apresentam crescimento devem ser novamente triados e somente poderão ser reutilizados se não apresentarem crescimento nesta nova triagem.

6.2 – Especificação dos microrganismos teste de acordo com a classe do produto em análise

6.2.1 – Desinfetante de uso geral e desinfetante para lactários

Staphylococcus aureus INCQS n.º 00039 (ATCC n.º 6538) Salmonella choleraesuis INCQS n.º 00028 (ATCC n.º 10708)

6.2.2 – Desinfetante hospitalar para superfícies fixas e desinfetante hospitalar para artigos semi-críticos

Staphylococcus aureus INCQS n.º 00039 (ATCC n.º 6538) Salmonella choleraesuis INCQS n.º 00028 (ATCC n.º 10708) Pseudomonas aeruginosa INCQS n.º 00025 (ATCC n.º 15442)

6.2.3 – Desinfetante para a indústria alimentícia

Staphylococcus aureus INCQS n.º 00039 (ATCC n.º 6538)

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TÍTULO: MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO

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Escherichia coli INCQS n.º 00032 (ATCC n.º 11229)

6.3 – Preparo das culturas teste

6.3.1 – Salmonella choleraesuis :

a) reconstituir uma ampola com o microrganismo liofilizado com caldo nutriente D, transferir uma alíquota para um tubo contendo o mesmo caldo. Incubar por 18-24 h a 36 ± 1ºC; b) a partir do crescimento em caldo nutriente D proceder a bacterioscopia corando pelo método de Gram, onde devem ser observados bastonetes gram negativos; c) verificar a pureza da cultura em caldo nutriente D semeando em uma placa de Petri com ágar nutriente D e incubar por 18-24 h a 36 ± 1ºC. Se houver contaminação, descartar a cultura; d) se a cultura estiver pura, escolher uma colônia isolada e semear em três tubos com ágar nutriente inclinado. Incubar por 48 h a 36 ± 1ºC e estocar a 2-5ºC por um mês; e) manter a cultura estoque em ágar nutriente inclinado, fazendo repiques mensais em três tubos com ágar nutriente inclinado. Incubar os novos repiques por 48 horas a 36 ± 1º C e estocar a 2 - 5º C. Renovar, semestralmente, a cultura estoque abrindo nova ampola com o microrganismo liofilizado; f) a partir da cultura estoque inocular um tubo de 25 mm x 150 mm contendo 10 mL de caldo nutriente (1º repique). Incubar por 24 horas a 36 ± 1º C. Fazer então mais 2 repiques consecutivos, em 10 mL de caldo nutriente, usando uma alça de 4 mm para transferência do inóculo (2º e 3º repiques). Incubar cada repique por 24 horas a 36 ± 1º C. Inocular então, a partir do 3º repique, o 4º repique em 7 tubos contendo 10 mL de caldo nutriente (o número de tubos a serem inoculados poderá variar de acordo com o número de cilindros a serem empregados no ensaio, conforme seção 6.5). Incubar por 48 – 54 horas a 36 ± 1º C. Se mais de um repique de 24 horas for omitido, recomeçar a série de repiques consecutivos, a partir da cultura estoque; g) no caso de ensaios com desinfetantes contendo tensoativos que indicam procedimentos de limpeza e desinfecção simultaneamente, adicionar soro de cavalo à cultura teste, na proporção de 5% ( v / v ), imediatamente antes de realizar o ensaio; h) o caldo sintético poderá ser utilizado como substituto do caldo nutriente, devendo neste caso os tubos inoculados serem incubados na posição inclinada; i) controlar a cultura teste determinando a sua resistência ao fenol, da seguinte maneira:

  • a partir da solução estoque de fenol a 5% (1:20) preparar soluções a 1:90 e 1:100, diretamente nos tubos de 25 mm X 150 mm, removendo o excesso além de 5 mL;
  • colocar os tubos contendo as diluições e a cultura teste em banho de água a 20º C, até alcançar esta temperatura (aproximadamente 10 minutos);
  • adicionar 0,5 mL da cultura teste, com pipeta de 1 mL, ao tubo contendo a solução 1:90 de fenol e após o intervalo de 30 segundos ou 1 minuto fazer o mesmo com o tubo contendo a solução 1:100;
  • após cada adição agitar o tubo delicadamente e recolocá-lo no banho de água a 20º C;
  • após exatamente 5 minutos de contato da primeira semeadura (no tubo com a solução 1:90), transferir uma alçada (com uma alça de transferência de 4 mm de

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  • conservar a cultura estoque de Pseudomonas aeruginosa em três tubos com meio ágar de cistina e digesto pancreático de caseína , distribuído em tubos de 20 mm x 160 mm com tampa de rosca ou similar, na posição vertical;
  • não agitar as culturas teste de 48 - 54 horas antes de remover a película característica do crescimento desse microrganismo;
  • remover a parte líquida do crescimento, com pipeta de 10 mL, deixando a película aderida à parede interna do tubo;
  • se preferir, a película pode ser removida através de sucção com pipeta Pasteur ou graduada de 1 mL, sendo a cultura colocada em um outro tubo de ensaio de 25 mm x 150 mm estéril;
  • agitar a cultura teste, já com a película removida, por 30 segundos em agitador de tubos ou manualmente, antes do ensaio;
  • qualquer ruptura na película implica na não utilização da cultura, uma vez que fragmentos remanescentes na cultura teste poderão levar a resultados falso positivos;
  • utilizar soluções de fenol a 1:80 e 1:90;
  • a cultura teste deve apresentar a seguinte resistência ao fenol:

Fenol Tempo de contato (min) 5 10 15


1:80 (P)ou(N) (P)ou(N) (N)

1:90 (P) (P) (P)


6.3.4 – Escherichia coli :

a) proceder como na seção 6.3.1, utilizando soluções de fenol a 1:80 e 1:90; b) a cultura teste deve apresentar a seguinte resistência ao fenol:


Fenol Tempo de contato (min) 5 10 15


1:80 (P) (P)ou(N) (N)

1:90 (P) (P) (P)


6.4 – Especificação do meio de subcultura a ser utilizado de acordo com o princípio ativo do produto em análise (ver seção 5.2)

Produtos à base de compostos inorgânicos ou orgânicos liberadores de cloro - meio ( k ); Produtos à base de compostos liberadores de iodo - meios ( k ) ou ( l );

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Produtos à base de compostos com metais pesados - meio ( i ); Produtos à base de compostos tensoativos catiônicos - meio ( j ); Produtos à base de compostos fenólicos - meio ( j ) ou ( l ); Produtos à base de aldeídos - meio ( m ); Produtos à base de tensoativos anfotéricos - meio ( l ); Produtos à base de biguanidas - meio ( j ); Produtos à base de peróxidos - meio ( n ).

6.5 – Número de cilindros empregados: 60.

No caso de uma avaliação preliminar empregar 10 cilindros.

6.6 – Procedimentos:

a) agitar as culturas teste por 3 a 4 segundos e deixar em repouso por 10 minutos, à temperatura ambiente, antes de usar; b) transferir 10 cilindros estéreis, em solução de asparagina, com gancho de transferência para 10 mL da cultura teste de 48 - 54 horas (poderão ser adicionados 1 ou 2 cilindros a mais para servir de reserva). Após um período de contato de 15 minutos, à temperatura ambiente, remover os cilindros (retirar o excesso da cultura encostando os carreadores na parede do tubo) e colocá-los em posição vertical sobre papel de filtro contido em uma placa de Petri, com o cuidado de não encostar uns nos outros e nem na parede da placa. Eliminar possíveis bolhas que se formem no interior dos cilindros usando o gancho de transferência. Cobrir a placa e incubar a 36 ± 1 ° C, durante 40 minutos. Carreadores que tombem sobre o papel de filtro devem ser desprezados; c) diluir o desinfetante a ser testado, de acordo com a recomendação do fabricante, com água destilada estéril, em proveta graduada com tampa esmerilhada. Preparar o total de 1000 mL. Distribuir em 60 tubos de 25 mm x 150 mm, na quantidade de 10 mL por tubo identificando o primeiro tubo com o número 1 e o número da amostra. Numerar o restante de 2 a 60. Para assegurar a estabilidade do produto, preparar a diluição no máximo três horas antes de realizar o ensaio; d) colocar 10 tubos em banho de água a 20º C e deixar alcançar esta temperatura (aproximadamente 10 minutos); e) adicionar, então, um cilindro contaminado e seco, a intervalos de um minuto, cronometradamente a cada um dos dez tubos contendo a diluição do desinfetante. Não tocar as paredes dos tubos com os cilindros contaminados ou com o gancho de transferência; f) girar o tubo suavemente três vezes e recolocá-lo no banho de água a 20ºC. Logo, 10 tubos são semeados em 9 minutos, deixando 1 minuto de intervalo antes da transferência do primeiro cilindro carreador para o primeiro tubo de subcultura (10 mL de meio com neutralizante adequado em tubos 25 mm x 150 mm), perfazendo 10 minutos de contato; g) após os 10 minutos de contato, mantendo os intervalos constantes de um minuto entre cada tubo, remover os cilindros dos tubos com desinfetante para os respectivos tubos com meio de subcultura identificados com o número da amostra e numerados de 1 a 10 (primeira bateria de subcultura). Identificar o primeiro tubo com o número da amostra;

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Notas: a) todos os procedimentos devem ser realizados sob condições assépticas; b) as etapas de transferência dos cilindros (para o desinfetante, e do desinfetante para o meio de subcultura) são muito críticas. Poderão ocorrer resultados falso-positivos se as paredes dos tubos forem tocadas com os cilindros ou com o gancho de transferência contaminados.

6.7 – Avaliação

6.7.1 – Leitura dos resultados:

a) observar a presença ou ausência de crescimento bacteriano; b) descrever os resultados como:

  • (P) presença de crescimento bacteriano;
  • (N) ausência de crescimento bacteriano. c) no caso de ocorrer crescimento bacteriano confirmar a presença do microrganismo teste da seguinte maneira:
  • realizar a bacterioscopia corando pelo Método de Gram em pelo menos 20% dos tubos positivos;
  • realizar as seguintes provas: para Salmonella choleraesuis - sorologia com soro polivalente para Salmonella para Staphylococcus aureus - prova da coagulase para Pseudomonas aeruginosa - prova da oxidase e demais provas para identificação bioquímica , se necessário para Escherichia coli - provas bioquímicas

6.7.2 – Critérios:

a) o desinfetante, para ser considerado satisfatório, deve ser capaz de matar os microrganismos teste sobre 59 dos 60 cilindros utilizados, o que confere um nível de confiança de 95%; b) no caso de resultados insatisfatórios, realizar um segundo ensaio para confirmação. Quando o resultado do segundo ensaio for diferente do resultado do primeiro ensaio, realizar o terceiro ensaio. O resultado final será aquele obtido em dois ensaios com o mesmo resultado, conforme a alínea a desta seção.

7. BIBLIOGRAFIA

BELOIAN, A. Disinfectants In: Official methods of analysis. 15 ed. Arlington: Association of Official Analytical Chemists, 1990, cap. 6.

DEY, B.P. & ENGLEY Jr. F. B. Neutralization of antimicrobial chemicals by recovery media Journal of Microbiological Methods. 1994. 19 :51-58.

UNITED States Environmental Protection Agency. Efficacy data requirements ; disinfectants for use on hard surface.Washington, D.C.: 1982. 2p. (DIS/TSS-1).

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UNITED States Environmental Protection Agency. Efficacy data requirements ; supplemental recommendations. Washington, D.C. : 1973. 3p. (DIS/TSS-2).

BRASIL. Portaria nº 15, de 23 de agosto de 1988. Determinar que o registro de produtos saneantes domissanitários com finalidade antimicrobiana seja procedido de acordo com as normas regulamentares anexas à presente. Estabelecer o prazo até as respectivas revalidações dos registros para que os produtos aqui abrangidos e anteriormente registrados se adequem ao novo regulamento. Diário Oficial [ da República Federativa do Brasil ]. Brasília, p. 17041- 3, 5 set 1988, Seção I.

RUSSEL, A. D. Neutralization procedures in the evaluation of bactericidal activity. In: COLLINS, C. H. , ALLWOOD, M. C., BLOOMFIELD, S. F. and FOX, A. Disinfectants: their use and evaluation of effectiveness. London: Academic Press, 1981, 229p. p. 45-59.

/ANEXO A

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ANEXO A – Cont.

Aquecer a mistura até completa dissolução. Ajustar o pH a 7,3 ± 0,1 a 25ºC. Distribuir em porções de aproximadamente 10 mL em tubos 18 mm X 180 mm ou similar. Autoclavar durante 20 minutos a 121º C. Inclinar.

A.4 – Caldo soja tríptica

Digesto pancreático de caseína.......................................................................................17,0 g

Digesto papaínico de soja..................................................................................................3,0 g

Dextrose.............................................................................................................................2,5 g

Cloreto de sódio.................................................................................................................5,0 g

Fosfato di-básico de potássio.............................................................................................2,5 g

Água destilada..............................................................................................................1000 mL

Aquecer levemente a mistura até a completa dissolução. Distribuir em porções de 10 mL em tubos 25 mm x 150 mm ou similar. Autoclavar durante 15 minutos a 121ºC. pH final: 7,3 ± 0,2 a 25º C.

Nota: Para o preparo a partir do meio desidratado, obeceder a recomendação do fabricante.

A.5 - Ágar soja tríptica

Digesto pancreático de caseína.......................................................................................15,0 g

Digesto papaínico de soja..................................................................................................5,0 g

Cloreto de sódio.................................................................................................................5,0 g

Ágar..................................................................................................................................15,0 g

Água destilada..............................................................................................................1000 mL

Aquecer até a fervura para a completa dissolução. Distribuir em porções de 20 mL em tubos 20 mm x 200 mm ou similar. Autoclavar durante 15 minutos a 121ºC. Distribuir cada uma das porções em placas de Petri estéreis. pH final: 7,3 ± 0,2 a 25º C.


/ANEXO A – Cont.

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ANEXO A – Cont.

Nota: Para o preparo a partir do meio desidratado, obeceder a recomendação do fabricante.

A.6 – Caldo nutriente D

Extrato de carne.................................................................................................................3,0 g

Peptona..............................................................................................................................5,0 g

Água destilada..............................................................................................................1000 mL

Agitar a mistura até completa dissolução. Distribuir em porções de 10 mL em tubos 25 mm x 150 mm ou similar. Autoclavar durante 15 minutos a 121ºC. pH final: 6,8 ± 0,2 a 25º C.

Nota: Para o preparo a partir do meio desidratado, obeceder a recomendação do fabricante.

A.7 – Agar nutriente D

Extrato de carne.................................................................................................................3,0 g

Peptona..............................................................................................................................5,0 g

Ágar..................................................................................................................................15,0 g

Água destilada..............................................................................................................1000 mL

Aquecer até a fervura para completa dissolução. Distribuir em porções de 20 mL em tubos 20 mm x 200 mm ou similar. Autoclavar durante 15 minutos a 121ºC. Distribuir cada uma das porções em placas de Petri estéreis. pH final: 6,8 ± 0,2 a 25º C.

Nota: Para o preparo a partir do meio desidratado, obeceder a recomendação do fabricante.

/ANEXO A – Cont.

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ANEXO A – Cont.

DL-treonina........................................................................................................................0,5 g

DL-valina..........................................................................................................................1,00 g

L-leucina.............................................................................................................................0,8 g

DL-isoleucina....................................................................................................................0,44 g

Glicina..............................................................................................................................0,06 g

DL-serina..........................................................................................................................0,61 g

DL-alanina .......................................................................................................................0,43 g

L-ác.glutâmico. HCl............................................................................................................1,3 g

L-ác.aspártico...................................................................................................................0,45 g

DL-fenilalanina.................................................................................................................0,26 g

DL-triptofano.....................................................................................................................0,05 g

L-prolina............................ ..............................................................................................0,05 g

Água destilada (contendo 18 mL de NaOH 1N).............................................................500 mL

Solução B

Cloreto de sódio...............................................................................................................3,00 g

Cloreto de potássio............................................................................................................0,2 g

Sulfato de magnésio heptahidratado ................................................................................0,1 g

Fosfato monobásico de potássio ......................................................................................1,5 g

Fosfato dibásico de sódio ...............................................................................................4,00 g

Tiamina.HCl.....................................................................................................................0,01 g

/ANEXO A – Cont.

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TÍTULO: MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO

NÚMERO

REVISÃO PÁGINA 17 / 20

ANEXO A – Cont.

Niacinamida .....................................................................................................................0,01 g

Água destilada................................................................................................................500 mL

Misturar as soluções A e B. Dispensar em porções de 10 mL em tubos 25 mm x 150 mm e autoclavar durante 20 minutos a 121º C. pH final : 7,1 ± 0,1 a 25º C.

Antes do uso para transferências diárias das culturas teste, adicionar assepticamente 0,1mL de uma solução de glicose a 10% estéril.

Nota: Para o preparo a partir do meio desidratado, obedecer a recomendação do fabricante.

A.10 – Meio tioglicolato fluido (segundo USP XXIII)

L -cistina....................................................... .....................................................................0,5 g

Ágar..................................................................................................................................0,75 g

Cloreto de sódio ................................................................................................................2,5 g

Glicose.H 2 O ......................................................................................................................5,5 g

Extrato de levedura ............................................. .............................................................5,0 g

Digesto pancreático de caseína ......................................................................................15,0 g

Água destilada .............................................................................................................1000 mL

Aquecer a mistura em banho de água até a dissolução e adicionar 0,5 g de tioglicolato de sódio ou 0,3 mL de ácido tioglicólico. Ajustar o pH a 7,1 ± 0,2 com NaOH 1N.

Se necessário, reaquecer sem ferver e filtrar em papel de filtro. Adicionar 1 mL de uma solução a 0,1% de resazurina de sódio recém preparada. Distribuir em porções de 10 mL em tubos 25 mm x 150 mm. Autoclavar durante 20 minutos a 121º C. Resfriar imediatamente a 25 º C e estocar a 20 - 30º C ao abrigo da luz. pH final: 7,1 ± 0,2 a 25º C.

/ANEXO A – Cont.

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ANEXO B

SOLUÇÕES

B.1 – Solução de fenol a 5% ( peso / volume ) estoque

Fenol ..................................................................................................................................50 g

Água destilada q.s.p.....................................................................................................1000 mL

Padronizar com solução 0,1N de KBr - KBr03 do seguinte modo (ou utilizar método

espectrofotométrico ou método por cromatografia líquida):

Transferir 25 mL da solução para um balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água destilada. Transferir 15 mL desta solução para um erlenmeyer de 500 mL com tampa esmerilhada e adicionar 30 mL de uma solução padrão 0,1N de KBr - KBr 03 e 5 mL

de HCl, fechando em seguida. Agitar por 30 minutos e deixar em repouso 15 minutos.

Retirar a tampa rapidamente o suficiente para adicionar 5 mL de uma solução de iodeto de potássio a 20%, com o cuidado de não deixar escapar os vapores de bromo, fechando imediatamente o frasco. Agitar bem, retirar a tampa e rinsar a mesma e o colo do frasco com pouca água destilada, de modo que a água de lavagem escoe para dentro do frasco. Titular com solução 0,1N de Na2 S2 03 usando amido como indicador.

1mL de solução de KBr - KBr 03 0,1N = 0,001569 g de fenol

% de fenol da solução estoque = ( 30 - a ) x 0,001569 x 1333 x 100 / 1000

Onde: a = mililitros da solução de Na2 S2 03 0,1 N gastos na titulação

30 = mililitros da solução de KBr - KBr 0 3 0,1 N adicionados 0,001569 = g de fenol equivalente a 1mL de solução de KBr-KBr0 3 0,1N 1333 = fator de diluição 1000 = volume original da solução de fenol estoque

Se necessário ajustar a solução estoque a 5,00 ± 0,05% de fenol adicionando fenol ou água.

Guardar em frasco âmbar, bem fechado, em lugar fresco e ao abrigo da luz.

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ANEXO B – Cont.

B.2 – Solução de brometo-bromato de potássio 0,1N

KBr03................................................................................................................................ 2,8 g

KBr ..................................................................................................................................12,0 g

Água destilada fervida q.s.p.......................................................................................1000 mL

Dissolver os reagentes em água destilada fervida e completar o volume para 1000 mL com água destilada fervida.

Padronização:

Transferir 30 mL da solução acima para um frasco de iodo.

Adicionar 25 mL de água destilada, 5 mL de solução de KI a 20% e 5 mL de HCl. Agitar e titular com solução 0,1N de Na2 S2 03, usando amido como indicador.

B.3 – Solução de amido indicadora:

Misturar aproximadamente 2,0 g de amido de batata em pó fino com água fria para formar uma pasta. Adicionar aproximadamente 200 mL de água fervente com agitação constante, e de imediato cessar o aquecimento. Adicionar em torno de 1,0 mL de mercúrio.

B.4 – Solução de cloreto de alquil dimetil benzil amônio (C14 – 50%; C12 – 40%; C16 – 10%) a 500 ppm

A partir do cloreto de alquil dimetil benzil amônio (C14 – 50%; C12 – 40%; C16 – 10%) concentrado adquirido, pesar a quantidade necessária para fornecer uma solução com a concentração de 500 ppm. Preparar a solução utilizando vidraria e água destilada estéreis.