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O objetivo desta prática foi avaliar o solvente extrator empregado na obtenção da enzima peroxidase a partir da batata.
Tipologia: Trabalhos
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Laura Fagundes - 132493 Maria Cardoso - 132498
Disciplina: Bioquímica de Alimentos I Professor: Jaqueline Garda Buffon
Rio Grande 2021
O objetivo desta prática foi avaliar o solvente extrator empregado na obtenção da enzima peroxidase a partir da batata.
As peroxidases (PO; EC 1.11.1.7.) englobam um grupo de oxidorredutases encontradas no reino vegetal, em tecidos animais, leucócitos e no leite. Essa enzima está relacionada a alterações deteriorativas no sabor e odor de vegetais estocados, além de ser muito utilizada como índice de branqueamento em tratamentos térmicos, pois apresenta resistência à inativação térmica. A peroxidase apresenta também a capacidade de atuação em condições adversas de temperatura, podendo agir mesmo em temperaturas abaixo de zero, e em umidades muito baixas. Portanto, a PO é relevante nutricionalmente e na mudança da coloração de frutas e vegetais (SANTOS, 2001).
2.1. Extração enzimática
A composição da solução extratora e o tipo de tecido a ser utilizado devem ser avaliados para que se obtenha o máximo de atividade enzimática no extrato. A etapa de extração das enzimas, utilizando soluções denominadas de extratoras, é uma das mais importantes, visto que o uso de métodos inadequados compromete os passos subsequentes.
A primeira solução extratora utilizada foi a solução de cloreto de sódio 0,5%, a adição de uma solução salina de baixa concentração acarreta em um aumento da força iônica do sistema. Consequentemente, as cargas da dissociação do cloreto de sódio interagem com as moléculas proteicas, diminuindo a interação proteína-proteína, levando a um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso, fenômeno conhecido como salting in (PARAÍBA, 2017).
A segunda solução extratora empregada foi a solução tampão fosfato 100 mM de pH 6,0, que contribui para o processo de extração devido à presença do sal fosfato, acarretando no salting in. A água destilada foi a terceira solução extratora utilizada, sendo considerada pelo seu baixo custo.
equação (3). A concentração por mL de extrato e por grama de batata foi obtida, respectivamente, por meio das equações (4) e (5).
Onde x é a concentração de proteína por 5,5 mL de solução.
Onde x é a concentração de proteína por mL de extrato enzimático, Vt é o volume total do tubo (5,5 mL) e Fd é o fator de diluição (25).
Onde a massa de amostra inicial corresponde a 5 gramas.
Através da tabela 1, é possível observar os resultados obtidos para o ensaio em branco realizado, já a partir da tabela 2, observa-se a concentração da proteína solúvel nas amostras.
Tabela 1 - Resultados do ensaio em branco para proteína solúvel
Branco (ABS) Média branco (ABS)
Tabela 2 – Resultado das concentrações de proteína solúvel
Experimento Solução extratora
Proteína (ABS)
Proteína
- ABS corrigida
Concentração de proteína mg/5,5 mL tubo de ensaio
mg/mL de extrato
mg/g de batata
1a (^) Solução salina
1b 0,2687 0,18965 0,835717 114,911 22, 1c 0,2713 0,20125 0,846655 116,415 23, 2a Tampão fosfato
2b 0,1866 0,11655 0,490324 67,4195 13, 2c 0,1921 0,12205 0,513462 70,6011 14, 3a Água destilada
3b 0,3001 0,23005 0,967817 133,075 26, 3c 0,2897 0,21965 0,924064 127,059 25,
A partir dos valores calculados, nota-se que a água destilada apresentou maior extração de proteínas, em média de 126,52 mg/mL. Sendo assim, pode-se atribuir ao fato de que esse extrator solvata uma gama muito grande de proteínas hidrossolúveis.
2.3. Atividade da enzima peroxidase
A atividade específica é o número de unidades de enzima por miligrama de proteína, servindo para medir a pureza da enzima (BRASIL, 2003). A terminologia da velocidade na qual a enzima catalisa uma reação foi padronizada, sendo representada por uma unidade internacional (U) é definida como a atividade que causa a conversão de 1 μmol de substrato por minuto, sob condições geralmente otimizadas. (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA,
Para a medida da atividade enzimática da peroxidase, cada extrato, das três soluções extratoras diferentes, foi diluído 100 vezes em um balão volumétrico, e 1 mL desta diluição foi transferido para um tubo de ensaio, em triplicata, onde foram adicionados 1,5 mL de solução tampão fosfato 100 mM de pH 6,0, 2 mL de água destilada, 0,5 mL do substrato guaiacol 1% e 1 mL de peróxido de hidrogênio a 0,08%. Para catálise da reação, tal mistura
Na tabela 3 estão apresentados os resultados obtidos a partir do ensaio em branco, e na tabela 4 observa-se os resultados da determinação de atividade enzimática.
Tabela 3 - Resultados do ensaio em branco para atividade enzimática da peroxidase
Branco (ABS) Média branco (ABS)
Tabela 4 – Resultados de atividade enzimática da peroxidase
Experimento
Solução extratora
Atividade (ABS)
Atividade
- ABS corrigida
Atividade enzimática U/mL U/g de batata
U/mg de proteína 1a (^) Solução salina
1b 0,4589 0,402555 0,302673 605,346 26, 1c 0,4278 0,371455 0,279289 558,579 23, 2a Tampão fosfato
2b 0,5036 0,447255 0,336282 672,564 49, 2c 0,5214 0,456055 0,342898 685,797 48, 3a Água destilada
3b 0,3568 0,300455 0,225906 451,812 16, 3c 0,3147 0,258355 0,194252 388,504 15,
A solução extratora que apresentou maior valor de atividade da enzima peroxidase em relação às outras foi a solução tampão fosfato, resultando em média 48,4779 U/mg. Isso provavelmente se dá pelo fato de que a solução garante que a extração ocorra na faixa de pH ótimo de atividade da peroxidase, além de fornecer íons que contribuem para a solubilização da proteína em questão através do fenômeno de salting in.
Em suma, a solução extratora tampão fosfato 100 mM pH 6,0 apresentou melhores resultados, visto que sua composição e propriedade química favoreceram a atividade enzimática da peroxidase. No entanto, a água destilada, visto que é o solvente universal, apresentou resultados superiores na extração de proteína em relação às demais soluções extratoras.
PARAÍBA. Juliana. Laboratório Didático de Bioquímica - Centro de Ciências Exatas e da Natureza. Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica).
SANTOS, Elen Resende. Caracterização Bioquímica da Peroxidase e da Polifenoloxidase de Açaí (Euterpe o/eracea). 2001. 104 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Engenharia de Alimentos, Ciência de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2001. Disponível em: http://repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/254326/1/Santos_ElenResende_M.pdf. Acesso em: 22 abr. 2021.
