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Pesquisa
PCR em tempo real
Uma Inovação tecnológica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Caroline Monteiro Novais Estudante do curso de farmácia do Centro Universitário de Barra Mansa. E-mail: carol_farmacia@hotmail.com
Melissa Pires-Alves Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Professora do Centro Universitário de Barra Mansa. E-mail: melalves@ig.com.br
Colaborador Fábio Freitas Silva
Introdução
advento da biologia molecular foi certamente um dos maiores passos das ciências biológicas durante o Século XX. A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trou- xe enormes benefícios e desenvolvi- mentos científicos como o seqüenciamento de genomas, a ex- pressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas. Ultimamente, uma inovação tecnológica resultante da PCR, deno- minada de PCR em Tempo Real, vem ganhando espaço nos diagnósticos clí- nicos e nos laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. Essa técnica permite o acompanhamento da rea- ção e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, em rela- ção à PCR que apresenta somente resultados qualitativos.
PCR
A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction), é uma metodologia que pode ser executada inteiramente in vitro sem o uso de células (BRUCE, 1999). A técnica da PCR foi desenvol- vida nos anos 80 por Kary Mullis, que recebeu, em 1994, o prêmio Nobel. A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA-polimerase, a mesma que parti- cipa da replicação do material genéti- co nas células. Esta enzima sintetiza
uma seqüência complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em inglês) já esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese. Os iniciadores definem a seqüência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma deter- minada seqüência DNA com bilhões de cópias (MULLIS, 1990).
Utilização da técnica da PCR
O desenvolvimento da técnica de amplificação de segmentos de DNA utilizando a PCR abriu enormes pers- pectivas para a análise de genes, diag- nóstico de doenças genéticas e detecção de agentes infecciosos como citomegalovírus, vírus da hepatite B e C, herpes vírus simples, vírus da rubé- ola, vírus da imunodeficiência humana (HIV), Chlamydia trachomatis, Helicobater pylori, Mycobacterium tuberculosis e Pneumocistis carinii. O avanço da ciência sobre a com- preensão dos genes trouxe para a rotina do laboratório de genética, fer- ramentas que permitem o diagnóstico em nível molecular. Na linha das doen- ças genéticas, o permanente desen- volvimento de novos protocolos tem permitido a pesquisa de pequenas alterações na seqüência de DNA, como, por exemplo, na fibrose cística. Outras aplicações especialmente úteis para a PCR é a clonagem de um determinado fragmento de DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cDNA) obtido a partir da molécula de RNA, o que permite o estudo da expressão de genes. Finalmente, a PCR tem um gran-
de potencial na medicina forense. Sua sensibilidade torna possível utilizar uma amostra bastante pequena (traços mí- nimos de sangue e tecidos que pode- riam conter os restos de somente uma única célula) e ainda se obter uma “impressão digital de DNA” da pessoa da qual a amostra foi coletada, poden- do assim fazer comparações com aque- les obtidos de vítimas e/ou suspeitos de casos de infração penal (SILVA & PASSOS, 2002). O genoma de cada ser humano (exceto dos gêmeos idênticos) é dife- rente nas regiões polimórficas, sendo possível amplificar essas regiões. As- sim, a pesquisa de STRs (Small Tan- dem Repeats) através da PCR, utilizan- do um conjunto de iniciadores que cobrem estas partes altamente variá- veis do genoma humano, pode gerar uma impressão digital característica de DNA para cada indivíduo (BRUCE, 1999).
PCR em Tempo Real
A possibilidade de monitorar a PCR em tempo real revolucionou o processo de quantificação de frag- mentos de DNA e RNA. A PCR em tempo real realiza a quantificação des- tes ácidos nucléicos de maneira preci- sa e com maior reprodutibilidade, por- que determina valores durante a fase exponencial da reação. O ponto que
detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denomi- nado de Cycle Threshold (CT) (Figura 1). Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência. A emissão dos compostos fluo- rescentes gera um sinal que aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Sendo assim, os valo- res da fluorescência são gravados du- rante cada ciclo e representam a quan- tidade de produto amplificado (http:/ /www.ncifcrf.gov/rtp/gel/rtqpcr/ WhatIs.asp, 2004). Os compostos flu- orescentes mais utilizados são o SYBR® Green e TaqMan®. A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que con- tém um termociclador com sistema ótico para a excitação da fluorescência e na coleção da emissão e um compu- tador com um software para aquisição de dados e análise final da reação. Estas máquinas, disponíveis de diver- sos fabricantes, diferem na capacidade da amostra (96-poços padrão, processamento de poucas amostras ou requerem tubos capilares de vidro especializados), no método da excita- ção (lasers ou fontes claras do espec- tro largo com filtros ajustáveis), e na sensibilidade total. Há também dife- renças nos softwares para o processamento dos dados (http:// www.ambion.com/techlib/tn/81/
813.html, 2004).
Fluoróforos
Os fluoróforos são moléculas que absorvem e emitem luz em um com- primento de onda específico. Os siste- mas de detecção da PCR em Tempo Real utilizam estas moléculas que pro- porcionam o acompanhamento da re- ação ao longo dos ciclos.
SYBR® Green
O SYBR® Green se liga entre a fita dupla de DNA (Figura 2) e com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador, emite uma fluorescência verde. As vantagens da utilização do SYBR® Green são: baixo custo, facilidade no uso e sensibilida- de. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita dupla que surge durante a reação, incluindo os dímeros dos iniciadores e outros produtos inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento alvo. O SYBR® Green não ligado ao DNA exibe uma fluorescência muito pe- quena. Entretanto, a fluorescência é realçada quando ligado na fita dupla do DNA. No começo da amplificação, a mistura da reação contém o DNA desnaturado, os iniciadores e o SYBR® Green. As moléculas não-ligadas do SYBR® Green apresentam fluorescência fraca produzindo um si- nal mínimo sendo este subtraído du- rante a análise de computador. Após o reconhecimento dos iniciadores, algu- mas moléculas do SYBR® Green po- dem ligar-se na fita dupla previamen- te formada. Durante a polimerização catalisada pela enzima Taq DNA polimerase, as moléculas do SYBR® Green vão se ligando ao DNA recen- temente sintetizado. Assim, a reação é
Figura 1: Curva de amplificação do PCR em Tempo Real. CT – Cycle Threshold. A amplificação mostra 3 fases distintas (1) linha basal: não houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescência; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais aumento no número de produtos.
Figura 2: Molécula de SYBR Green® entre a fita dupla de DNA.
Na ausência de alvos, o oligonucleotídeo não emite fluorescência, pois o quencher está próximo do fluoróforo captando ener- gia. No momento em que o molecular beacon encontra o seu alvo, ocorre a hibridização resultando em uma reor- ganização conformacional, onde o fluoróforo de dissocia do quencher, emitindo assim a fluorescência. Os molecular beacons podem ser sintetizados com diferentes cores de fluoróforos, possibilitando ensaios que necessitam detectar diferentes alvos em uma mesma reação. São altamente específicos permitindo dis- criminar seqüências-alvo que diferem entre si por apenas um nucleotídeo substituído. São sondas ideais, no en- saio diagnóstico para identificação ge- nética, detecção de SNP (single nucleotide polymorfism) e aplicações farmacogenéticas (KRAMER, 2004).
Utilização da PCR em
Tempo Real
O sistema de quantificação em tempo real tem as seguintes aplica- ções: · Identificação de alelos em DNA genômico; · Análise de seqüências virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes; · Análise de patógenos em ali- mentos; · Análise de produtos transgênicos; A aplicação em diagnósticos, como a detecção de patógenos, ou doenças, torna-se interessante uma vez que esta técnica permite a quantificação e
rapidez do resultado, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese, necessário na análise da PCR.
Conclusão
As técnicas associadas à biologia molecular e à engenharia genética progrediram muito desde a década de 50, quando o DNA teve sua estrutura descrita. O avanço foi tão grande que em pouco tempo, pouco mais de 50 anos, suas aplicações práticas já permeiam o nosso cotidiano. A descoberta da PCR faz parte desse progresso, sendo que o mais novo avanço tecnológico partiu da própria PCR, gerando a PCR em Tem- po Real, que permite a quantificação das amostras amplificadas, sendo de grande relevância para diagnósticos de patógenos e doenças genéticas. Dentre as vantagens, esta técnica em relação à PCR qualitativa estão a faci- lidade na quantificação, maior sensibi- lidade, maior precisão, reprodutibilidade e acurácia, velocida- de na análise, melhor controle de qua- lidade no processo e menor risco de contaminação.
Referências bibliográficas
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Figura 5: (A) Oligonucleotídeo usado como sonda é sintetizado de modo a possibilitar a formação de uma estrutura secundária nas extremidades 5’e 3’. (B) Toda fita nova formada durante a amplificação é alvo para o anelamento do molecular beacon, aumentando a intensidade da fluorescência.
A (^) B
