APLICAÇÃO CLÍNICA** Avaliação da fertilidade masculina e controle da Vasectomia. 4. PRINCÍPIO DO TESTE Análise Macroscópica e Microscopia ótica 5. AMOSTRA 5.1 Condições exigidas para análise a) Pacientes devidamente registrados pelo laboratório. As seguintes informações devem ser registradas no formulário: nome, data de nascimento e número de código pessoal, medicamentos de uso contínuo e o período de abstinência. b) O paciente deve receber instruções claras, orais ou escritas, sobre a coleta da amostra de sêmen. Deve ser enfatizado que a amostra de sêmen precisa estar completa e que qualquer perda de qualquer fração da amostra deve ser relatada. c) Só serão aceitas amostras:

Coletadas no laboratório por masturbação após um mínimo de 2 dias e um máximo de 7 dias de abstinência sexual.
Devidamente identificadas com o nome completo do paciente, número de registo do laboratório, data e hora da coleta.
Coletadas em frasco de boca larga estéril fornecida pelo laboratório.
Completas, qualquer perda de qualquer fração da amostra deve ser relatada.
Entregue para análise em até 60 minutos após a coleta.
Sem o uso de qualquer tipo de lubrificante (inclusive saliva) e preservativos para a realização da coleta. 5.2 Instruções de coleta

Urinar antes da coleta;
Lavar as mãos e o pênis com sabão, para reduzir o risco de contaminação da amostra com organismos comensais da pele;
Enxaguar o sabão;
Secar as mãos e o pênis com uma toalha descartável;
Abrir o frasco tirando a tampa, a colocando virada para cima. Procure não tocar dentro do frasco ou da tampa para evitar contaminações;
A coleta deve ser por masturbação sem o uso de lubrificantes, até mesmo saliva e água ou camisinha;
Ejacular no frasco estéril fornecido evitando qualquer perda da amostra;
Ao terminar tampe bem o frasco; 5.3 Manipulação segura de amostras As amostras de sêmen podem conter agentes infecciosos perigosos, portanto, devem ser tratadas como um risco biológico. Para o processamento das amostras materiais e técnicas estéreis devem ser usadas e boas práticas de laboratório são fundamentais para a segurança laboratorial (OMS, 2004). 6. REAGENTES E MATERIAIS Fita reativa; Solução salina para diluição; Corante eosina; Reagente de Leishman; Tubos de ensaio e estantes; Pipetas, ponteiras e peras; Câmara de Neubauer ou, também chamada de câmara do hemocitômetro; Lâminas e lamínulas; Microscópio; Frascos de vidro ou acrílico; 7. PROCEDIMENTO/TÉCNICA 7.1 Análise macroscópica (coagulação, liquefação, viscosidade, cor, aspecto, volume e pH) Ao receber a amostra avaliar imediatamente a presença de coágulos; Depois da observação da presença ou não do coágulo, manter o frasco à temperatura ambiente, para que ocorra a liquefação; Avaliar o tempo para liquefação; Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, aspirar suavemente a amostra permitindo que o sêmen caia pela gravidade e observando o comprimento de qualquer fio; Avaliar a cor e o aspecto da amostra;

mesma seção da grade. Com experiência, pode ser possível pontuar todas as três categorias de movimento de espermatozoides de uma vez só e marcar as maiores áreas da grade. VITALIDADE Misturar bem a amostra de sêmen. Remover uma alíquota de 50 μl de sêmen e misturar com um volume igual de suspensão de eosina-nigrosina, por ex. em uma placa de porcelana ou tubo de ensaio, e aguardar 30 segundos. Misturar novamente a amostra de sêmen antes de remover uma alíquota replicada, misturar com eosina- nigrosina e tratar como na etapa acima. Para cada suspensão, fazer um esfregaço em uma lâmina de vidro (consulte a Seção 2.13.2) e deixar secar ao ar. Examinar imediatamente após a secagem ou posteriormente após a montagem com um meio de montagem não aquoso permanente. Examinar cada lâmina com óptica de campo claro com ampliação × 1000 e imersão em óleo. Registrar o número de células coradas (mortas) ou não coradas (vitais) com o auxílio de um contador de laboratório. Avaliar 200 espermatozoides em cada réplica, a fim de obter um erro de amostragem aceitavelmente baixo. Calcular a média e a diferença das duas porcentagens de células vitais das lâminas replicadas. Determinar a aceitabilidade das diferenças aceitáveis entre duas percentagens para uma média dada, determinadas a partir de contagens replicadas de 200 espermatozoides. Se a diferença entre as porcentagens for aceitável, relatar a porcentagem média de espermatozoides vitais. Se a diferença for muito alta, fazer duas novas preparações a partir de duas alíquotas frescas da amostra de sêmen e repetir a avaliação. Relatar a porcentagem média de espermatozoides vitais para o número inteiro mais próximo. Os espermatozoides vivos têm cabeça branca ou rosa claro e os espermatozoides mortos têm as cabeças manchadas de vermelho ou rosa escuro. CONTAGEM DE ESPERMATOZOIDES Examinar uma preparação bem misturada e não diluída de sêmen liquefeito em uma lâmina de vidro sob uma lamela, para determinar a diluição apropriada e as câmaras apropriadas a serem usadas; Misturar o sêmen e preparar diluições com fixador. Carregar a câmara do hemocitômetro e deixar os espermatozoides assentarem em uma câmara úmida. Avaliar as amostras dentro de 10 a 15 minutos (após o qual a evaporação tem efeitos perceptíveis na posição dos espermatozoides dentro da câmara). Contar pelo menos 200 espermatozoides por replicado. Comparar as contagens replicadas para ver se estão bem próximas. Se assim for, proceder com os cálculos; se não, preparar novas diluições. Calcular a concentração em espermatozoides por ml. Calcular o número total de espermatozoides por ejaculação.

A concentração de espermatozoides no sêmen é o seu número (N) dividido pelo volume em que foram encontrados, ou seja, o volume do número total (n) de linhas examinadas para as réplicas (20 nl cada para as grades 4, 5 e 6), multiplicado pelo fator de diluição. Ou seja, C = (N/n) × (1/20) × fator de diluição. O número total de espermatozoides por ejaculado é obtido pela multiplicação da concentração de espermatozoides pelo volume de todo o ejaculado. MORFOLOGIA ESPERMÁTICA Preparar o esfregaço de sêmen em uma lâmina; Secar ao ar, fixar e corar a lâmina. Montar a lâmina com uma lamínula, se a lâmina for mantida por um longo período de tempo; Examinar a lâmina com óptica de campo claro na ampliação × 1000 com imersão em óleo; Avaliar cerca de 200 espermatozoides por repetição para uma percentagem de formas normais ou de formas normais e anormais. Comparar os valores da réplica para ver se eles estão razoavelmente próximos: em caso afirmativo, prosseguir com os cálculos; se não, reler as lâminas. AVALIAÇÃO DE LEUCÓCITOS NO SÊMEN Tradicionalmente, os leucócitos no sêmen humano são contados após um procedimento histoquímico que identifica a enzima peroxidase, que é característica dos granulócitos. Misturar bem a amostra de sêmen. Remover uma alíquota de 0,1 ml de sêmen e misturar com 0,9 ml de solução de trabalho (diluição 1 + 9 (1: 10)). Agitar a suspensão de esperma (em um agitador vórtex) por 10 segundos e incubar à temperatura ambiente por 20-30 minutos. Alternativamente, agitar continuamente com um sistema de balanço de tubos. Misturar novamente a amostra de sêmen antes de remover uma alíquota replicada e misturar com a solução de trabalho como acima. Após 20 a 30 minutos, misturar as suspensões de esperma novamente e preencher cada lado de um hemocitômetro com uma das preparações replicadas. Armazenar o hemocitômetro horizontalmente por pelo menos 4 minutos à temperatura ambiente em uma câmara úmida (por exemplo, em papel de filtro saturado com água em uma placa de Petri coberta) para evitar ressecamento e permitir que as células se estabeleçam. Examinar a câmara com óptica de contraste de fase com ampliação de × 200 ou × 400. Contar pelo menos 200 células positivas para peroxidase em cada réplica, a fim de alcançar um erro de amostragem aceitavelmente baixo. As células positivas para peroxidase serão coradas de marrom, enquanto as células negativas para peroxidase não serão coradas. Examinar uma câmara, grade por grade, e continuar contando até que pelo menos 200 células positivas para peroxidase tenham sido observados e uma grade completa tenha sido examinada. A contagem deve ser feita por grades completas; não pare no meio de uma grade.

Viscosidade..............................................: 2,0 cm de altura Liquefação................................................: Completa Tempo de liquefação................................: Menor que 30 minutos Aspecto após a liquefação.......................: Homogênio PH............................................................: Maior ou igual a 7, EXAME MICROSCÓPICO Leucócitos................................................: Até 1.000/mm³ Hemácias.................................................: Até 1.000/mm³ N° de espermatozoides............................: Acima de 15 milhões N° de espermatozoides ejaculados...........: Acima de 39 milhões Morfologia Formas normais.......................................: Maior ou igual a 4,0% MOTILIDADE Total (móveis)..........................................: Maior ou igual a 40,0% Progressiva (grau “a”+ “b”)......................: Maior ou igual a 32,0% Não progressiva (grau “c”).......................: Imóveis (grau “d”)....................................: VITALIDADE (60 Minutos) Vivos........................................................: Acima de 58% Mortos.....................................................:

10. BIBLIOGRAFIA https://sbra.com.br/wp-content/uploads/2018/09/Ebook-Reprodu%C3%A7%C3%A3o-Assistida.pdf https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/44261/9789241547789-por.pdf?ua= file:///C:/Users/Ferre_000/Downloads/POPs_Do_Espermograma.pdf file:///C:/Users/Ferre_000/Downloads/00003037_ESPERMOGRAMA%20(1).pdf