Relação da polimerase em cadeia - PCR, Notas de estudo de Ciências Biologicas

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REAÇÃO DA POLIMERASE

REAÇÃO DA POLIMERASE

EM CADEIA - PCR

EM CADEIA - PCR

Polymerase Chain Reaction

O QUE É PCR?

O QUE É PCR?

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É uma metodologia que se baseia na

É uma metodologia que se baseia na

amplificação exponencial seletiva de uma

amplificação exponencial seletiva de uma

quantidade reduzida de DNA de uma

quantidade reduzida de DNA de uma

única célula, sem o uso de um organismo

única célula, sem o uso de um organismo

vivo.

vivo.

PARA QUE SERVE A PCR?

PARA QUE SERVE A PCR?



Diagnóstico médico;

Diagnóstico médico;

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Mapeamento genético;

Mapeamento genético;



Detecção de doenças hereditárias;

Detecção de doenças hereditárias;



Clonagem de genes;

Clonagem de genes;



Testes de paternidade;

Testes de paternidade;

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Criação de organismos transgênicos;

Criação de organismos transgênicos;

PARA QUE SERVE A PCR?

PARA QUE SERVE A PCR?



Medicina Forense:

Medicina Forense:

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pequenas amostras de DNA retiradas da

pequenas amostras de DNA retiradas da

cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas

cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas

de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até

de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até

mesmo a minúscula quantidade de DNA

mesmo a minúscula quantidade de DNA

deixada em uma impressão digital) são

deixada em uma impressão digital) são

amplificadas para serem analisadas pelo

amplificadas para serem analisadas pelo

método de

método de

fingerprinting

fingerprinting

.

PROCEDIMENTOS:

PROCEDIMENTOS:



Após a extração do DNA, adiciona-se uma

Após a extração do DNA, adiciona-se uma

mistura (conhecida como pré-mix) que

mistura (conhecida como pré-mix) que

contém:

contém:

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dNTPs

dNTPs

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Primers

Primers (ou iniciadores)

(ou iniciadores)



Solução Tampão.

Solução Tampão.

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Enzima Taq DNA polimerase

Enzima Taq DNA polimerase

Taq DNA polimerase

Taq DNA polimerase



A

A

Taq DNA polimerase

Taq DNA polimerase , também denominada

, também denominada

Taq polimerase

Taq polimerase ou apenas

ou apenas Taq

Taq , é uma DNA

, é uma DNA

polimerase termoestável, utilizada na

polimerase termoestável, utilizada na

amplificação de fragmentos de DNA através da

amplificação de fragmentos de DNA através da

técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido

técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido

identificada pela primeira vez na bactéria

identificada pela primeira vez na bactéria

Thermus aquaticus

Thermus aquaticus , encontrada em fontes

, encontrada em fontes

hidrotermais. A Taq polimerase suporta as

hidrotermais. A Taq polimerase suporta as

elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo

elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo

uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a

uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a

94ºC).

94ºC).

TERMOCICLADOR

TERMOCICLADOR

PROCEDIMENTOS

PROCEDIMENTOS



O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre

O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre

em três fases:

em três fases:



Fase de Desnaturação (94-96ºC)

Fase de Desnaturação (94-96ºC)



Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)

Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)



Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)

Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)

Fase de hibridização ou

Fase de hibridização ou

anelamento

anelamento



a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC

a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC

dependendo da quantidade de C e G

dependendo da quantidade de C e G

encontrada no primer, para que os primers

encontrada no primer, para que os primers

se anelem (pareiem) com a fita molde de

se anelem (pareiem) com a fita molde de

DNA (anelamento).

DNA (anelamento).

Fase de Extensão do DNA

Fase de Extensão do DNA



a temperatura é elevada a 72ºC para que

a temperatura é elevada a 72ºC para que

a enzima taq-polimerase possa funcionar

a enzima taq-polimerase possa funcionar

sintetizando a nova molécula (extensão),

sintetizando a nova molécula (extensão),

em seguida um novo ciclo é iniciado.

em seguida um novo ciclo é iniciado.

RESULTADOS

RESULTADOS

Nº de Ciclos

Nº de Ciclos Nº de Cópias

Nº de Cópias

RESULTADOS

RESULTADOS



O resultado é analisado através de uma

O resultado é analisado através de uma

eletroforese em gel de agarose ou de

eletroforese em gel de agarose ou de

poliacrilamida e depois é interpretado com

poliacrilamida e depois é interpretado com

a ajuda de um profissional competente.

a ajuda de um profissional competente.

LIMITAÇÕES

LIMITAÇÕES

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Necessidade de conhecer a sequência de

Necessidade de conhecer a sequência de

DNA a amplificar para sintetizar

DNA a amplificar para sintetizar

primers

primers

específicos.

específicos.



Relativa facilidade com que ocorre a

Relativa facilidade com que ocorre a

contaminação por DNA estranho.

contaminação por DNA estranho.



Limitada extensão da sequência.

Limitada extensão da sequência.



Incorporação errônea de bases durante a

Incorporação errônea de bases durante a

replicação.

replicação.

VARIAÇÕES DA TÉCNICA

VARIAÇÕES DA TÉCNICA

BÁSICA DE PCR

BÁSICA DE PCR

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Nested PCR

Nested PCR



Hot Start

Hot Start

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Real time PCR

Real time PCR

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RAPD-PCR

RAPD-PCR

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Entre outras...

Entre outras...