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lu IFRJ – Campus Maracanã Coordenadoria de Biotecnologia Disciplina: Técnicas de Análises Bioquímicas Turma: BM Professores: Hiram Araújo e Leila Pontes
Relatório de Técnicas de Análises
Bioquímicas
Cromatografia de Gel Filtração
Avaliação: Critério: Nota: Apresentação Introdução Objetivos Material Utilizado/ Métodos Resultados Discussão Conclusão Referências Bibliográficas Total: Alunos: Alexandre G. Garcez Arthur de Lima Bruno Oliveira Rio de Janeiro, 10 de junho de 2011. Sumário
Introdução Pág.: 3
Objetivos Pág.: 3; 4
Material Utilizado e Métodos Pág.: 4; 5
Resultados Discussões
Pág.: 6; 7; 8
Conclusão Pág.: 8
Referências Bibliográficas Pág.: 9
- Introdução
A cromatografia liquida de gel filtração é um importante método para realizarmos purificação e análise de macromoléculas, podendo determinar a massa molecular e a forma
▪ Balança ▪ Espátula ▪ Bastão de vidro ▪ 3x Béquer 50mL ▪ Eppendorf ▪ 2x Pipeta Pasteur ▪ 2x Pêra para Pipeta Pasteur ▪ Pipeta graduada de 1mL ▪ Propipete ▪ Suporte universal ▪ Garra ▪ Algodão ▪ Coluna de Cromatografia ▪ 13x Tubo de ensaio ▪ 2x Proveta de 10mL ▪ Proveta de 1000mL ▪ 13x Cubetas para espectrofotômetro ▪ Espectrofotômetro Spectronic ® Genesys 5 ▪ Pisete com Água destilada ▪ Papel para limpeza da cubeta e secagem das provetas ▪ Sephadex G- ▪ Vermelho de Fenol ▪ Azul de Dextran 5mg/mL ▪ Azida Sódica 0, 001% ▪ PBS 5x, pH=7,
Pesou-se 1g de Sephadex G-50 em um béquer de 50 mL, para o preparo de uma de
aproximadamente 10mL. Reidratou-se a Sephadex G-50 em um béquer com aproximadamente 15 mL de PBS, seguindo-se as instruções do fabricante. Anteriormente o PBS havia sido diluído 5x a partir de um volume inicial de 200mL. Posteriormente, preparou-se a coluna colocando-se um pequeno chumaço de algodão hidrofílico na sua extremidade inferior. Para proceder a cromatografia fixou-se a coluna verticalmente em um suporte universal. Posteriormente preparou-se a cama, depositando continuamente a resina (Sephadex) no interior da coluna. Empacotou-se a coluna por cerca de 2 horas. É importante que a coluna não seque. Preparou-se para carregar a amostra na coluna. Esperou-se até que a extremidade do menisco do tampão toque a superfície da resina, fechou-se a torneira e carregou-se a coluna, bem próximo à cama, com uma mistura de 200μL de Vermelho de Fenol e 200μL de Azul de Dextran. Após, abriu-se a torneira da coluna e esperou-se até que a amostra penetrasse na resina completamente. Aplicou-se aos poucos a fase móvel ate a penetração total da amostra. Após, mantevesse um fluxo contínuo da fase móvel até o final da eluição. Imediatamente após a aplicação da amostra na coluna, iniciou-se a coleta das frações em provetas de 10 mL. Colheu-se 13 alíquotas de 2 mL e transferiu-se para 13 tubos de ensaio devidamente rotulados. Repetiu-se a operação ate que não se observasse mais vestígio dos corantes e a cada rodada as provetas eram rinsadas com água destilada. Lavou-se a coluna com água destilada. Posteriormente, desempacotou-se a coluna e o conteúdo foi guardado em um frasco com azida sódica 0, 001% na geladeira, utilizando-se luvas no manuseio, devido a toxicidade da azida sódica. As frações recolhidas devem ser lidas no espectrofotômetro em 2 comprimentos de onda : 620nm e 560nm.
- Resultados
A leitura no espectrofotômetro nos dois comprimentos de onda indicou os seguintes valores: Tubo Abs (560nm) Abs (620nm) 1 0,006 0, 2 0,012 0,
filtração, por conta da diferença acentuada entre suas massas moleculares. Desta forma, qualquer amostra de massa desconhecida, mas que seja intermediária a esses dois valores, pode ter a massa descoberta através do seu pico de absorbância quando verificado na curva de calibração. Embora a precisão seja menor, neste caso a curva de calibração pode ser extrapolada para valores maiores ou menores que as massas moleculares dos padrões, e descobertas com uma proximidade considerável do valor real.
Ao avaliar a eficiência da cromatografia realizada notamos que a base dos picos no gráfico são bastante largas, o que indica que uma mesma substância teve tempos de retenção distintos para suas moléculas, o pico de absorbância de cada substância indica o momento em que temos uma concentração mais elevada dela, porém os valores pouco acima ou pouco abaixo deste pico correspondem a concentrações menores que eluiram em tempos maiores e menores, respectivamente. Uma resolução maior acontece quando quase toda a substância sai ao mesmo tempo do cromatograma, e com uma distancia considerável do pico da outra substância, de forma que eles não sofram sobreposição, ou seja, que tenham sido separados satisfatoriamente.
Na nossa cromatografia pode-se notar que há uma pequena sobreposição entre os picos, quando as substâncias se encontram em concentrações mais baixas, sendo que o ideal seria que cada pico pudesse chegar ao ponto em que a absorbância é 0, para que o outro inicie. É possível dizer que esta sobreposição indica uma má separação das amostras naquela faixa, pois um possível ruído provocado pela fase móvel, caso ela seja um pouco sensível nesses comprimentos de onda, foi eliminado com a utilização do branco na leitura ao espectrofotômetro. O ideal seria sua insensibilidade completa aos comprimentos de onda em que a avaliação dos resultados ocorre, porém esta condição nem sempre é possível em um ensaio.
Ambos os problemas, tanto dos tempos de retenção variados quanto da separação ineficiente em algumas faixas do cromatograma podem ser resolvidas com o aumento do número de pratos teóricos ou a diminuição do tamanho dos poros. Conforme o número de pratos teóricos aumenta, ou o tamanho dos poros
diminui, há um maior número de “obstáculos” para substâncias que possuam uma massa molecular pequena, enquanto que para substâncias com uma massa molecular maior elas ficariam menos tempo retidas e conseqüentemente sairiam rapidamente e ao mesmo tempo.
- Conclusão
Foi possível discutir a respeito dos resultados da prática, quanto a eficiência do ensaio entre outros fatores. Desta forma, mesmo que a eficiência de separação não tenha sido ideal, o objetivo da prática pode ser alcançado. Com a realização dos gráficos foi possível entender o comportamento das amostras durante o processo de eluição, permitindo também uma possível predição quanto o comportamento de amostras de massas moleculares desconhecidas caso sofressem o mesmo ensaio e tratamento das amostras descritas neste relatório.
- Referências Bibliográficas
Literatura:
- SKOOG, D. A. ; et al. Fundamentos de Química Analítica – 8.ed.- São Paulo :
