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Os resultados de uma análise de cinética de expressão e secreção de moléculas em linfócitos t cd4+ e cd8+ de indivíduos não infectados e pacientes com formas clínicas indeterminada e chagas cardiaca por t. Cruzi. O estudo inclui a análise de cinéticas de produção de pge2 e secreção de citocinas il-2, il-10 e ifnγ em culturas de cmsp, além da expressão de moléculas cd28, cd25 e ctla-4 em linfócitos t cd4+ e cd8+ em presença de rpmi ou epi. As figuras ilustram as cinéticas de produção de pge2 e secreção de citocinas em diferentes tempos.
Tipologia: Notas de estudo
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Não perca as partes importantes!
Vladimir Martins Pinheiro
Belo Horizonte
2007
Respostas Imunes Primária e Secundária de Células Mononucleares do Sangue
Periférico, in vitro, de Indivíduos Não Infectados e de Pacientes com Doença de Chagas, estimuladas com Antígenos de
Trypanosoma cruzi.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde (área de concentração em Infectologia e Medicina Tropical).
ORIENTADOR: Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha
CO-ORIENTADORES: Dra. Maria José Ferreira Morato
Dr. Rodrigo Corrêa-Oliveira
Belo Horizonte
2007
Reitor Ronaldo Tadeu Pena
Pró-Reitor de Pós-Graduação Jaime Arturo Ramirez
Pró-Reitor de Pesquisa Carlos Alberto Pereira Tavares
Diretor Prof. Francisco José Penna
Chefe do Departamento de clínica médica Prof. Dirceu Bartolomeu Greco
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE: INFECTOLOGIA E MEDICNA TROPICAL.
Coordenador Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha
Sub-Coordenador Prof. Antônio Lúcio Teixeira Junior
Colegiado Prof. Antônio Luiz Pinho Ribeiro Prof. Carlos Maurício Figueiredo Antunes Prof. José Roberto Lambertucci Fátima Lúcia Guedes Silva (Representante Discente)
Este trabalho foi realizado no Ambulatório de doença de
Chagas do Centro de Referência em Doenças Infecciosas e
Parasitária Orestes Diniz – CTR-DIP do Hospital das Clínicas,
Belo Horizonte, Minas Gerais em colaboração com o
Laboratório de Imunologia Celular e Molecular do Centro de
Pesquisas René Rachou da Fundação Oswaldo Cruz –
CPqRR/FIOCRUZ.
Auxílios financeiros:
Conselho de Aperfeiçoamento de Ensino Superior – CAPES;
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq e Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de Minas Gerais – FAPEMIG.
AGRADECIMENTOS
Ao Germano, (laboratório de morfologia - ICB/UFMG) pelas sugestões.
A Clari Gandra pela atenção e carinho.
A equipe de apoio técnico do LICM – CPqRR, Daniela Peralva, Lorena Júnia, pelo auxílio durante os experimentos e em especial à Ana Beatriz (Tiza) pelo auxilio no citômetro de fluxo e à Luciana Lisboa, pelo auxílio durante a execução do CBA. E aos demais membros do LICM – CPqRR: Dr. Alexandre Reis, Ana Pacheco, Andréia Rizzia, Anne Jardim, Denise Lemos, Diana Bahia, Eliane, Guilherme, Dr. Jeffrey Bethonny, Paula, Pedro, Renata Diniz, Roberta Prado, Rodolfo Guiunchetti, Simone Mansur,
A equipe do Centro de Pós-graduação da Faculdade de Medicina - UFMG, em especial à Egler, Hélen, Marcos e Renata. E aos colegas da pós-graduação.
Ao Dr. Olindo e a equipe do laboratório de doença de Chagas - CPqRR/FIOCRUZ, pelo auxilio no cultivo do EPI.
As pessoas que muitas vezes me emprestaram seus ouvidos: Ana Carolina Campi, Dra. Ana Cristina Botelho, Dra. Andréia Teixeira, Haroldo Dutra, Luanda Liboreiro, Luciana Maria, Luciana Pinto, Poliana.
Aos meus familiares e amigos os quais compreenderam minha ausência.
As instituições: Faculdade de Medicina da UFMG (Programa de Pós Graduação: Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical) Centro de Pesquisas René Rachou - FIOCRUZ (Laboratório de Imunologia Celular e Molecular).
As agências financiadoras: CAPES, CNPq, FAPEMIG.
Com intuito de homenagear meus professores/orientadores Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha, Dra. Maria José Ferreira Morato e Dr. Rodrigo Corrêa-Oliveira, os quais se tornam eternos em mim, cito Rubem Alves;
“Ensinar é um exercício de imortalidade. De alguma forma continuamos a viver naqueles cujos olhos aprenderam a ver o mundo pela magia da nossa palavra. O professor, assim, não morre (...)”.
Agradeço a Deus por ter colocado todas estas pessoas em meu caminho.
AGRADECIMENTOS
Dedico este trabalho a minha família que nos momentos de cansaço me motivaram. Minha mãe Cacilda Louro Pinheiro, meu pai (in memorian ) Milton Martins Pinheiro Filho, meu sobrinho-afilhado Lucas Louro, e as minhas irmãs Cristina e Izabela.
Dedico também a minha noiva Flávia que, como uma grande companheira soube compreender minha ausência, além de, me oferecer colo quando precisei. Lindíssima, muito obrigado por todos os momentos.
SUMÁRIO
Sumário
LISTA DE ABREVIATURAS I
LISTA DE FIGURAS III
LISTA DE TABELAS V
RESUMO VI
ABSTRAT VIII
1 – INTRODUÇÃO 1
1.1 – Caracterização das formas clínicas IND e CARD da doença de Chagas 4
1.2 – Aspectos imunes da doença de Chagas. 7
1.2.1 – Mediadores envolvidos da doença de Chagas 8
1.2.2 – Expressão de moléculas acessórias em Linfócitos T ativados 10
2 – OBJETIVOS 13
2.1 – Objetivo geral. 13
2.2 – Objetivos específicos. 13
3 – POPULAÇÃO ESTUDADA. 14
3.1 – Caracterização da população estudada 14
3.1.1 – Critérios de inclusão 14
3.1.2 – Critérios de exclusão 15
3.1.3 – Grupos de estudo 16
4 – MATERIAIS E MÉTODOS. 17
4.1 – Obtenção do homogenato antigênico derivado das formas epimastigotas (EPI) do Trypanosoma cruzi
4.2 – Obtenção de células mononucleares do sangue periférico 17
4.3 – Cultura de células mononucleares do sangue periférico 18
4.4 – Avaliação da cinética de expressão das moléculas acessórias na superfície dos linfócitos T
4.5 – Obtenção de sobrenadante de culturas para identificação das citocinas 22
4.5.1 – Quantificação dos níveis de citocinas secretadas no sobrenadante 22
SUMÁRIO
4.6 – Quantificação dos níveis de prostaglandinas E 2 (PGE 2 ) secretadas, no sobrenadante, durante as culturas das células.
4.7 – Análise estatística dos dados 26
5 – RESULTADOS 27
5.1 – Cinética da produção de prostaglandina-E2 (PGE 2 ) por PBMC de indivíduos do grupo NI e pacientes dos grupos IND e CARD.
5.2 – Cinética da secreção das citocinas IL-2, IL-10 e IFNγ por PBMC de indivíduos do grupo NI.
5.2.1 – Cinética de expressão das moléculas CD28, CD25 e CTLA-4 em linfócitos T CD4+^ e em linfócitos T CD8+^ de indivíduos do grupo NI_._
5.3 – Cinética da secreção das citocinas IL-2, IL-10 e IFNγ por PBMC de pacientes do grupo IND.
5.3.1 – Cinética de expressão das moléculas CD28, CD25 e CTLA-4 em linfócitos T CD4+^ e em linfócitos T CD8+^ de pacientes do grupo IND
5.4 – Cinética da secreção das citocinas IL-2, IL-10 e IFNγ por PBMC de pacientes do grupo CARD.
5.4.1 – Cinética de expressão das moléculas CD28, CD25 e CTLA-4 em linfócitos T CD4+^ e em linfócitos T CD8+^ de pacientes do grupo CARD_._
5.5 – Moléculas produzidas na ausência de estímulo (RPMI) ou na presença de EPI
5.5.1 – Produção de PGE 2 na presença e ausência de estímulo antigênico. 44
5.5.2 – Produção de Citocinas IL-2, IL-10 e IFN na presença e ausência de estímulo antigênico.
5.6 – IMF da expressão dos fenótipos CD28, CD25 e CTLA-4 em LTCD4+ e LTCD8+.
5.7 – Análise dos dados entre os grupos NI, IND e CARD. 57
5.7.1 – IMF das moléculas CD28, CD25 e CTLA-4 em LT CD4+ ou LT CD8+. 57
5.7.2 – Produção de PGE 2 e secreção das citocinas IL-2, IL-10 e IFNγ. 62
6 – DISCUSSÃO. 65
7 – CONCLUSÃO. 71
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 72
9 – ANEXO. 85
LISTA DE ABREVIATURAS
I
Lista de Abreviaturas
APC Células Apresentadoras de Antígenos
CAMs Moléculas de Adesão celular
CARD Forma crônica Cardíaca grau V
Célula NK Célula Natural Killer
CMblast Meio de cultura celular modificado
CMSP Células Mononucleares do Sangue Periférico
CTLA-4 Antígeno Intracelular-4 Associado ao Linfócito Citotóxico
DIG Forma crônica Digestiva
ECG Eletrocardiograma
EP (1, 2, 3, 4) Receptores de membrana da prostaglandina E
EPI Homogenato antigênico da forma epimastigota do Trypanosoma cruzi.
FACS Separador de Células por Fluorescência ativada
FITC Isoticianato de fluoresceína
FL 1 Fluorescência do tipo 1
FL 2 Fluorescência do tipo 2
FL 3 Fluorescência do tipo 3
FoxP3 Fator de Transcrição P
FSC Tamanho
HLA Antígeno Leucocitário Humano
IA Imunidade Adaptativa
IFNγ Interferon gama
II Imunidade Inata
IL- Interleucinas
IMF Intensidade Média de Fluorescência
IND Forma crônica Indeterminada
LB Linfócito B
LT Linfócito T
LTreg Linfócito T Regulador
MEM Meio de Cultura Essencial
MFF Solução fixadora: Max FACS Fix.
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade
NI Indivíduo Não - Infectado
LISTA DE ABREVIATURAS
II
PBS Solução Salina
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PE Ficoeritrina
PerCP Proteína Clorofílica Peridinina
PFR Proteína Paraflagelar do Trypanosoma cruzi
PG Prostaglandina
PGE 2 Prostaglandina E 2
RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro
RPMI Meio de Cultura Celular - 1640
SI Sistema Imune
SSS Granulosidade
STAT-5 Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição tipo 5
TCR Receptor de Célula T
TGFβ Fator de Crescimento de Fibroblastos
Th1 Células CD4+^ produtoras de citocinas do tipo Th
Th2 Células CD4+^ produtoras de citocinas do tipo Th
TNFα Fator de Necrose Tumoral alfa
LISTA DE FIGURAS
IV
presença de RPMI ou EPI, de pacientes com a forma clínica CARD nos diferentes tempos de cultura (0, 2, 6, 12 e 24 horas).
FIGURA 10 - Análise das cinéticas da expressão das moléculas CD28, CD25 e CTLA-4 na superfície de linfócitos T CD8+^ obtidas de CMSP, na presença de RPMI ou EPI, de pacientes com a forma clínica CARD nos diferentes tempos de cultura (0, 2, 6, 12 e 24 horas).
FIGURA 11 - Análise da secreção de PGE 2 nos sobrenadantes das culturas de CMSP, na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 12 - Análise da secreção de IL-2 nos sobrenadantes das culturas de CMSP, na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 13 - Análise da secreção de IL-10 nos sobrenadantes das culturas de CMSP, na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 14 - Análise da secreção de IFNγ nos sobrenadantes das culturas de CMSP, na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 15 - Análise da IMF da molécula CD28 em LTCD4+^ na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 16 - Análise da IMF da molécula CD25 em LTCD4+^ na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 17 - Análise da IMF da molécula CTLA-4 em LTCD4+^ na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 18 - Análise da IMF da molécula CD28 em LTCD8+^ na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 19 - Análise da IMF da molécula CD25 em LTCD8+^ na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
FIGURA 20 - Análise da IMF da molécula CTLA-4 em LTCD8+^ na presença de RPMI ou EPI, nos diferentes tempos (2, 6, 12 e 24 horas) de cada indivíduo/paciente.
LISTA DE TABELAS
V
Tabela 1 - Classificação clínica da cardiopatia chagásica crônica de acordo com os critérios de Belo horizonte.
Tabela 2 - Anticorpos utilizados. 20
Tabela 3 - Combinação de anticorpos e estímulos antigênicos 20
Tabela 4 - Análise dos dados entre os grupos NI, IND e CARD: Expressão da molécula CD28 na superfície de linfócitos T CD4+^ ou CD8+.
Tabela 5 - Análise dos dados entre os grupos NI, IND e CARD: Expressão da molécula CTLA-4 na superfície de linfócitos T CD4+^ ou T CD8+.
Tabela 6 - Análise dos dados entre os grupos NI, IND e CARD: Expressão da molécula CD25 na superfície de linfócitos T CD4+^ ou CD8+.
Tabela 7 - Análise dos dados entre os grupos NI, IND e CARD: Produção de PGE 2 e secreção de IL-2 em sobrenadante de cultura de CMSP.
Tabela 8 - Análise dos dados entre os grupos NI, IND e CARD: Secreção de IL-10 e IFNγ em sobrenadante de cultura de CMSP.
RESUMO
VII
também capaz de promover a manutenção da homeostasia nos organismos isentos
de memória imunológica específica.
Palavras chave: homeostasia, imunorregulação doença de Chagas, Trypanosoma
cruzi ,
ABSTRACT
VIII
Abstract
The immune system (IS) as others has physiological functions that works toward the
maintenance of homeostasis. During the acute phase of the infection by Trypanosoma
cruzi, the IS functions intensively to eliminate the parasites that are able to leave the
peripheral blood becoming predominantly intracellular favoring, therefore, the its
maintenance and the development of the chronic phase of the disease. The objective
of this work was to evaluate the ability of the IS of NI or individuals with Chagas
disease to react in vitro to T. cruzi antigens. This was evaluated by the analysis of the
expression or secretion of molecules involved on the process of activation or
regulation of the response induced by the stimuli. Peripheral blood mononuclear cells
of the individuals included in this study were fractionated and evaluated before and
after in vitro culture. Cells and supernatants from these cultures were collected at time
zero (before antigenic stimulation) and at 2, 6 and 24 hours after antigenic stimulation
for analysis of CD25, CD28 e CTLA-4 expression on the surface of T CD4+^ and CD8+
cells as well as the levels of prostaglandins E 2 and the cytokines IL-2, IL-10 and IFNγ.
The results show that T. cruzi antigens stimulate PBMC from NI to secrete IL-10 and
PGE 2 besides the induction of higher fluorescence intensity of CD25 in CD4+^ cells. IL-
10 is detectable early in cell cultures of IND patients and remains high for the time
period of the study, while IFNγ was detected only at 12 h, in contrast with PBMC from
CARD where IL-2, IL-10 and IFNγ where detectable at all time points. In stimulated
cultures, the mean fluorescence intensity of CTLA-4 was high in CD4+^ T cells from the
IND group while in the CARD group the antigenic stimuli induced higher CD25 mean
fluorescence intensity in CD4+^ and in CD8+^ cells. Admitting the possibility that
regulation induced by the stimuli in the IND is mediated by IL-10 and expression of
CTLA-4, impairing the second cell activation signal, the absence of early secretion of
this cytokine by cells from CARD may be one of the major factors related to the lack of
immuno regulatory activity in these patients,. Furthermore, the secretion of regulatory
molecules IL-10 and PGE 2 by cells from NI individuals favors our interpretation that
the IS also induces homeostasis in situations where immune response memory is not
specific.
Key words: homeostasis, imunoregulation, Chagas disease, Trypanosoma cruzi.
