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Teste de Esterilidade
Introdução
O primeiro método oficializado do teste de esterilidade foi na Inglaterra em 1932, mediante utilização do caldo peptonado e incubação a 37ºC durante 5 dias, com vistas à detecção de bactérias aeróbicas.
A melhoria do teste visa verificar com mais segurança a qualidade do processo esterilizante, empregado durante a fabricação de medicamentos estéreis, bem como manipulação asséptica, levando-se em consideração respectivamente o aspecto probabilístico de esterilização e o risca da recontaminação.
Condição de trabalho
A área para execução do teste muitas vezes é do tipo convencional, com antecâmara, consiste de compartimento pequeno, de fácil limpeza e desinfecção. É provida de sistema de alimentação de ar filtrado no teto, com pressão positiva, podendo ter lâmpadas germicidas.
Estas salas devem ser periodicamente limpas e desinfetadas por métodos comprovadamente eficazes, de modo a obter condições ideais para a execução do teste.
Regra geral efetua-se a exposição de placas de Petri contendo nutrientes em ambiente asséptico, embora o resultado apresente pouca informação sobre a verdadeira contaminação viável. Outra possibilidade será a filtração direta do ar.
Na sala para execução de trabalhos assépticos, a contaminação microbiana não deve ser superior a 15 partículas viáveis por metro cúbico de ar.
Para avaliação do nível de contaminação de superfícies recorre-se, normalmente, a esfregaços com cotonetes ou swabs, que posteriormente são lavados com solução fisiológica e este líquido é submetido a contagem.
O chão da sala contendo este módulo deve ser limpo semanalmente e as paredes, mensalmente.
O operador é outro fator a ser considerado como fonte de contaminação, o treinamento é de importância fundamental. O estado de saúde e higiene influenciam a qualidade dos locais de trabalho e consequentemente a segurança do ensaio propriamente dito.
Amostragem
A retirada de amostras a serem submetidas ao teste deve estar relacionada com a fase de processamento, visto que este ensaio complementa as informações sobre a perfeita execução de cada processo operacional esterilizante e/ou manipulação asséptica do produto.
A segurança do teste será tanto maior quanto maior for a quantidade de amostras ensaiadas, comprovados como eficazes. Em se tratando de matéria-prima, cada embalagem deve ser submetida à amostragem.
A Farmacopéia Européia conceitua lote como sendo coleção homogênea de frascos ou unidades preparadas de tal maneira que o risco de contaminação é o mesmo para cada um destes itens.
O que ocorre na prática consiste em retirar 20 a 40 unidades para cada lote, dependendo do volume total de cada frasco ou ampola. É pequena a vantagem em testar amostras maiores que 20 unidades.
Preparo da amostra
A execução em produtos farmacêuticos deve ser precedida de preparação das amostras, de maneira a evitar resultados falsos.
Consiste em efetuar um tratamento, visando a desinfecção da superfície externa da embalagem pelo uso de soluções anti-sépticas voláteis ou não.
As unidades assim preparadas devem permanecer em ambiente apropriado, devendo ser violadas no momento da inoculação aos meios de cultura ou da dissolução ou diluição nos líquidos diluentes.
Esta fase de preparação das amostras requer cuidados de identificação.
Método de Inoculação
Qualquer que seja a forma de inoculação da amostra, entretando, é fundamental que se avalie e comprove a sua não interferência ocasionando falso-negativo.
Inoculação direta
Consiste na inoculação de quantidades ou volumes pré-estabelecidos da amostra em volumes estipulados de diversos meios de cultura, na forma líquida ou mediante semeadura da amostra em nutriente sólido. Todas as farmacopeias indicam alíquotas a serem transferidas para o meio de cultura, a partir de cada unidade integrante da amostra representativa do lote.
Em 1927 já se dava ênfase para necessidade de 7 dias para incubação a 37ºC. No decorrer das revisões farmacopeias houve mudanças, passando a se adotar período de 7, 10 e 14 dias de incubação.
Opção alternativa seria delegar ao fabricante o estabelecimento do período de incubação.
Interpretação
O resultado do teste, desde a época de sua oficialização, foi fundamentado em observação macroscópica do crescimento microbiano, manifestado sob a forma de turvação do meio líquido ou aparecimento de colônia no meio sólido.
A interpretação do teste em 1932 permanece quase que inalterada. A decisão da FDA é que se um tubo apresentar contaminação deve-se proceder o reteste, usando 40 unidades. Se acusar algum crescimento deve-se efetuar o segundo reteste, sendo que para aprovação do lote não deve haver crescimento nos tubos de reteste. Tanto no primeiro como no segundo retestes, se não houver crescimento, o lote será aprovado como estéril.
Controle de eficiência de esterilização
O emprego de indicadores físicos, químicos e biológicos são citados como recurso do controle do processo esterilizante. Indicadores físicos baseiam-se em temperatura de fusão dos mesmos, com alteração de cor, quando a autoclave ou forno atinge uma determinada temperatura.
Os indicadores mais aconselhados são os biológicos. Estes são esporos de cepas de micro-organismos devidamente selecionados quanto à resistência ao processo esterilizante. Devem ser espécies menos susceptíveis a um determinado processo, seja físico ou químico.
A ausência de crescimento é indicação de que o processo foi eficiente sobre os os micro-organimos. Permite-se, então, afirmar que houve eficiência esterilizante. A eficiência pode ser medida de três maneiras: pelo histórico do processo, pelos estudos de inativação de uma séries de micro-organismos e pelo uso de indicadores biológicos.
A utilização de indicadores biológicos deve ser criteriosa, inoculando-se o próprio produto com os mesmo, de modo a assemelhar-se ao máximo à condição em que se encontra o contaminante natural frente ao processo. A utilização de monitores biológicos permite excluir dúvidas sobre o teste falso-positivo, pois, a negatividade do controle inoculado, sem manifestação de crescimento, elimina totalmente a questão.
A estabilidade dos indicadores pode ser muito variável, razão pela qual se aconselha a preparação das suspensões dos esporos no próprio laboratório.
Validação do teste de esterilidade
Deve ser estabelecida e documentada, demonstrando as características de exatidão, sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade.
Qualificação da instalação
A qualificação da instalação conduz a necessidade de certificação da área onde se executam os testes, incluindo os filtros, capelas de fluxo laminar e utilidades disponíveis e empregadas durante o procedimento.
Qualificação operacional
Inclui a qualificação do operador, do equipamento e dispositivo de teste. A qualificação do operador impõe que o mesmo seja experiente e receba o tratamento para o trabalho específico.
Esterilidade dos meios de cultura, fluídos e dispositivos auxiliares
Devem ter sua esterilidade comprovada, de forma a conferir segurança quanto à ausência de falso-positivo.
Para os meios de cultura deve-se ter o controle da procedência e lote de fabricação, e obediência aos parâmetros do processo esterilizante.
Equipamentos e dispositivos auxiliares deverão ser avaliados e empregando meios de cultura comprovadamente estéreis.
Capacidade promotora de crescimento dos meios de cultura
Farmacopeias atuais orientam que seja avaliada a capacidade promotora de crescimento. Micro-organismos adicionais podem ser também adotados, quando detectados de forma típica nos produtos ou no ambiente produtivo.
Bateriostase e Fungistase
Certos produtos contém agentes bacteriostáticos ou fungistáticos que, se não forem neutralizados, irão inibir o crescimento dos micro-organimos viáveis presentes no produto, conduzindo a resultados falso-negativos.
STAPERT, E. M. Designing and monitoring a stereality test facility. Bull. Parenter – Drug. Assoc. Philadelphia, v.26, p. 129, 1972.
UNITED States Pharmacopoeia. 25 ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2675 p., 2002.
